Мы демонстрируем протокол культивирования клеток для непосредственного изучения нейрональных и глиальных компонентов энтеральной нервной системы. Из миентерального сплетения взрослой мыши получают смешанную культуру нейронов и глии на покровных листах, что дает возможность исследовать отдельные функции нейронов и глии методами электрофизиологии, иммуногистохимии и т.д.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Энтеральной нервной системы является обширная сеть нейронов и глии по всей длине желудочно-кишечного тракта, что функционально управляет желудочно-кишечного тракта. Порядок выделения и культуры смешанной популяции нейронов и глии от мышечно-кишечного сплетения описана. Первичные культуры может поддерживаться в течение более 7 дней, со связями среди развивающихся нейронов и глии. Продольная полоса мышцы с мышечно-кишечного сплетения прилагается отделяют от основной круговой мышцы подвздошной кишки или толстой кишки мышей и подвергается ферментативному расщеплению. В стерильных условиях, изолированных нейронов и глии населения сохраняются в осадок после центрифугирования и высевали на покровные. В течение 24-48 ч, происходит рост аксонов и нейронов могут быть идентифицированы по пан-нейронов маркеров. После двух дней в культуре, изолированных нейронов потенциалы действия огня как заметил исследования патч зажим. Кроме того, кишечные глии может быть IDENTIFIED окрашиванием GFAP. Сеть нейронов и глии в тесном аппозиции образуется в течение 5 - 7 дней. Кишечные нейронов может быть индивидуально и непосредственно изучены с помощью таких методов, как иммуногистохимии, электрофизиологии, кальций изображений и одноклеточные ПЦР. Кроме того, эта процедура может быть выполнена в генетически модифицированных животных. Эта методика прост в исполнении и недорого. В целом, это протокол предоставляет компоненты кишечных нервной системы легко манипулировать таким образом, что можно лучше обнаружить функциональность ЭНС в нормальных и болезненных состояний.
Введение
Энтеральной нервной системы (ENS) является обширная сеть нервов и глии, которая работает по всей длине желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Функционально ENS контролирует все аспекты пищеварения, в том числе перистальтику, всасывание жидкости / секреции, ощущение стимулов, и т.д. (см. обзор 1). Она содержит более 500 млн нейронов, более чем обнаружено в спинном мозге, а также содержит каждый класс нейротрансмиттеров в головном мозге. Кроме того, ЭНС уникальна тем, что он может функционировать рефлекторно без участия центральной нервной системы 2. Понимание ENS имеет решающее значение не только для понимания нормальной физиологической роли,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры по уходу за животными и эксперименты были одобрены и одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Университете Содружества Вирджинии.
1. Приготовление стерильных стеклянных покровных покрытий с покрытием из поли-D-лизина и ламинина в 24-луночных планшетах
- Все процедуры для шага 1 выполняются в стерильных условиях; под колпаком и со стерильными реагентами. Стеклянные покровные стекла и двойная деионизированная вода (ddH2O) должны быть предварительно стерилизованы. Подготовка пластин может быть выполнена за две недели до выделения нейронов.
- Под капюшон с помощь....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сразу после выделения клеток из LMMP нейроны и другие типы клеток не будут четко различимы. Могут наблюдаться живые округлые клетки с неопределенным фенотипом, а также тканевой детрит из не полностью переваренных фрагментов ткани и соединительной ткани. Этот клеточный мусор не представляет проблемы и будет в значительной степени удален при первой замене среды через два дня. Не пытайтесь очистить предметные стекла до этого времени, так как вместе с ним будут удалены и здоровые жизнеспособные клетки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Используемые животные
Этот протокол был оптимизирован для швейцарских мышей Webster. Тем не менее, этот метод легко адаптируется к другим мелким млекопитающим, таким как крысы и к другим линиям мышей. Мы успешно выполнили предварительные выделения у мышей C57 и нокауты μ-опиоидных рецепторов. Тем не менее, также возможно, что другие линии мышей могут быть проблематичными из-за морфологических изменений в желудочно-кишечном тракте. Кроме того, существуют известные различия между линиями мышей (C57.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что никаких серьезных конкурирующих интересов не существует.
Благодарности
Грант Национального института здравоохранения DA024009, DK046367 & T32DA007027.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glass (диаметр 12 мм) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Поли-D-лизин | Sigma | P6407- 5 мг | |
| 24-луночный планшет для клеточной культуры | CELLTREAT | 229124 | Можно использовать любую марку |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Может готовиться в лаборатории | ||
| 15 мл Стерильная центрифужная пробирка | Greiner Bio-one | 188261 | Можно использовать любую марку |
| 50 мл Стерильная центрифужная пробирка | Greiner Bio-one | 227261 | Можно использовать любую марку |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58,44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74,55 |
| 2PO4 ,2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| глюкоза Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 | |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 медиа | Gibco | 11330 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | Можно использовать |
| антибиотик/антимикотик любой марки 100x жидкость | Gibco | 15240-062 | |
| Нейробазал А медиа | Gibco | 10888 | |
| 200 мМ L-глутамин | Gibco | 25030164 | |
| Глиальный нейротрофический фактор (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Остроконечные ножницы для препарирования | Fisher Scientific | 8940 | Можно использовать |
| щипцы для рассечения тканей | Fisher Scientific | 13-812-41 | |
| аппликаторы с ватными наконечниками | Fisher Scientific | 23-400-101 | Можно использовать любую марку |
| 250 мл Градуированный стеклянный стакан | Fisher | Scientific FB-100-250 | Можно использовать любую марку |
| 2 л Стеклянная колба Erlenmyer | Fisher Scientific | FB-500-2000 | Можно использовать любую марку |
| Пластиковый стержень (детская кисть для рисования) | Crayola | 05 3516 | Можно использовать любую марку |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 мл Leur-lock Шприц | Becton Dickinson | 309604 | Можно использовать любую марку |
| 21 г x 1 1/2 дюйма. Игла для подкожных инъекций | Becton Dickinson | 305167 | Можно использовать любую марку |
| коллагеназы типа 2 | Worthington | LS004174 | |
| Бычий сывороточный альбумин | Американский биоаналитический | AB00440 | |
| 2 мл Микроцентрифуга Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | Можно использовать любую марку |
| Nitrex Mesh 500 &микро; M | Elko Filtering Co | 100560 | Может использовать любую марку |
| Набор пипеток | Fisher Scientific | 21-377-328 | Может использовать любую марку |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | Может использовать любую марку |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Шкаф биологической безопасности (капюшон для клеточных культур) | Nuaire | NU-425-400 | Может использовать любую марка |
| 10 л Встряхивающая водяная баня | Edvotek | 5027 | Можно использовать любую марку |
| Микроцентрифуга 5417R | Eppendorf | 5417R | Можно использовать одну центрифугу большего размера с размерами адаптеров |
| Allegra 6 Series | Centrifuge Beckman Coulter | 366816 | Можно использовать любую марку |
| HuluMixer Sample Mixer | Mixer Invitrogen | 15920D | |
| Водяная рубашка AutoFlow CO2 Инкубатор | Nuiare | NU-4750 | Можно использовать любую марку |
| Аналитические весы | Mettler Toledo | XS104 | Можно использовать любую марку |
Ссылки
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
- Gershon, A. A., C....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
