Методическая статья

Количественная оценка респираторный взрыв ответ как показатель врожденной иммунной здравоохранения в данио рерио

DOI:

10.3791/50667

⸱

12 сентября 2013 г.

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Врожденная иммунная реакция защищает организмы от патогенной инфекции. Одним из важнейших компонентов врожденного иммунного ответа, респираторный взрыв фагоцитов, генерирует активные формы кислорода, которые убивают вторгшиеся микроорганизмы. Мы описываем респираторный взрыв анализа, который количественно активные формы кислорода, произведенные при врожденной иммунной реакции химически индуцированных.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Респираторный взрыв фагоцитов является частью врожденного иммунного ответа к патогенной инфекции и включает в себя производство активных форм кислорода (АФК). АФК являются токсичными и функционировать убить фагоцитируются микроорганизмы. В естественных условиях количественное фагоцитов полученных АФК предоставляет информацию о способности организма поддержать активную врожденную иммунную реакцию. Здесь мы опишем протокол для количественной и сравнить ROS в целых эмбрионов данио на химической индукции дыхательного взрыва фагоцитов. Этот метод использует не-флуоресцентным соединением, которое становится люминесцентные от окисления АФК. Отдельные данио эмбрионов пипеткой в ​​лунки микропланшета и инкубировали в этом флюорогенного субстрата с или без химического индуктора дыхательного взрыва. Флуоресценции в каждой лунке количественно в нужных точках времени с помощью микропланшет-ридера. Показания флуоресценции корректируются для устранения фоновой флуоресценции, а затем совместноmpared помощью непарного т-тест. Этот метод позволяет для сравнения респираторный взрыв потенциала эмбрионов данио рерио на разных стадиях развития и в ответ на экспериментальных манипуляций, таких как белка нокдаун, избыточная экспрессия или лечения фармакологических агентов. Этот метод также может быть использован для мониторинга ответа респираторный взрыв в целых расчлененный почек или клеточных препаратов из почек взрослых данио и некоторых других видов рыб. Мы считаем, что относительная простота и технологичность этого протокола будет дополнять существующие протоколы и будет представлять интерес для исследователей, которые стремятся лучше понять врожденную иммунную реакцию.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммунная система состоит из двух ветвей: врожденного и адаптивного иммунитета. Врожденный иммунитет является эволюционно более древняя, чем адаптивного иммунитета. Беспозвоночные в настоящее время полагают, только врожденный иммунитет, тогда как позвоночные обладают как врожденные и адаптивные ветви. В то время как адаптивный иммунитет дает конкретные и длительный иммунитет к определенным патогенов, врожденный иммунитет является непосредственным ответом на вторжение бактерий, вирусов и грибков. Одним из важнейших аспектов врожденного иммунного ответа связан с высвобождением цитокинов и хемокинов, что приводит к воспалению и найма фагоцитов (например макрофаги, нейтрофилы), чтобы поглотить и уничтожить иноземных захватчиков.

Успешные врожденные иммунные реакции включают: (1) признание вторжения микроорганизмов; (2) индукция соответствующих сигнальных каскадов (например высвобождение цитокинов и хемокинов); (3) надлежащее развитие / необходимого числа фагоцитов; (4) Миграция фагоцитов в местах инфекции; (5) охвате патогенов, и (6) уничтожение охвативших микроорганизмов. Дефицит в любом из этих шагов может привести к хосту быть раздавленными, а поддавшись, инфекции. Надежная врожденного иммунного ответа является жизненно важным для здоровья организмов, потому что это первая линия обороны против патогенов во всех растений и животных. У позвоночных, он также усиливает адаптивный иммунный ответ 1. Поэтому очень важно, чтобы мы в состоянии оценить все аспекты врожденного иммунного ответа, с тем, чтобы лучше понять его и оптимизации его функции.

Многие модельные организмы используются для изучения врожденного иммунитета, начиная от Arabadopsis к С. Элеганс в дрозофилы до мышей к культуре клеток человека. Преимущество использования данио (Danio рерио) модель системы для изучения врожденного иммунитета является то, что данио является позвоночным, как с врожденного и адаптивного имсообщества, но развитие врожденного и адаптивного иммунитета временно отделены. Данио рерио полагаться исключительно на врожденного иммунитета для защиты от инфекций, пока адаптивный иммунитет не станет полностью функциональной, которое происходит вокруг 4-6 недель после оплодотворения 2. Кроме инструментов для генетических манипуляций, оптической прозрачности и быстрого, внешнего развития, врожденный иммунитет как принцип режиме обороны у эмбрионов рыбок данио обеспечивает упрощенную модель, в которой для изучения сложности врожденного иммунного ответа в естественных условиях.

Несколько протоколы были разработаны для оценки различных аспектов врожденного иммунного ответа у эмбрионов рыбок данио. Microarrays и RNAseq быть подтверждено, что цитокин профили вызываемые данио врожденного иммунного ответа аналогичны у людей и также показали участие неожиданных генов в врожденного иммунитета 3,4. Прозрачность эмбрионов рыбок данио и люминесцентные, трансгеннойштаммы ИЦ патогенов и рыбок данио позволяют для визуализации динамических взаимодействий хозяин-патоген в естественных условиях в режиме реального времени. Трансгенные эмбрионы рыбок данио, выражающие GFP под контролем нейтрофилов конкретных миелопероксидазы промоутер 5,6 или макрофагов конкретных mpeg1 промоутер 7 сделали возможным визуализировать и количественно фагоцитов миграцию к местам локализованных инфекций 8, а также визуализировать фагоцитоз и разрушение флуоресцентно меченных патогены 8,9. Эмбрионы рыбок данио также поддаются генерации высокой пропускной анализов и химических экранов. Соответственно, недавно были разработаны методы высокой пропускной из транскриптома анализа при инфекции 10 и фагоцитов миграции к местам химически индуцированного повреждения 11.

Из методов, перечисленных выше, ни один количественно не оценить заключительный этап уничтожения возбудителя фагоцитами. Это заключительный этапвключает в себя респираторный взрыв (то есть производства АФК и других токсичных соединений), убивающих охвативших патогенов. Фермент НАДФН оксидазы является основным источником АФК в фагоцитирующих клеток. Ассамблея субъединиц НАДФН энзима приводит к переносу электронов к кислороду, генерации супероксид-анионы. Через последующих ферментативных реакций, супероксид затем могут быть преобразованы в перекиси водорода и хлорноватистой кислоты (фигура 1А). Это респираторный взрыв фагоцитов, который убивает болезнетворные микроорганизмы и, таким образом, количественное определение респираторный взрыв потенциала эмбрионов данио рерио является показателем общей врожденной иммунной здоровья. Мы разработали флуоресценции основе анализа для количественной оценки респираторный взрыв в группах отдельных эмбрионов рыбок данио 12. Этот анализ использует не-флуоресцентный, восстановленную форму коммерчески доступной, проникающий в клетку краситель. Этот краситель, 2 ',7-диацетат dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA), преобразуется в флуоресценциицент соединение, 2 ',7-дихлорфлуоресцеина (DCF), при окислении. Различные ROS, генерируемые дыхательного взрыва фагоцитов может окислять H2DCFDA и генерировать флуоресценции 24. Появление флуоресценции могут быть использованы для количественного определения и сравнить ответ респираторный взрыв между группами данио. Протеинкиназы С ацетат агонист форбол-миристат (PMA) используется для химически индуцировать НАДФН-оксидазы, чтобы произвести ROS и тем самым увеличить показания флуоресценции (рис. 1b). При этом мы предоставляем подробный протокол модифицированной и оптимизированной версии этого данио эмбрионов респираторный взрыв анализа. Этот анализ может быть использован для сравнения респираторный взрыв между группами отдельных эмбрионов данио рерио с течением времени и / или в ответ на экспериментальных манипуляций (например, морфолино-опосредованного белком нокдаун). Использование этого метода, в сочетании с другими данио врожденных анализов иммунитета, обеспечит более полное представление о сложной и критическойврожденного иммунного ответа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Данио рерио Уход и техническое обслуживание

  1. Животноводство: Масса икру взрослых данио, как описано выше 13. Сбор порожденные эмбрионов, как описано выше 14.
  2. Микроинъекция (при желании): Microinject 1-4 клеточной стадии эмбрионов данио с морфолино-олигонуклеотидов в нокдаун генных продуктов или мРНК для сверхэкспрессии генных продуктов, как описано выше 15.
    1. Для обеспечения надлежащей пул макет вводят управления (по крайней мере 48 проживает, макет вводят рыбы управления и 48 жизнь, экспериментально манипулировать рыбы необходимы, чтобы заполнить также планшет 96).
  3. Поддержание эмбрионов: Grow эмбрионов в глубоких чашках Петри при 28 ° С в яичном воде (60 мкг / мл мгновенных Ocean морской соли в не дистиллированная вода-в автоклаве) до желаемой стадии развития (ответ респираторный взрыв не обнаруживается с использованием этого протокола в эмбрионов данио рерио в возрасте до 2 дней после оплодотворения 12). Примечание: Это было оbserved, что предотвращение пигментации эмбрионов данио рерио либо через использование 1-фенил-2 тиомочевины (PTU) или golden/slc24a5 мутанта данио существенно не изменяет индукцию флуоресценции PMA (неопубликованные данные, эмбрионов испытаны на 48, 72 и 96 HPF).
    1. Удалить мертвых эмбрионов ежедневно с пластиковой пипетки.
    2. Тщательно слейте старую яйцо воду и пополняться новой яйца воды ежедневно.
  4. Dechorionate эмбрионы: В день эксперимента, dechorionate эмбрионы (если эмбрионы все еще ​​находятся на хорионов), как описано выше, используя два тонких щипцов 14 (это респираторный взрыв анализ также может быть выполнена на расчлененных почек от взрослых данио 12 и подробных протоколов для почек рассечение от взрослых данио были ранее описаны 16,17).

2. Подготовка решения

  1. Подготовка исходного раствора H2DCFDA: Взвесить 1 мг H2DCFDA.
    1. Диssolve 1 мг H2DCFDA в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО), чтобы сделать 1 мг / мл маточного раствора.
    2. Сделать 22 мкл аликвоты этого раствора в 1,7 мл микропробирок.
    3. Оберните аликвоты H2DCFDA маточного раствора в алюминиевую фольгу и держать в темноте, когда это возможно, потому что H2DCFDA является светочувствительным.
    4. Магазин H2DCFDA аликвоты при -20 ° С в течение до 3 месяцев.
  2. ВНИМАНИЕ - Подготовка исходного раствора форболмиристатацетата (PMA): Взвесить 1 мг PMA используя соответствующие средства индивидуальной защиты (т.е. перчатки, очки и маску).
    1. Растворить PMA в 1 мл ДМСО, чтобы сделать 1 мг / мл маточного раствора.
    2. Сделать 11 мкл аликвоты в 1,7 мл микропробирок.
    3. Храните аликвоты PMA маточного раствора при температуре -80 ° С в течение до 3 месяцев.
  3. Подготовьте рабочего раствора H2DCFDA: В день эксперимента, сделать рабочий раствор H2DCFDA, добавив 1 часть H2DCFDA маточного раствора до 1часть ДМСО (500 мкг / мл H2DCFDA конечная концентрация). Например, можно добавить 20 мкл исходного раствора H2DCFDA и 20 мкл ДМСО для фольги обернуты 1,7 мл микроцентрифужную пробирку.
  4. Подготовить рабочий раствор PMA: В день эксперимента сделать рабочий раствор PMA добавлением 1 часть PMA маточного раствора до 49 частей нуклеазному свободную воду (20 мкг / мл РМА конечная концентрация). Например, разбавить 10 мкл PMA исходного раствора в 490 мкл нуклеазы свободной воды в 1,7 мл трубки микроцентрифужных.
  5. Подготовка дозирования раствора H2DCFDA: В день эксперимента сделать дозирующую решение H2DCFDA с конечной концентрации 1 мкг / мл H2DCFDA в яйце воды. Подготовленные объемы растворов дозирования могут быть изменены по желанию, но гарантировать, что конечные концентрации реагентов сохраняются. Для почек, вместо яиц водой, используют тот же объем модифицированной Дульбекко medium/F-12 Игла (DMEM 50%, 50% F-12, без фенолового красного). Чтобы 5 мл H2DCFDAдозирования решение, использовать 5 мл серологические пипетки для передачи 5 мл яичного воды (или DMEM/F-12) в 15 мл коническую трубку центрифуги, завернутые в фольгу и меченых 'H'.
    1. Удалить 10 мкл яйца водой (или DMEM/F-12) от 15 мл коническую пробирку 'H' и выбросить.
    2. Добавить 10 мкл H2DCFDA рабочего раствора в 15 мл коническую пробирку 'H' и вихревые перемешать (этот объем достаточно для 48 эмбриона или образцов почек (половина полного 96 лунок микропланшет) и эти скважины обеспечит измерения уровня из фоновой флуоресценции).
  6. Подготовьте дозирования раствора H2DCFDA + PMA: В день эксперимента, сделать дозирования раствора H2DCFDA + PMA с конечных концентраций: H2DCFDA - 1 мкг / мл и PMA - 400 нг / мл. Чтобы 5 мл раствора дозирования H2DCFDA + PMA, используйте 5 мл серологические пипетки для передачи 5 мл яичного воды (или DMEM/F-12) в новый 15 мл коническую пробирку 'Н + Р'.
    1. Удалить 110 _6; л яичного воды (или DMEM/F-12) от 15 мл коническую пробирку 'Н + Р' и выбросить.
    2. Добавить 10 мкл H2DCFDA рабочего раствора, затем добавить 100 мкл PMA рабочего раствора в 15 мл коническую пробирку 'Н + Р' и вихревой смешивать (этот объем достаточно для 48 образцов или другой половине полного 96 лунок микропланшет ).
  7. Держите дозирования решения на льду.

3. Считыватель микропланшетов Программирование

  1. Подготовить инструмент: Сила на микропланшетного.
    1. Разминка источник света.
    2. Настройте программу для чтения флуоресценции: например возбуждает: 485 нм; Излучение: 528 нм; Оптика: Top 510 нм; Чувствительность: 65, с 5 сек дрожащим шагом до начала чтения.

4. 96 Ну Микропланшетный Настройка (см. рисунок 2)

  1. Соберите поставок: Получить блюда с dechorionated эмбрионов, черный 96-луночный микропланшет, P200 пипетки исоветы, ведро льда с H2DCFDA и дозирования растворов H2DCFDA + PMA, многоканальный p200 пипетка, две стерильные резервуары, алюминиевая фольга, и ножницы.
  2. Передача одного эмбриона в каждую лунку микропланшета 96 а: Ножницами отрезать пипетки таким образом, что эмбрионы или почки подходят через отверстие.
    1. Установите P200 пипетки до 100 мкл и передать один эмбрион вместе с яйцом воды (или DMEM/F-12) в, как многие из лунки черного 96-луночного микропланшета по желанию (не надо менять пипетки для каждого разные Образец эмбрион в пределах экспериментальной состоянии, но это может быть необходимо изменить подсказки между экспериментальных условиях). Будьте уверены, чтобы избежать переноса остаточные хорионов, так как они, как правило, искажают данные, собранные. Для передачи почек, больший объем пипетки (устанавливается на 100 мкл) могут быть использованы и наконечники могут быть сокращены, чтобы получить больший размер отверстия, если это необходимо. Это может быть необходимо, чтобы включить скважин без образцов эмбриона или в почках, но срешения дозирования для управления для некоторых экспериментальных манипуляций.
  3. Добавить решения дозирования: Налейте раствор дозирования H2DCFDA в стерильный 25 мл водохранилища.
    1. С помощью многоканального P200 пипетки и восемь подсказки, чтобы одновременно пипетки 100 мкл раствора дозирования H2DCFDA в одном столбце на луночного микропланшета 96 (500 нг / мл конечна концентраци H2DCFDA).
    2. Повторите это (изменение советы не надо) на столько столбцов, как хотелось бы (обычно шесть столбцов или 48 скважин, если заполнение весь планшет 96 а). Добавить это решение до половины образцов эмбриональных управления и половины экспериментально манипулировать образцов эмбриона (пример 96 луночный микропланшет настроить показано на рисунке 2, эти скважины (окрашены в оранжевый цвет) представит справочные флуоресценции данных в образцах не индуцированных с PMA) .
    3. Залейте раствор дозирования H2DCFDA + PMA в новую, стерильную резервуара 25 мл.
    4. Используйте многоканальную P200 пипетки и восемь советов, которые одноврaneously пипетки 100 мкл раствора дозирования H2DCFDA + PMA в остальных колонках (красного цвета на рисунке 2) из а микропланшет 96 (изменение советы не надо, конечные концентрации H2DCFDA-500 нг / мл и PMA-200 нг / мл) .
  4. Накройте планшет с алюминиевой фольгой.
  5. Встряхнуть планшет в течение примерно 20 сек при 150 оборотах в минуту для гомогенизации решения в каждую лунку.
  6. Выдержите планшет при 28 ° С, когда он не читается.

5. Флуоресценции Количественное

  1. Read микропланшет в момент времени = 0 ч после добавления ФМА с использованием параметров, описанных в пункте 3.1.2.
    1. Продолжать принимать измерений каждые несколько минут для нужного интервала времени или не инкубировать фольги завернутые планшет при 28 ° С до более позднем этапе, а затем принять измерение конечной точки в заданное время (например, 4 ч после добавления PMA).
  2. С помощью пластиковой тransfer пипетки для получения эмбрионов из скважин.
  3. Усыпить эмбрионов в соответствии с вашим ухода за животными и протокола использования, например, погружения в Tricaine MS222.
  4. Утилизировать микроплиты и других расходных материалов в биологически опасных контейнер для отходов.

6. Анализ данных

  1. Принятие решения о времени, в который вы хотели бы сравнить значения флуоресценции (например, 4 ч после добавления PMA, таблица 1).
  2. Вычтите значение флуоресценции среднего ООН-индуцированной контрольной группы из значений флуоресценции индивидуальных PMA-индуцированной контрольной группы.
  3. Повторите эту процедуру для экспериментальной группы с и без PMA.
  4. Храните эти нормированные значения флуоресценции в двух колонках, управления + группы PMA и экспериментальной + группы PMA (табл. 2).
  5. Рассчитать средние и стандартные отклонения для нормированных значений флуоресценции контролем + PMA Гроур и экспериментальная + PMA группа.
  6. Сравнение нормированные значения флуоресценции помощью непарного т-тест для определения статистической значимости (табл. 2).
  7. График средства контроля + группы PMA и экспериментальной + группы PMA с барами об ошибках, отражающих соответствующие стандартные отклонения.
  8. Запишите уровень значимости на графике и в фигурном легенде (рис. 2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы предоставляем данные, сравнивающие ответ респираторный взрыв в эмбрионов рыбок данио (дикого типа, А. Б. фон) на 48 и 72 часа после оплодотворения (ФВЧ). Эмбрионы 48 HPF действовал как наш контрольной группе и эмбрионов 72 оплодотворения как нашей экспериментальной группы. Размер выборки использовали 24 ООН-индуцированной эмбрионы и 24 PMA-индуцированные эмбрионы в стадии развития. Сырье Измерение флюоресценции (в относительных единицах флуоресценции (RFU)) были получены путем считывания микропланшетов 4 часа п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основная функция фагоцитов является выявление, поглотить, а уничтожить болезнетворные микроорганизмы. Способность фагоцитов производить адекватную респираторный взрыв имеет решающее значение для этой функции. Таким образом, количественная оценка ответ респираторный взрыв является одним из методов, чтобы позволить сравнение общей врожденной иммунной здоровья и функции между группами лиц и / или в ответ на экспериментальных манипуляций. Здесь мы опишем протокол индуцировать, количественно и сравнить реакцию дыхательного в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы выразить признательность прошлые и нынешние члены лаборатории Ким, Марк Нилан для рыбок данио ухода и обслуживания, д-р Роберт Уилер за полезные обсуждения и обмена данными, и NIH гранты 3RO1GM087308-02S1 и 1P20RR024475-01A2 и Мэн сельскохозяйственных и лесных опытная станция (номер публикации 3303) для финансирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Растворимая морская сольприготовления Instant OceanSS15-10
H2DCFDASigma Aldrich35845-1G
PMAFisherBP6851
DMSOSigma AldrichD2438-5X10ML
Tricaine S MS222Western Chemical100 грамм
DMEM/F-12, без фенола Red Life Technologies11039-021
Глубокие чашки ПетриVWR89107-632
Пластиковые трансферные пипеткиFisher13-711-7M
#5 Щипцы DumontЭлектронная микроскопия Sciences72700-D
1,7 мл Микроцентрифужные пробиркиAxygen10011-724
15 мл Конические центрифужные пробиркиVWR21008-918
5 мл Серологические пипеткиGreiner Bio One606180
Synergy 2 Многорежимный считыватель микропланшетовBioTekContact BioTek
Black 96 Луночный микропланшетVWR82050-728
25 мл Стерильные резервуарыVistaLab3054-2003
P200 ПипеткаGilsonF123601
Многоканальная пипеткаVWR89079-948
Наконечники для пипетокVWR89079-478
быстрого

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Medzhitov, R., Janeway, C. A. Jr Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
  2. Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
  3. Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
  4. Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
  5. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
  6. Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
  7. Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
  8. Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542(2010).
  9. Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
  10. Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription - Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
  11. d'Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151(2010).
  12. Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
  13. Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196(2012).
  14. Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051(2012).
  15. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113(2009).
  16. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839(2011).
  17. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717(2010).
  18. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  19. Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'Definitive' (and 'Primitive') Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
  20. Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
  21. Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
  22. Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
  23. Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
  24. Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , 11th, Forthcoming.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

zebrafishPMAzebrafish

Похожие статьи