Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Микропланшет анализа для оценки химического воздействия на RBL-2H3 дегрануляцию тучных клеток: Влияние триклозан без использования органического растворителя

39.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50671

⸱

1 ноября 2013 г.

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, Orono, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, Orono

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Дегрануляцию тучных клеток, высвобождение медиаторов аллергии, играет важную роль в аллергии, астмы и паразитов защиты. Здесь мы показываем, методы 1 для оценки воздействия наркотиков и токсикантов на дегрануляцию, методология недавно использовали проявляют мощное тормозящее действие антибактериальный агент триклозан 2.

Аннотация

Тучные клетки играют важную роль в аллергических заболеваний и иммунной защиты от паразитов. После активации (например, путем аллергеном), их дегрануляции, процесс, который приводит к экзоцитоз медиаторов аллергии. Модуляция дегрануляцию тучных клеток на наркотики и токсические вещества могут иметь положительные или неблагоприятное воздействие на здоровье человека. Мачта функции клеток была расчлененный подробно с использованием крыс базофильные клетки лейкоз тучных (RBL-2H3), широко распространенной моделью человеческой клетки слизистой оболочки мачта 3-5. Мачта компонент гранул клеток и аллергический посредник β-гексозаминидазы, которая распространяется линейно в тандеме с гистамина из тучных клеток 6, можно легко и надежно измерять посредством реакции с флуорогенного субстрата с образованием измеримые интенсивности флуоресценции в микропланшет-анализа, который поддается высокой пропускной исследования 1. Первоначально опубликовано Naal соавт. 1, мы адаптировали эту дегрануляции тест для скрининга OF наркотиков и токсикантов и продемонстрировать его использование здесь.

Триклозан широким спектром антибактериального агента, который присутствует во многих потребительских товарах и было обнаружено, что терапевтический помощь в человеческих аллергических заболеваний кожи 7-11, хотя механизм этого эффекта неизвестна. Здесь мы показываем, анализа на эффект триклозана на дегрануляцию тучных клеток. Недавно мы показали, что триклозан сильно влияет на функции клеток мачты 2. В попытке избежать использование органических растворителей, триклозан растворяли непосредственно в водном буфере с высокой температурой и перемешивании, и полученную концентрации подтверждена с помощью УФ-и видимой области спектра (с использованием ε 280 = 4200 л / M / см) 12. Этот протокол имеет потенциал для использования с различными химическими веществами, чтобы определить их воздействие на дегрануляцию тучных клеток, и более широко, их аллергический потенциал.

Введение

Тучные клетки высоко гранулированный иммунные эффекторные клетки, которые служат ключевыми медиаторами при астме, аллергии, паразиты обороны и канцерогенез 13-16. Они живут почти в каждой ткани васкуляризированной 15, где они безопасно хранить аллергических и воспалительных медиаторов в цитоплазматических гранул до момента активации к дегрануляции. Дегрануляция является экзоцитоз мембраносвязанных гранул, что приводит к выделению фармакологически активных медиаторов, таких как гистамин, триптазы и лейкотриены 15. Этот процесс приводит к инициированию типа я реакции гиперчувствительности, которые являются критическими в монтажной защиту против паразитов, а также инициирование аллергический, астматический, и канцерогенных ответов 15.

Тучные клетки и базофилы выразить FcεRI рецепторов с высоким сродством рецепторы для иммуноглобулина Е (IgE) 17. Воздействие аллергеном или антигеном вызывает агрегации множественного IgE-связанных рецепторов FcεRI 17, и именно с этойо-называемый "сшивание" от IgE-связанного Fc рецепторов, который инициирует процесс дегрануляции: каскад событий фосфорилирования тирозина, активацию фосфолипазы С, отток кальция из внутренних запасов и приток кальция в клетку 18. Этот приток кальция необходимо для дегрануляции, и, кроме того, сигналы гранул сплав с мембраной до возникновения экзоцитоз гранул 15. Экспериментально кальциевого ионофора может быть использован для трансфера кальций непосредственно через клеточную мембрану 19, которая по существу обходит все передачи сигнала шаги перед стадией приток кальция 20, что позволяет для идентификации пути мишени токсикантов как до, либо после кальциевой сигнализации 20.

Дегрануляция могут быть измерены быстро и эффективно, контролируя высвобождение из β-гексозаминидазы в клеточном супернатанте, которая распространяется линейно из гранул вместе с гистамином 6, но ягораздо проще обнаружить с помощью простой фермент-субстрат реакции и микропланшет-ридера для анализа флуоресцентного продукта. Этот планшет анализа, как указано в протоколе раздел основан на надежный метод, первоначально разработанный Naal соавт. 1, который количественно расщепление флуорогенный субстрат 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид на β- гексозаминидазы. Мы модифицировали анализа для проверки воздействия наркотиков и токсикантов, с триклозан отраженных здесь. Этот метод надежно количественно дегрануляции, является недорогой альтернативой, например, проточной цитометрии методах выявления на основе 21, и имеет потенциал, чтобы оказать себе приятно, чтобы высокопроизводительного скрининга из широкого спектра антиаллергенные препараты, а также иммунотоксические или аллергенных химикатов. Этот последний пункт особенно важен в свете в 2007 году Национальный научно-исследовательский совет доклад "испытания на токсичность в 21-м веке: видение и Stratгии »( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), которая выступает за развитие высокой пропускной токсикологии испытания, которые используют культуру клеток сократить использование дорогостоящих традиционных лабораторных животных, таких как мыши. Дегрануляции протокол, разработанный Naal соавт. 1 и модифицирована нами 2, использует RBL-2H3 клеточная линия, которая является широко признанным модель гомологичных человеческих клеток слизистой оболочки мачты или базофилы 3-5. (Методы культивирования RBL-2H3 клетки описаны в Hutchinson и соавт. 22). Этот анализ, вероятно, может быть адаптирована к любой тип мачты прилагается клетки.

Триклозан (TCS) является широким спектром антимикробного, который был использован для более чем 30 лет в больницах, средства личной гигиены, товары народного потребления 23,24. Механизм действия антимикробных характерные для TCS является ингибирование жирных кислот биосинтез, вероятно, путем ингибирования еноил-ацилбелком-носителем редуктазы 25,26. Он находится во всем мире в широком диапазоне потребительских продуктов, таких как гель, лосьон для рук, зубную пасту, жидкость для полоскания рта, а в руке мыло в концентрации до 0,3% или 10 мМ 24. Широкое применение TCS привело к обнаружению уровней у человека 27-29 и в реках и ручьях 30. Исследование, проведенное Allmyr соавт. Показали, что 27 TCS и его метаболиты присутствуют как в плазме, и молоко от кормящих матерей. Важно отметить, что TCS легко впитывается в кожу, 31-37. Queckenberg соавт. 37 найдены ~ 10% поглощение ~ 70 мМ крем TCS в человеческую кожу в течение 12 ч, в результате чего в значительной концентрации в коже, где тучные клетки находятся.

TCS было показано в клинических условиях для управления человеческой аллергических заболеваний кожи 7-11, но механизм, посредством которого TCS уменьшает аллергические заболевания кожи была неизвестна 38. Использование флуоресцентных detaile анализа микропланшетD В этом видео, мы недавно показали, что TCS, при таких низких концентрациях, как 2 мкм, что значительно ослабляет мачту функции клеток и дегрануляцию, обеспечивая потенциальное объяснение этих клинических данных 2. В дополнение к предоставлению объяснение этих клинических данных, наши данные в Палмер и др.. 2 показывают, что TCS цели сигнальных молекул вниз по течению притока кальция. Из-за важности кальциевой сигнализации во многих иммунологических и других биологических процессов, TCS потенциально может оказать неблагоприятное воздействие на широкий спектр необходимых биологических процессов. В самом деле, Udoji соавт. Показали, что 39 TCS подавляет человека природных клеток-киллеров литической активности, еще одной важной врожденной иммунной функции.

За свой ​​потенциал в качестве терапевтической помощи при аллергических заболеваний кожи (или, наоборот, как иммунотоксикантом), TCS также может быть эндокринные нарушающими 40-49. Таким образом, четкой процедуры по подготовке этого химического вещества в растворе яы, представляющие интерес для токсикологов. Поскольку TCS представляет собой небольшую молекулу гидрофобные органические транспортные средства часто используются, чтобы сделать его более растворимы в воде. В большинстве исследований токсичности где TCS была протестирована, препарат участвует растворения в воде с помощью органического растворителя, такого как этанол, ацетон или масло 2,50,51. Однако зачастую этих растворителей являются биологически активными сами, что усложняет интерпретацию химический анализ данных 51. На самом деле, в соответствии с Rufli соавт. 52 и др. 53, рекомендуется, чтобы тестируемые растворы для водных экспериментов токсичности готовятся с использованием физических методов над химическими методами, в связи с возможным химических растворителей для создания токсичности артефактов. Ранее нами было показано, что TCS растворенные в 0,24% этанол / вода (об / об) и обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин гасит RBL дегрануляцию тучных клеток 2. Этанол при более высоких концентрациях, чем 0,24%, как было показано ослабить мачта деградацией клеткиnulation 54,55-примеры потенциально смешанного воздействия органических растворителей на исследования токсичности.

Это не только важно учитывать влияние растворителей на организм или клетки, используемые для исследования, но и важно для мониторинга влияния растворителя на химический тест сам. Например, скоро и соавт. 51 обнаружили, что растворение TCS в полиэтиленгликоле (обычно находится в зубные пасты и жидкости для полоскания рта) ослаблены антибактериальными и против зубного налета эффектов у здоровых женщин женщины в то время как растворение в маслах вызванный полной потере функции. Таким образом, способность различных растворителей модулировать токсических веществ и наркотиков, включая TCS, эффекты должны быть рассмотрены в тесте конструкции. Использование масла или вкусовые добавки могут мешать эффекты TCS в различных продуктах 50,51.

В попытке устранить необходимость в использовании органических растворителей, мы улучшили наш способ растворения TCS 2, устраняя использование органического зольвыразить. В настоящем Протоколе, мы растворяем TCS гранулы непосредственно в водный буферный раствор с выделением тепла (≤ 50 ° C), а затем проверить концентрацию этого запаса TCS УФ-и видимой области спектра. Эти усовершенствования возможно потому, TCS растворим в воде до 40 мкМ ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ), и было показано, что устойчивость к разложению при нагревании до 50 ° C ( HTTP: / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56,57. У нас также есть дополнительное преимущество УФ-и видимой области спектра, а также TCS, как известно, сильно поглощают при 280 нм с 58 коэффициент молярной экстинкции 4200 л / моль / см 12.

Этот протокол обеспечивает простой, но эффективный способ растворить TCS гранул в буфер без помощи органического растворителя, в том числе низкой стоимости и быстрой проверкиконцентрации, и описывает мощную флуоресцентного исследования микропланшет для мониторинга химического воздействия на дегрануляцию тучных клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Отметим, что все буфера рецептов включены в таблицу в конце текста протокола.

День 1:

1. Подготовка клетки

  1. План из 96-луночных схема установки пластины, центрирование образцов на макете, чтобы избежать краевых эффектов. Выделить трех повторностей для каждой концентрации TCS испытания (± дегрануляции стимулятор антигена или ионофор), а также трех повторах с учетом спонтанного выхода (не дегрануляции стимулятор), максимальная высвобождения (0,2% Тритон Х-100 [TX] моющего средства лизис), а также скважин зарезервированы для фоновых проб (который не будет содержать клетки). Для каждой параллельной день эксперимента, выбрать новую рандомизированных расположение концентрации TCS образца.
  2. Теплый RBL среды (Рецепт предоставлен в таблице) и трипсин в 37 ° С водяной бане.
  3. Проверьте RBL клеток в Т-25 колбу (2-4 дней с момента Вашего последнего прохода и менее 3-4 месяцев, так как они оттаивают) для общих признаков хорошего исцелениего: Собственные рН судить по цветному средств массовой информации, и отсутствие облачности. Поместить колбу под световым микроскопом для подтверждения того, что колба не загрязнен и что клетки появляются здоровые, правильно сливающиеся, и по большей части прилагается. Обратите внимание, что клетки должны быть проверены на загрязнение микоплазмой примерно каждые шесть недель 22.
Лечение Трем образцам
Вынужденное, 0 мкм TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
Вынужденное, 0,001 мкм TCS F6, G6, H6
Вынужденное, 0,1 мкМ TCS A4, B4, C4
Вынужденное, 1 мкМ TCS A6, B6, C6
Вынужденное, 5 мкм TCS F5, G5, H5
Вынужденное, 10 мкМ TCS A3, B3, C3
Вынужденное, 15 мкм TCS A5, B5, C5
Вынужденное, 20 мкМ TCS F7, G7, H7
Вынужденное, плюс высокая [TCS] F3, G3, H3
Спонтанные, нет TCS (не включает в себя издевается) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, В8, С1, С2, С8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
TX-100, не TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12
Нет Клетки, фон, плюс высокая [TCS] G10, G11, G12, Н10, Н11, Н12

figure-protocol-1
Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

  1. Возьмите колбу RBL клетки в стерильной культуре ткани (TC) капот. Клетки прикрепляются к ботТом из колбы. Рабочее под капотом ТС и с использованием стандартного метода стерильных, удалить носитель из колбы с стерильной пипетки; клетки остаются прикрепленными к нижней части колбы. Затем промыть колбу с 2 мл трипсина, то отбросить эту стирки.
  2. Добавить именно 2 мл трипсина, чтобы покрыть дно колбы. Введен в 37 ° C инкубаторе в течение 5 мин, чтобы позволить клеткам отделяться от дна колбы.
  3. Через 5 мин попала в стенке колбы с ладонью, чтобы ослабить клеток. Сразу же, добавить 18 мл RBL СМИ, чтобы промыть клетки с колбы и, чтобы утолить трипсина. Сразу принимают клетку-Медиа-трипсина смесь из колбы и переход к новой, стерильные 50 мл трубки (общий объем в эту трубку в настоящее время 20 мл).
  4. После перемешивания осторожно, но тщательно удалить 50 мкл клеточной суспензии из этой трубки и передать 1,5 мл стерильную пробирку микроцентрифужных, который представляет собой образец для подсчета. Возьмем этого образца, а также 50 мл0; пробирку, содержащую клетки-Медиа-смесь трипсина из капота TC к настольным.
  5. Вращайте 50 мл трубки в центрифуге (с соответствующим балансом) в течение 8 минут при 500 мкг; эта сила гранул клетки эффективно.
  6. В ходе выделения времени, подсчитывают клетки в образце, которые были выделены перед формованием. Чтобы сделать это, сначала добавить 50 мкл трипанового синего красителя до 50 мкл клеток в 1,5 мл трубки и осторожно, но тщательно пипетку вверх и вниз 5x перемешать. Сразу же, перевести 10 мкл этой смеси к стеклу гематоцитометр, и считать клетки в сетке районе после инструкциями производителя. Граф по крайней мере, 100 клеток за разумные статистические результаты.
  7. Вернуться в капюшоне TC, удалить супернатант из клеток, которые осаждали.
  8. Закрывают клетка трубки, и вылить осадок на дне пробирки, чтобы ослабить клеток.
  9. Добавить файлы мультимедиа в клетки обрабатывали трипсином для получения плотности 0,5 × 10 6 клеток / мл, из расчета на количество клеток.
  10. Хорошо перемешайте но осторожно, чтобы сохранить клетки приостановлено во время процедуры покрытия. Использование Pipetman, положить 100 мкл клеток / лунку в 96-луночный планшет (плоский, черный низ), после шаблона листа пластины. Случайно как клетки добавляли в лунки, чтобы избежать систематической ошибки, и смесь после каждого набора из трех скважин добавляется. Будьте уверены, чтобы не поставить клетки в лунки, предназначенного для фоновых проб.
  11. После того как все клетки были переданы, поместите пластину крышки на пластине, и передают в инкубатор (37 ° C / 5% CO 2) в течение ночи. Очистка после стандартной стерильной техники.

ДЕНЬ 2:

2. Подготовка триклозан

  1. С помощью мерного цилиндра, измеряют 250 мл Tyrodes буфер (рецепт приведены в таблице) в 500 мл колбу Эрленмейера с надписью "TCS-буфера." Добавить мешалкой. Используйте посуду, мешалкой, термометром, предназначенных для использования с TCS только.
  2. Также в это время, измерения 250Tyrodes мл в отдельный 500 мл коническую колбу, с надписью "контроль буфера." Использование изделия из стекла, мешалкой, термометром, которые создаются для ТКС. Добавить мешалкой.
  3. Взвесить 0,0022 г гранул TCS и переход в «TCS-буфер" колбы (который содержит 250 мл буфера Tyrodes). Для того, чтобы эффективно передавать гранул коническую колбу, используйте 10 мл из измеренных Tyrodes 250 мл смыть весят лодке, убедившись, что все TCS был передан.
  4. Место "TCS-буфер" колбу на электрической плитке комбинация / магнитная мешалка, и установить его для перемешивания при manageably высокой скорости. После хорошо перемешать, эта акция TCS будет номинально составлять 30 мкм (фактическая концентрация будет рассчитан после нагрева). (Все ли перемешивание в химическом вытяжном шкафу.)
    1. Также в это время, поместите "контроль буфера" колбы (не содержащие TCS) на вторую конфорку комбинация / магнитная мешалка, и установить его для перемешивания при аналогичной скорости.
  5. Включите UV / VIS прогрева лампы лампы для последующего использования.
  6. Нагрейте "TCS-буфера" решение до 50 ° С при постоянном перемешивании. Как только до температуры, времени в течение 90 мин. Во время 90 мин, продолжать следить 50 ° C температуре и соответствующей скорости перемешивания часто.
    1. Одновременно нагреть "буфер управления« раствором (который находится в 250 мл простого буфера Tyrodes) до 50 ° C при непрерывном перемешивании. По достижении 50 ° С, время в течение 90 мин, в течение которых температура (хранение при 50 ° C) и перемешивание и контролироваться.
  7. В конце 90 мин, принимать как колб Эрленмейера с конфорками и трансфер в настольный.
  8. С помощью функции сканирования на длине волны УФ / ВИД спектрофотометр, пустой машины на 1 мл с подогревом "буфер управления" решения перед сканированием 1 мл с подогревом "TCS-буфер" решение. Проверьте форму спектраD записи значение абсорбции при 280 нм. Для определения концентрации, использование Ламберта-Бера уравнение (280 ε = 280 ℓ в) использование ε 280 из 4200 л / моль / см 12 и ℓ 1 см.
  9. После определения концентрации TCS, добавляют 0,249 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) в оставшиеся 249 мл "TCS-буфер" раствор и хорошо перемешать.
    1. Одновременно добавляют 0,249 г BSA к оставшимся 249 мл "буфер управления" решения, и хорошо перемешать.

ДЕНЬ 2:

3. Антиген-стимулированных Дегрануляция анализа с использованием RBL-2H3 клетки

  1. Перед тем как начать, проверьте рН все буферы используются, и обеспечить, чтобы они были четкими и не облачное: это включает Tyrodes буфера, буфер ацетата натрия и глицин карбонатного буфера (рецепты приведены в таблице).
  2. Теплый RBL СМИ и трипсина в 37 ° С водяной бане.
  3. Сделать БТ (1 мг / мл0; БСА в Tyrodes буфер): 0,05 г BSA + 50 мл Tyrodes буфера (X2). Введен в 37 ° С водяной бане.
  4. Убедитесь, 0,2% Тритон Х-100: 3,136 мл BT + 64 мкл 10% Triton X-100 (конечная концентрация Тритона Х-100 0,2%). Хорошо перемешайте инверсии, но не вихрь. Введен в 37 ° С водяной бане.
  5. Начать подготовку TCS и подогревом буфера Tyrodes (шаги "2", выше). Примечание: Не начинайте следующий шаг (IgE экспозиции), пока "TCS-буфер» и «буфер управления" решения достигать 50 ° C и перемешивали в течение первые 70 мин 90 мин тепла / время перемешивания.
  6. Как только оба решения были перемешивают при 50 ° C в течение 70 мин, составляет 0,1 мкг / мл анти-DNP мыши IgE (Sigma) в средствах массовой информации RBL для образца скважин быть ориентированы (100 мкл / лунку). IgE акции не должны быть старше 30 дней при хранении при 4 ° С; записывать, как старые акции. Флик смешать, но не вихрь IgE.
  7. Под капотом TC,добавить 0,6 мкл IgE акций (акции составляет 1 мг / мл) до 6 мл RBL СМИ в 50 мл трубки. В соответствии со вторым 50 мл пробирку, добавляют 6 мл простого RBL среды только (которая предназначена для несенсибилизированных образцов).
  8. Дамп все носители из 96-луночный планшет (который был подготовлен в 1 день) в раковину, и довести пластины под капотом ТС.
  9. Случайно добавить 100 мкл среды / IgE смеси скважин, которые должны стимулироваться (48 скважин общей сложности). Эта смесь не предназначена для "спонтанной", "Техас" и "фон" образцов.
  10. Случайно добавить 100 мкл простой RBL СМИ только "TX", "спонтанные" и "фон" скважин.
  11. Поместите пластину крышки на пластине, а затем переместите пластину в 5% CO 2/37 ° C инкубаторе в течение 1 часа.
  12. Во время инкубации 1 ч, выполните шаги 3,13 - 3,24.
  13. По крышке, готовить разведения антигена. Добавить 0,53 мкл 1,6 мг / мл со DNP-BSA + 850 мкл & #160; BT, чтобы получить антиген концентрации 1 мкг / мл. Vortex и инвертировать этот запас перемешать.
  14. Как только "TCS-буфера" и "буфер управления" были нагреты и затем перемешивают в течение 90 мин при 50 ° С, продолжать с остальной частью подготовки к TCS протокол (переход к шагу 2.6 - 2.8.1). После BSA растворяется в обоих решений, продолжают ниже.
  15. Начать подготовку экспозиции буфере, Ag ±, ± TCS. Во-первых, из 249 мл образца "TCS-буфер" раствор (который уже был нагревают и перемешивают в течение 90 мин), передачи 50 мл на новую 50 мл коническую трубку. Удалить 20 мкл этого 50 мл аликвоты и заменить его с 20 мкл 1 мкг / мл антигена подготовленные ранее для конечной концентрации антигена 0,0004 мкг / мл DNP-BSA. Vortex и инвертировать.
    1. Добавьте описание этого "Tube 1, высокое TCS / + Ag / + BT." Он используется для разведения и высокие концентрации воздействия TCS.
  16. Из 249 мл образца "контроль буфера" решение, передавать от 50 мл до 50 мл новой трубки. Удалить 20 мкл этого нового 50-мл аликвоту и заменить с 20 мкл 1 мкг / мл антигена подготовленные ранее для конечной концентрации антигена 0,0004 мкг / мл DNP-BSA. Vortex и инвертировать.
    1. Добавьте описание этого "Tube 2, нет TCS / + Ag / + BT». Используется для разведения и TCS 0 мкМ концентрации TCS экспозиции.
  17. Теперь возьмите 50 мл "TCS-буфера" решение и положить в другую 50 мл трубки. Удалить 20 мкл этого нового 50-мл аликвоту и заменить его с 20 мкл простой BT. Vortex и инвертировать. Нет антигена не добавляется.
    1. Добавьте описание этого "Tube 3, высокое TCS / Нет Ag / + BT." Это используется для фона.
  18. Передача 50 мл "контроль буфера" решение еще 50-мл трубки. Возьмите 20 мкл из этого пе ж 50 мл аликвоты и заменить его с 20 мкл простой BT. Vortex и инвертировать. (Нет Ag не добавляется.)
    1. Добавьте описание этого "труба 4, нет TCS / Нет Ag / + BT." Это используется для фона и спонтанной образцов.
BSA TCS Антиген
Труба 1 figure-protocol-2 High [] figure-protocol-3
Tube 2 figure-protocol-4 NO figure-protocol-5
Труб 3 / Files/ftp_upload/50671/check.jpg "ширина =" 15px "/> High [] NO
Труба 4 figure-protocol-6 NO NO
  1. Подсчитывают и записывают объемы разведений после определения концентрации "TCS-буфер" акции. Общий объем для каждого разведения концентрация должна быть 1 мл и должен быть подготовлен в стерильную пробирку микроцентрифужных. Используйте калиброванный P2 и P1000 Pipetman.
Концентрация Высокие Tyrodes триклозан + + BSA 0,0004 мкг / мл Ag
(Трубка 1 сверху) 		С подогревом BT 0,0004 мкг / мл Ag
(Tube 2 сверху)
20 мкМ
15 мкм
10 мкМ
5 мкм
1 мкМ
0,1 мкМ
0,001 мкм
0 мкм (в верхней части пластины) ----------------------- 500 мкл плюс еще 500 мкл
0 мкм (нижняя пластина) ----------------------- 500 мкл плюс еще 500 мкл
  1. После 1-часовой инкубации IgE, возьмите пластинку из инкубатора и бросить все средства массовой информации в раковину. (Примечание: если испытание химических веществ, как известно, более токсичны, чем потребительский продукт TCS, опасных отходов может быть необходимым.)
  2. Использование Combitip, случайно промыть клетки в 96-луночный планшет с BSA-Tyrodes буфера (200мкл / лунку). Выпуск промывочного буфера на сторонах скважины, а не непосредственно на прикрепленных клеток для того, чтобы не мешать прикрепленных клеток. Повторите этот процесс во второй раз.
  3. Чтобы подготовить для применения процедуры, вихревые и инвертировать права разведения перед добавлением к пластине.
  4. Начиная с верхней части пластины: Случайно добавить трижды по 200 мкл каждого из антигенов растворы (с правильной концентрации TCS) в соответствующие лунки. Продолжайте нижней части пластины. Добавить "контроль буфера" решение плюс Ag (от "Tube 2" выше) для всех "издевается" на тарелку.
  5. Добавить 200 мкл соответствующего решения соответствующие лунки:
    1. Добавить 200 мкл 0,2% Тритон Х-100 в "TX" назначенных скважин.
    2. Затем добавьте 200 мкл труб от 3 до 3 скважины с надписью "Фон (BKGD)-Высокая TCS" на тарелку.
    3. Наконец, добавьте 200 мклиз труб от 4 до 6 скважин с надписью "Спонтанная".
  6. Инкубировать в течение 1 часа в 37 ° C / 5% CO 2.
  7. Во время инкубации 1 час: Получить два ведра льда (один для "старых" пластины в инкубатор и один для новой пластинкой). Оттепель 4-метилумбеллиферила-N-ацетил-бета-D-глюкозаминид (4-MU) при комнатной температуре в течение 40 мин, имея в фольгу, поскольку он чувствителен к свету.
    1. После 4-MU со размораживают, составляют 4-MU рабочего раствора: 150 мкл запас + 14,85 мл холодного буфера ацетат (рецепт приведен в таблице); вихревой и инвертировать. Хранить в 50 мл центрифужные пробирки, завернуты в фольгу, а на льду до использования.
    2. Использование Combitip, случайно добавить 100 мкл холодного 4-MU рабочий раствор в самом низу каждой лунке NEW Гренье черный 96-луночный планшет (на ведро со льдом, № 2). Начало первой путем добавления рабочего раствора случайно в верхней части пластины, случайно в нижней части пластины, случайно в Triton X-100 скважини, наконец, в случайном фоне скважин.
    3. Убирайся новую коробку P200 советы для следующего шага.
  8. В конце 1-часовой инкубации, положить ячейки пластины из инкубатора на ведро льда № 1, супернатант пипетки вверх и вниз 4-5x (мягко, не вводим пузырей), собираются вокруг скважины для хорошего перемешивания, но не касаясь клетки при перемешивании . Систематически, вынуть 25 мкл образца из каждой лунки и поместить в новую тарелку с субстратом (одинаковый порядок образцы, как это первоначально планировалось выход). Внесите вверх и вниз, чтобы смешать образец полностью, когда в новой скважины, без введения пузырьков.
  9. Выдержите в течение 30 мин при 37 ° C / 5% CO 2.
  10. Через 30 мин инкубации случайно добавить 200 мкл холодного глицин-карбонатного буфера на лунку (с использованием Combitip), чтобы заполнить скважин глубиной до 325 мкл общего. (Сделать это дополнение к Тритон Х-100 выборок последнего, чтобы избежать Тритон Х-100 трансмиссионные). Проверьте пузыри, прежде чем чтение пластину (мешке с пипетки чистой P10TE Совет поп пузырьков).
  11. Запустите пластину в флуоресценции планшет-ридер (перейдите в раздел 4).

ДЕНЬ 2:

4. Флуоресцентные прочтения планшетов инструкции и данные анализа

  1. Откройте Gen5 программы и открытые разделе эксперимента.
  2. Включите планшет-ридер и вставьте пластину (верхнем левом углу A1).
  3. Протокол figure-protocol-7 Процедура figure-protocol-8 Читать, чтобы установить пользовательские чтениях. Не добавляйте ничего об образцах, копирует и т.д., с целью сбора данных флуоресценции сырья из каждой лунки.
  4. Под "Read" выберите "флуоресценция", "Конечная точка", "Нормальная Скорость", "Gain 40", "Возбуждение 360/40", "Выбросы 460/40," Оптика Должность: 50%. Топ оптического смещения: 7 мм. Нет дрожания, без задержки, не кинетика, а без монитора, температура: от инкубатора.
  5. Выберите плоский черный низ, 96-луночный планшет (Гренье 96-луночный, плоское дно).
  6. Сделка с пластиной макета: Протокол figure-protocol-9 пластины макета. Настройка образцы без указания повторы, разведения и т.д.
  7. Плита figure-protocol-10 читать.
  8. Сохранить файл: Нажмите кнопку "Excel" кнопку, которая будет экспортировать данные в файл Excel. Делайте это в течение пластины макета и матрицы. Сохраните файл на компьютере и на диске USB.
  9. В Excel, вычесть среднее значение фона из каждого образца, в том числе Тритон Х-100 скважин.
  10. Рассчитать относительную дегрануляции% путем деления каждого значения (уже имея вычетом фона) на среднее Тритон Х-100 значение, а затем умножить на 100, чтобы сделать его в процентах.
  11. Средний всех трех экземплярах и рассчитать стандартное отклонение. График данных в Excel в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Для статистической проверки, переместите теперь Prism программного обеспечения GraphPad.

ДЕНЬ 2:

5. Вынужденное ионофором Дегрануляции анализа с использованием RBL-2H3 клетки

  1. Следуйте протокол для «Подготовка клетки" (п. 1 день 1) и «Подготовка триклозан" (Раздел 2, 2-й день), как описано выше. Например пластины макета для стимуляции ионофором показан ниже.
Лечение Трем образцам
Вынужденное, 0 мкм TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
Вынужденное, 0,001 мкм TCS F6, G6, H6
Вынужденное, 0,01 мкм TCS F3, G3, H3
Вынужденное, 0,1 мкМ TCS A4, B4, C4
Вынужденное, 1 мкМ TCS A6, B6, C6
Вынужденное, 5 мкм [TCS F5, G5, H5
Вынужденное, 10 мкМ TCS A3, B3, C3
Вынужденное, 15 мкм TCS A5, B5, C5
Вынужденное, 20 мкМ TCS F7, G7, H7
Спонтанные, с ДМСО, нет TCS (включает издевается) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, В8, С1, С2, С8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
ТХ-100, ДМСО, не TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12
Нет клетки фоне, с ДМСО, плюс высокая [TCS] G10, G11, G12, Н10, Н11, Н12

figure-protocol-11
Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

  1. Перед тем как начать, проверьте рН все буфера используется, и убедиться, что они ясны, а не снег. Tyrodes, натрий-ацетатный буфер, глицин и карбонатного буфера (рецепты приведены в таблице).
  2. Подготовьте 50 мл коническую трубку BT путем добавления 0,05 г BSA до 50 мл буфера тиродес и, встряхивая, чтобы хорошо перемешать. Выдержите в 37 ° С водяной бане.
  3. Убедитесь, 0,2% Тритон Х-100 с 0,0032% ДМСО (конечная кальциевого ионофора транспортное средство концентрации) добавлением 96 мкл 10% Triton X-100 до 4,704 мл BT. Хорошо перемешать. Затем вынуть 0,155 мкл этого раствора и выбросить. Теперь добавьте еще в 0,155 мкл 100% ДМСО.
  4. Подготовить 5 мМ (2,5 мг / мл) А23187 ионофором из порошка путем добавления 400 мкл свежей 100% ДМСО в ионофором встряхивания флакона и перемешать. После того как в растворе,трансфер в 1,5-мл коническую трубку, запись содержания и сегодняшняя дата и срок действия (3 месяца от подготовки при хранении при температуре от -20 ° C).
    1. Кроме того, при использовании замороженных акций сегодня оттепели на льду, и убедитесь, что 5 мМ А23187 ионофором хорошо перемешивается и ясно. Vortex, Флик, и инвертировать этот запас перед использованием. Запись даты подготовки и Лот № А23187 этого.
  5. Как только "TCS-буфера" и "буфер управления» были нагревают и перемешивают в течение 90 мин, продолжают остальной части подготовки к TCS протокол (переход к шагу 2.6-2.8.1). После BSA является хорошо смешиваются в обоих решениях выполните оставшиеся шаги протокола.
  6. Из 249 мл образца "TCS-буфера" решение, передавать от 50 мл до 50 мл новую коническую трубку. Удалите 1,8 мкл аликвоты 50 мл и добавляют 1,8 мкл 5 мМ со ионофором. Vortex 3x в течение 8 секунд и инвертировать 3x. Конечная концентрация ионофором 180 нм. Заметим, что эта концентрация 23187 будет варьироваться в зависимости от штока потенции, и ионофором А23187 доза-ответ, рекомендуется для определения концентрации 23187, которое вызывает дегрануляцию уровне примерно 20% максимальное высвобождение, которое было идентифицировано как noncytotoxic в RBL-2H3 клетками цитотоксичность (см. 2).
    1. Добавьте описание этого "Tube 1, высокое TCS / ионофором + / + BT». Используется для разведения и высокие концентрации воздействия TCS.
  7. Из 249 мл образца "контроль буфера" решение, передавать от 50 мл до 50 мл новую коническую трубку. Выньте 1,8 мкл 50 мл аликвоты и добавить обратно в 1,8 мкл 5 мМ ионофором складе. Vortex 3x в течение 8 секунд и инвертировать 3x. Конечная концентрация ионофором составляет 180 нМ.
    1. Этикетка не эта "труба 2, NO TCS / ионофором + / + BT." Это используется для разведения и 0 мкМ концентрации TCS.
  8. Из 249 мл образца R 20; TCS-буфера "решение, передавать от 50 мл до 50 мл новую коническую трубку. Вынуть 1,8 мкл новой 50 мл аликвоты и добавляют 1,8 мкл 100% ДМСО. Vortex 3x в течение 8 секунд и инвертировать 3x; ионофором не добавляется.
    1. Добавьте описание этого "Tube 3, высокое TCS / Нет ионофором / + BT / + ДМСО", используется для фона.
  9. Из 249 мл образца "контроль буфера" решение, передавать от 50 мл до 50 мл новую коническую трубку. Выньте 1,8 мкл из нового 50 мл аликвоты и добавить 1,8 мкл 100% ДМСО. Vortex 3x в течение 8 секунд и инвертировать 3x. Нет ионофором не добавляется.
    1. Этикетка эта "труба 4, нет TCS / Нет ионофором / + BT / + ДМСО", используется для спонтанного образцы релизе.
BSA TCS Ионофором Добавлено 100% ДМСО
Труба 1 "SRC =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "ширина =" 15px "/> High [] figure-protocol-12 NO
Tube 2 figure-protocol-13 NO figure-protocol-14 NO
Труб 3 figure-protocol-15 High [] NO figure-protocol-16
Труба 4 figure-protocol-17 NO NO Эк марки "FO: Content-ширина =" 0,1 В "SRC =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "ширина =" 15px "/>
  1. Подсчитывают и записывают объемы разведений после определения концентрации "TCS-буфер" акции. Используйте калиброванный P2 и P1000 Pipetman. Общий объем для каждого разведения концентрация должна быть 1 мл, и должен быть подготовлен в стерильную пробирку микроцентрифужных:
Концентрация Высокая триклозан + + BSA Tyrodes +180 нМ А23187 (Tube 1 сверху) С подогревом BT +180 нМ А23187 (Tube 2 сверху)
20 мкМ
15 мкМ
10 мкМ
5 мкм
1 мкМ
0,1 мкМ
0,001 мкм
0 мкм (в верхней части пластины) ---------------------------------- 500 мкл плюс еще 500 мкл
0 мкм (нижняя пластина) ---------------------------------- 500 мкл плюс еще 500 мкл
  1. Возьмите эти клетки высевали вчера из инкубатора, и пустой носитель в раковину. Использование Combitip, случайно промыть клетки в 96-луночный планшет с БТ (200 мкл / лунку). Повторите мыть второй раз.
  2. Чтобы подготовить для применения процедуры, вихревые и инвертировать права разведения перед добавлением к пластине. Начиная с верхней части пластины: Случайно добавить трижды по 200 мкл каждого из правильной концентрации ТКС в correspoнахождении хорошо. Продолжайте нижней части пластины. Добавить "контроль буфера" решение плюс А23187 (от "Tube 2" выше) для всех "издевается" на тарелку.
  3. Добавить 200 мкл соответствующего решения соответствующие лунки:
    1. Добавить 200 мкл 0,2% Тритон Х-100 в "TX" назначенных скважин.
    2. Затем добавьте 200 мкл труб от 3 до 3 скважины с надписью "Фон (BKGD)-Высокая TCS" на тарелку.
    3. Наконец, добавьте 200 мкл труб от 4 до шести скважин с надписью "Спонтанная".
  4. Инкубировать в течение 1 часа в 37 ° C / 5% CO 2.
  5. Во время 1 час инкубации: Получить два ведра льда (один для "старых" пластины в инкубатор и один для новой пластинкой). Оттепель 4-метилумбеллиферила-N-ацетил-бета-D-глюкозаминид (4-MU) при комнатной температуре в течение 40 мин, имея в фольгу, поскольку он чувствителен к свету.
    1. После 4-MU со размораживают, составляют 4-MU рабочая решенина 150 мкл запас + 14,85 мл холодного буфера ацетат (рецепт приведен в таблице); вихревой и инвертировать. Хранить в 50 мл центрифужные пробирки, завернуты в фольгу, а на льду до использования.
    2. Использование Combitip, случайно добавляют 100 мкл холодного 4-MU рабочего раствора в самой нижней части каждой лунке NEW Гренье черный 96-луночный планшет (на ведро льда # 2): запуск первого добавлением рабочий раствор случайно в верхней части пластиной, случайно в нижней части пластины, случайно в Triton X-100 скважин, и, наконец случайно в фоне скважин.
    3. Убирайся новую коробку P200 советы для следующего шага.
  6. В конце 1-часовой инкубации, положить ячейки пластины из инкубатора на ведро льда № 1, супернатант пипетки вверх и вниз 4-5x (мягко, не вводим пузырей), собираются вокруг скважины для хорошего перемешивания, но не касаясь клетки при перемешивании . Систематически, вынуть 25 мкл образца из каждой лунки и поместить в новую тарелку с субстратом (одинаковый порядок SAmples, как планировалось первоначально выход). Внесите вверх и вниз, чтобы смешать образец полностью, когда в новой скважины, без введения пузырьков.
  7. Выдержите в течение 30 мин при 37 ° C / 5% CO 2.
  8. Через 30 мин инкубации случайно 200 мкл холодного глицин-карбонатного буфера на лунку (с использованием Combitip) для заполнения скважины до 325 мкл общего объема (делать это дополнение к Тритон Х-100 выборок последнего, чтобы избежать Тритон Х-100 трансмиссионные). Проверьте пузыри, прежде чем чтение пластину (мешок с чистой P10 пипетки поп пузырьков).
  9. Запустите пластину в флуоресценции планшет-ридер (Выполните все этапы, в разделе 4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

При нагревании до 50 ° С в течение 90 мин, УФ-и видимой области спектра поглощения для TCS дает сильный, гладкую кривую между ~ 260 и 300 нм, с пиком при 280 нм, как показано на рисунке 1. УФ-и видимой области спектра, таким образом, важным инструментом, который может быть использован для вычисления концентрации, так как опубликовано молярный коэффициент поглощения при 280 нм составляет 4200 л / моль / см 12. Мы обнаружили, что TCS не выпадать из раствора в течение времени кадра всего эксперимента дегрануляции по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В 2004 году Naal соавт. 1 разработали мачты биосенсоров ячейки для высокой пропускной тестирование дегрануляции. Это надежный анализ, который мы адаптировали для нашего исследования TCS и подробно описанная в этом видео. До Naal соавт. 1 анализе дегрануляцию тучных клеток были обычно оценивается с помощью β-гексозаминидаза 59-61, но эти ранние способы, используемые флуорометры, в котором один образец был прочитан за раз. Важно отметить, что Naal соавт. установил прямые соответствия...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

НМ и RHK поддерживаются Высшая школа UMaine в биомедицинской науки и техники (GSBSE); RHK была также поддержана Мэн Сельскохозяйственная и лесная опытная станция. Дополнительное финансирование было предоставлено Национальным Институтом Общих Медицинских Наук (NIH P20-GM103423), Мэн Сельскохозяйственная и лесная опытная станция (номер гранта ME08004-10, ОКГ), Университет штата Мэн ADVANCE Rising Tide центр (NSF грант № 1008498) и исследовательский грант стартер в фармакологии / токсикологии от PhRMA Foundation (ОКГ). Мы благодарим д-ра. Дэвид и Барбара Holowka Baird к антигену и клеток. Мы благодарны Хина Хашми, Алехандро Велес, и Андрей Абовяна за помощь в оборудовании и заказах. Это Мэн Сельскохозяйственная и лесная опытная станция номер публикации 3311.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии

RBL-2H3 Cells

ATCCp align="center">CRL-2256

Ячейки, которые мы использовали, были подарком, но их также можно приобрести в ATCC

Триклозан/Иргасан

Sigma

72779

CAS# 3380-34-5

Следует хранить в среде с низкой влажностью

Trypsin

Gibco

25300-054

CAS# 3380-34-5

EMEM

Lonza

12-611F

Фетальная бычья сыворотка

Atlanta Biologicals

S11150

Gentamycin Sulfate

Lonza Biological Sciences

17-518

Альбумин, бычья сыворотка

Calbiochem

12659

CAS# 9048-46-8

Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% раствор)

Pierce

28314

CAS# 9002-93-1

HEPES

J.T Baker

4153-01

CAS# 75277-39-3

Magnesium Chloride

VWRp align="center">BDH0244-500G

CAS# 7791-18-6

D-(+)-Glucose

Biomedicals

152527

CAS# 50-99-7

Кристалл хлорида калия

J.T Baker

3046-01

CAS# 7447-40-7

Дигирдат хлорида кальция

Acros Organics

207780010

CAS# 10035-04-8

Glycine

Sigma

G8898

CAS# 56-40-6

4-Methylumbelliferyl-N-ацетил-β-D-глюкозаминид (4-MU)

EMD Biosciences

474502-250MG

CAS # 37067-30-4

Wrap in foil – светочувствительный

Anti-DNP Mouse IgE

Sigma

D8406

Реагент имеет концентрацию 1 мг/мл. Аликвот 25 &микро; l  реагента в отдельные микроцентрифужные пробирки и парапленку. Хранить аликвоты при -20°С; C, которые не используются, и хранят аликвоту, которая используется при 2-8 °°; C не дольше 1 месяца.

DNP-BSA

Подарок от доктора Дэвида Холовки и доктора Барбары Бэрд, Корнельский университет<p align="center">

Предложите: life technologies DNP-BSA catalog# A23018

Кальциевый ионофор A23187

Sigma

C75-22-1mg

Ионофор был получен из порошка путем добавления 400 µ l  свежего 100% ДМСО в ионофорный флакон и выдерживается при -20°С; C

Примечание: мы успешно использовали ионофор после истечения срока годности 3 месяца

DMSO

Sigma

D2650

CAS# 67-68-5

<		p align="center">

Уксусная кислота

VWRp align="center">BDH3094-2

CAS# 64-19-7

Безводный карбонат натрия

Sigma

222321

CAS# 497-19-8

Sodium Chloride

Sigma

71376

CAS# 7647-14-5

Соляная кислота

VWR

BDH3026

CAS# 7647-01-0

Эталонный буфер, pH 7

VWRp align="center">BDH5046

Буфер сравнения, pH 10

VWRp align="center">BDH5072

Буфер сравнения, pH 4

VWRp align="center">BDH5018

pN электрод решение для хранения

VWRp align="center">14002-828

Equipment:

DU 7500 Spectrophotometer

Beckmann

больше не продано

Считыватель планшетов Synergy 2

использует программное обеспечение для сбора и анализа данных микропланшетов Gen5

BioTek

модуль S

Гематоцитометр

Hausser Scientific

3110

>

7 x  7 CER HOT/STIR 120 V

Комбинированная горячая пластина/магнитная мешалка

VWRp align="center">97042-634

Centrifuge

Eppendorf

5430

Водяная баня для культуры тканей

VWRp align="center">Model# 89032-206

<		p align="center">

Кабинет биологической безопасности для культуры тканей

SafeGARD (капюшон TC)

The Baker Company

Model# SG403A-HE

Инкубатор для культуры тканей

ThermoScientific

Model# 3598

<		p align="center">

Pipetman

VWRp align="center">

Диапазон: P2-P1000

Balance

Mettler Toledo

Model# AG204

ph meter

Symphony/VWRp align="center">Model# SB70P

Pipet-Aid

Drummond Scientific

4-000-100

Combitip dispenser

Eppendorf

4981 000.019

Recipes:

Ацетатный буфер, pH 4,4

Сделайте 0,12 М уксусной кислоты и титруйте до pH 4,4 с 10 N NaOH. Это 5,3 мл ледяной уксусной кислоты на 1 л воды MilliQ: (1 л)*(0,12 моль/л)*(60 г/моль)*(мл/1,37 г) = 5,3 мл, потому что плотность ледяного составляет 1,37 г/мл

Стерильный фильтр в автоклавную стеклянную бутылку

Субстрат (4-MU)

Sigma M-2133, 250 мг, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Хранить при -20°С; C Бульон: 0,12 М в ДМСО (46 мг в 1 мл ДМСО), теплый до 37 °°; C, вихревой, ультразвуком 10 мин. в гидроакустическом аппарате с теплой водой, снова вихрь

Для каждого эксперимента приготовьте свежий раствор субстрата в ацетатном буфере (100-кратное разведение), для конечной концентрации 1,2 мМ в ацетатном буфере

Буфер карбоната глицина, pH 10

26,7 г глицина 47,1 г безводного карбоната натрия Добавьте деионизированную воду на 1 л, и отрегулируйте pH до 10

Стерильный фильтр в автоклавный стеклянный флакон

Tyrodes (2 L), pH 7,4

135 mM NaCl: 15,78 г (или 270 мл 1 M) 5 mM KCl: 10 мл 1 M stock 1,8 мМ CaCl2: 7,20 мл 0,5 М стока 1 мМ MgCl<суб>2: 4,00 мл 0,5 М бульон 5,6 мМ глюкоза: 2,02 г (11,2 мл 1 М) 20 мМ HEPES: 40 мл 1 М сток Используя концентрированный HCl pH от ~9,7-7,4<p align="center">Стерильный фильтр в автоклавный стеклянный флакон

RBL Клеточные среды

Разморозьте бычью сыворотку плода (FBS, хранящуюся при -20°; В) в течение примерно 4 часов в 37°С; C Водяная баня Следуйте стандартной стерильной технике Достаньте 1 л минимально необходимой среды (MEM) с L-глутамином (с Earle' Слейте немного МЭМ, чтобы получить 800 мл МЭМ, добавьте 200 мл теплого FBS Добавьте 1 мл антибиотика гентамицина сульфата в 1 л среды с помощью стерильной пипетки Используйте только бутылки со средой, которые были автоклавированы и помечены только для использования в клеточных культурах.

Стерильный фильтр (0,2 мм) в автоклавную стеклянную бутылку

Использованный пластиковый материал:

200 &; l  Одноразовые стерильные наконечники для пипеток с градуировкой в штативе 96

VWRp align="center">53509-009

полипропилен

1,000 &; l  Стерильные аэрозольные наконечники для пипеток с HighRecovery

VWRp align="center">89003-420

полиэтилен

10 &; l  микронаконечник стерильный с низким связыванием

VWRp align="center">14217-704

полипропилен

Одноразовые/конические микроцентрифужные пробирки для высоких перегрузок

VWRp align="center">20170-038

полипропилен

Одноразовый/градуированный/конический/стерильный 50 мл  пробирки центрифуги с завинчивающимися крышками

VWRp align="center">21008-178

полипропилен

Одноразовые/градуированные/конические/стерильные 15 мл  центрифужные пробирки с завинчивающимися крышками

VWRp align="center">21008-103

полипропилен

CELLSTAR Tissue Culture Processed T-25 Flask with Filter Cap

Greiner Bio One

690175

полистирол

CELLSTAR Tissue Culture Trained T-75 Flask with Filter Cap

Greiner Bio One

658175

полистирол

CELLSTAR 10 ml  Серологическая пипетка в бумажной/пластиковой упаковке

Greiner Bio One

607180

полистирол

CELLSTAR 2 ml  Серологическая пипетка в бумажной/пластиковой упаковке

Greiner Bio One

710180

<		p align="center">полистирол

CELLSTAR 5 ml  Серологическая пипетка в бумажной/пластиковой упаковке

Greiner Bio One

606180

полистирол

CELLSTAR 25 ml  Серологическая пипетка в бумажной /пластиковой упаковке

Greiner Bio One

760180

полистирол

1 см кюветы

N/A

N/A

полистирол

CELLSTAR, 96W микропланшет, обработанный тканевой культурой, черный, с крышкой

96-луночная пластина

Greiner Bio One

655086

полистирол

Combitips

Eppendorf

022266501

Полипропилен/

полиэтилен

<<<<<<<<<<<<<<<<<

Ссылки

  1. Naal, R., Tabb, J., Holowka, D., Baird, B. In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosens. Bioelectron. 20, 791-796 (2004).
  2. Palmer, R. K., et al. Antibacterial agent triclosan suppresses RBL-2H3 mast cell function. Toxicol. Appl. Pharmacol. 258, 99-108 (2012).
  3. Fewtrell, C., Kessler, A., Metzger, H. Comparative aspects of secretion from tumor and normal mast cells. Adv. Inflam. Res. 1, 205-221 (1979).
  4. Metzger, H., et al. The receptor with high-affinity for immunoglobulin-E. Annu. Rev. Immunol. 4, 419-470 (1986).
  5. Seldin, D. C., et al. Homology of the rat basophilic leukemia-cell and the rat mucosal mast-cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3871-3875 (1985).
  6. Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunological release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast-cells. J. Immunol. 123, 1445-1450 (1979).
  7. Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Waaler, S. M., Rolla, G. Triclosan inhibits histamine-induced inflammation in human skin. J. Clin. Periodontol. 22, 423-426 (1995).
  8. Barkvoll, P., Rolla, G. Triclosan reduces the clinical symptoms of the allergic patch test reaction (APR) elicited with 1-percent nickel sulfate in sensitized patients. J. Clin. Periodontol. 22, 485-487 (1995).
  9. Tan, W. P., Suresh, S., Tey, H. L., Chiam, L. Y., Goon, A. T. A randomized double-blind controlled trial to compare a triclosan-containing emollient with vehicle for the treatment of atopic dermatitis. Clin. Exp. Dermatol. 35, e109-e112 (2010).
  10. Sporik, R., Kemp, A. S. Topical triclosan treatment of atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 861(1997).
  11. Wohlrab, J., Jost, G., Abeck, D. Antiseptic efficacy of a low-dosed topical triclosan/chlorhexidine combination therapy in atopic dermatitis. Skin Pharmacol. Physiol. 20, 71-76 (2007).
  12. Wong-Wah-Chung, P., Rafqah, S., Voyard, G., Sarakha, M. Photochemical behaviour of triclosan in aqueous solutions: Kinetic and analytical studies. J. Photochem. Photobiol. A Chem. 191, 201-208 (2007).
  13. Blank, U., Essig, M., Scandiuzzi, L., Benhamou, M., Kanamaru, Y. Mast cells and inflammatory kidney disease. Immunol. Rev. 217, 79-95 (2007).
  14. Gri, G., et al. Mast cell: an emerging partner in immune interaction. Frontiers in Immunology. 3, (2012).
  15. Kuby, J. Immunology. , W.H. Freeman. (1997).
  16. Farrell, D. J., et al. Intrahepatic mast-cells in chronic liver-diseases. Hepatology. 22, 1175-1181 (1995).
  17. Cookson, W. The alliance of genes and environment in asthma and allergy. Nature. 402, 5-11 (1999).
  18. Ferris, C. D., Huganir, R. L., Supattapone, S., Snyder, S. H. Purified inositol 1,4,5-triphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles. Nature. 342, 87-89 (1989).
  19. Foreman, J. C., Mongar, J. L., Gomperts, B. D. Calcium ionospheres and movement of calcium ions following physiological stimulus to a secretory process. Nature. 245, 249-251 (1973).
  20. Siraganian, R. P., Kulczycki, A., Mendoza, G., Metzger, H. Ionophore A-23187 induced histamine-release from mast-cells and rat basiphil leukemia (RBL-1) cells. J. Immunol. 115, 1599-1602 (1975).
  21. Demo, S. D., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry. 36, 340-348 (1999).
  22. Hutchinson, L. M., et al. Inorganic arsenite inhibits IgE receptor-mediated degranulation of mast cells. J. Appl. Toxicol. 31, 231-241 (2011).
  23. Dann, A. B., Hontela, A. Triclosan: environmental exposure, toxicity and mechanisms of action. J. Appl. Toxicol. 31, 285-311 (2011).
  24. Jones, R. D., Jampani, H. B., Newman, J. L., Lee, A. S. Triclosan: A review of effectiveness and safety in health care settings. Am. J. Infect. Control. 28, 184-196 (2000).
  25. Levy, C. W., et al. Molecular basis of triclosan activity. Nature. 398, 383-384 (1999).
  26. McMurry, L. M., Oethinger, M., Levy, S. B. Triclosan targets lipid synthesis. Nature. 394, 531-532 (1998).
  27. Allmyr, M., Adolfsson-Erici, M., McLachlan, M. S., Sandborgh-Englund, G. Triclosan in plasma and milk from Swedish nursing mothers and their exposure via personal care products. Sci. Total Environ. 372, 87-93 (2006).
  28. Allmyr, M., et al. The influence of age and gender on triclosan concentrations in Australian human blood serum. Sci. Total Environ. 393, 162-167 (2008).
  29. Geens, T., Neels, H., Covaci, A. Distribution of bisphenol-A, triclosan and n-nonylphenol in human adipose tissue, liver and brain. Chemosphere. 87, 796-802 (2012).
  30. Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in US streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environ. Sci. Technol. 36, 1202-1211 (2002).
  31. Black, J. G., Howes, D. Percutaneous absorption of triclosan from toilet preparations. J. Soc. Cosmet. Chem. 26, 205-215 (1975).
  32. Black, J. G., Howes, D., Rutherford, T. Percutaneous absorption and metabolism of Irgasan DP300. Toxicology. 3, 33-47 (1975).
  33. Kanetoshi, A., et al. Acute toxicity, percutaneous-absorption and effects on hepatic mixed-function oxidase activities of 2,4,4'-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether (Irgasan(R) DP300) and its chlorinated derivatives. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 23, 91-98 (1992).
  34. Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Eric, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of Triclosan in man. J. Dental Res. 81, 0937(2002).
  35. Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Erici, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of triclosan following oral ingestion in humans. J. Toxicol. Environ. Health A. 69, 1861-1873 (2006).
  36. Lin, Y. J. Buccal absorption of triclosan following topical mouthrinse application. Am. J. Dent. 13, 215-217 (2000).
  37. Queckenberg, C., et al. Safety of Triclosan after Dermal Administration. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 570-572 (2010).
  38. Breneman, D. L., Hanifin, J. M., Berge, C. A., Keswick, B. H., Neumann, P. B. The effect of antibacterial soap with 1.5% triclocarban on Staphylococcus aureus in patients with atopic dermatitis. Cutis. 66, 296-300 (2000).
  39. Udoji, F., Martin, T., Etherton, R., Whalen, M. M. Immunosuppressive effects of triclosan, nonylphenol, and DDT on human natural killer cells in vitro. J. Immunotoxicol. 7, 205-212 (2010).
  40. Ahn, K. C., et al. In vitro biologic activities of the antimicrobials triclocarban, its analogs, and triclosan in bioassay screens: Receptor-based bioassay screens. Environ. Health Perspect. 116, 1203-1210 (2008).
  41. Foran, C. M., Bennett, E. R., Benson, W. H. Developmental evaluation of a potential nonsteroidal estrogen: triclosan. Mar. Environ. Res. 50, 153-156 (2000).
  42. Gee, R. H., Charles, A., Taylor, N., Darbre, P. D. Oestrogenic and androgenic activity of triclosan in breast cancer cells. J. Appl. Toxicol. 28, 78-91 (2008).
  43. Helbing, C. C., van Aggelen, G., Veldhoen, N. Triclosan Affects Thyroid Hormone-Dependent Metamorphosis in Anurans. Toxicol. Sci. 119, 417-418 (2011).
  44. Ishibashi, H., et al. Effects of triclosan on the early life stages and reproduction of medaka Oryzias latipes and induction of hepatic vitellogenin. Aquat. Toxicol. 67, 167-179 (2004).
  45. Kumar, V., Chakraborty, A., Kural, M. R., Roy, P. Alteration of testicular steroidogenesis and histopathology of reproductive system in male rats treated with triclosan. Reprod. Toxicol. 27, 177-185 (2009).
  46. Matsumura, N., et al. Effects of nonylphenol and triclosan on production of plasma vitellogenin and testosterone in male South African clawed frogs (Xenopus laevis. Biol. Pharm. Bull. 28, 1748-1751 (2005).
  47. Veldhoen, N., et al. The bactericidal agent triclosan modulates thyroid hormone-associated gene expression and disrupts postembryonic anuran development. Aquat. Toxicol. 80, 217-227 (2006).
  48. Raut, S. A., Angus, R. A. Triclosan has endocrine-disrupting effects in male western mosquitofish, Gamusia affins. Environ. Toxicol. Chem. 29, 1287-1291 (2010).
  49. Park, H. G., Yeo, M. K. The toxicity of triclosan, bisphenol A, bisphenol A diglycidyl ether to the regeneration of cnidarian, Hydra magnipapillata. Mol. Cell. Toxicol. 8, 209-216 (2012).
  50. Vandhanaa, S., Deepa, P. R., Aparna, G., Jayanthi, U., Krishnakumar, S. Evaluation of suitable solvents for testing the anti-proliferative activity of triclosan - a hydrophobic drug in cell culture. Indian J. Biochem. Biophys. 47, 166-171 (2010).
  51. Skaare, A. B., Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Rolla, G. Does the nature of the solvent affect the anti-inflammatory capacity of triclosan? An experimental study. J. Clin. Periodontol. 24, 124-128 (1997).
  52. Rufli, H. Introduction of moribund category to OECD fish acute test and its effect on suffering and LC50 values. Environ. Toxicol. Chem. 31, 1107-1112 (2012).
  53. Hutchinson, T. H., Shillabeer, N., Winter, M. J., Pickford, D. B. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Aquat. Toxicol. 76, 69-92 (2006).
  54. Toivari, M., Maki, T., Suutarla, S., Eklund, K. K. Ethanol inhibits IgE-induced degranulation and cytokine production in cultured mouse and human mast cells. Life Sci. 67 (00), 2795-2806 (2000).
  55. Kennedy, R. H., Pelletier, J. H., Tupper, E. J., Hutchinson, L. M., Gosse, J. A. Estrogen mimetic 4-tert-octylphenol enhances IgE-mediated degranulation of RBL-2H3 mast cells. J. Toxicol. Environ. Health A. 75, 1451-1455 (2012).
  56. Fort, D. J., et al. Triclosan and Thyroid-Mediated Metamorphosis in Anurans: Differentiating Growth Effects from Thyroid-Driven Metamorphosis in Xenopus laevis. Toxicol. Sci. 121, 292-302 (2011).
  57. Fiori, J., et al. Macromolecular Symposia. in Brazilian Polymer Congress. Pinto, J. C. 299-300, 26-33 (2011).
  58. Mezcua, M., et al. Evidence of 2,7/2,8-dibenzodichloro-p-dioxin as a photodegradation product of triclosan in water and wastewater samples. Anal. Chim. Acta. 524, 241-247 (2004).
  59. Soto, E. O., Pecht, I. A monoclonal-antibody that inhibits secretion from rat basophilic leukemia-cells and binds to a novel membrane component. Journal of Immunology. 141, 4324-4332 (1988).
  60. Pierini, L., Harris, N. T., Holowka, D., Baird, B. Evidence supporting a role for microfilaments in regulating the coupling between poorly dissociable IgE-Fc epsilon RI aggregates and downstream signaling pathways. Biochemistry. 36, 7447-7456 (1997).
  61. Aketani, S., Teshima, R., Umezawa, Y., Sawada, J. Correlation between cytosolic calcium concentration and degranulation in RBL-2H3 cells in the presence of various concentrations of antigen-specific IgEs. Immunol. Lett. 75, 185-189 (2001).
  62. Koo, N., Kim, K. M. Distinct effects on M-2-type pyruvate kinase are involved in the dimethylsulfoxide-induced modulation of cellular proliferation and degranulation of mast cells. Arch. Pharmacal Res. 32, 1637-1642 (2009).
  63. Senyshyn, J., Baumgartner, R. A., Beaven, M. A. Quercetin sensitizes RBL-2H3 cells to polybasic mast cell secretagogues through increased expression of Gi GTP-binding proteins linked to a phospholipase C signaling pathway. J. Immunol. 160, 5136-5144 (1998).
  64. Yang, C. Z., Yaniger, S. I., Jordan, V. C., Klein, D. J., Bittner, G. D. Most Plastic Products Release Estrogenic Chemicals: A Potential Health Problem that Can Be Solved. Environ. Health Perspect. 119, 989-996 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

клетки RBL-2H3анализ с триклозаномфлуоресценция в микропланшетебета-гексозаминидазаУФ-видимая спектрофотометрияприготовление водного растворастимуляция ионофором кальциясенсибилизация антигеномвысокопроизводительный скрининг
Микропланшет анализа для оценки химического воздействия на RBL-2H3 дегрануляцию тучных клеток: Влияние триклозан без использования органического растворителя
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.