Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

28.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50688

⸱

7 августа 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Pharmacology and Toxicology, Virginia Commonwealth University, 2Physiology and Biophyics, Virginia Commonwealth University

В этой статье

Краткое содержание

Мы демонстрируем протокол культивирования клеток для непосредственного изучения нейрональных и глиальных компонентов энтеральной нервной системы. Из миентерального сплетения взрослой мыши получают смешанную культуру нейронов и глии на покровных листах, что дает возможность исследовать отдельные функции нейронов и глии методами электрофизиологии, иммуногистохимии и т.д.

Аннотация

Энтеральной нервной системы является обширная сеть нейронов и глии по всей длине желудочно-кишечного тракта, что функционально управляет желудочно-кишечного тракта. Порядок выделения и культуры смешанной популяции нейронов и глии от мышечно-кишечного сплетения описана. Первичные культуры может поддерживаться в течение более 7 дней, со связями среди развивающихся нейронов и глии. Продольная полоса мышцы с мышечно-кишечного сплетения прилагается отделяют от основной круговой мышцы подвздошной кишки или толстой кишки мышей и подвергается ферментативному расщеплению. В стерильных условиях, изолированных нейронов и глии населения сохраняются в осадок после центрифугирования и высевали на покровные. В течение 24-48 ч, происходит рост аксонов и нейронов могут быть идентифицированы по пан-нейронов маркеров. После двух дней в культуре, изолированных нейронов потенциалы действия огня как заметил исследования патч зажим. Кроме того, кишечные глии может быть IDENTIFIED окрашиванием GFAP. Сеть нейронов и глии в тесном аппозиции образуется в течение 5 - 7 дней. Кишечные нейронов может быть индивидуально и непосредственно изучены с помощью таких методов, как иммуногистохимии, электрофизиологии, кальций изображений и одноклеточные ПЦР. Кроме того, эта процедура может быть выполнена в генетически модифицированных животных. Эта методика прост в исполнении и недорого. В целом, это протокол предоставляет компоненты кишечных нервной системы легко манипулировать таким образом, что можно лучше обнаружить функциональность ЭНС в нормальных и болезненных состояний.

Введение

Энтеральной нервной системы (ENS) является обширная сеть нервов и глии, которая работает по всей длине желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Функционально ENS контролирует все аспекты пищеварения, в том числе перистальтику, всасывание жидкости / секреции, ощущение стимулов, и т.д. (см. обзор 1). Она содержит более 500 млн нейронов, более чем обнаружено в спинном мозге, а также содержит каждый класс нейротрансмиттеров в головном мозге. Кроме того, ЭНС уникальна тем, что он может функционировать рефлекторно без участия центральной нервной системы 2. Понимание ENS имеет решающее значение не только для понимания нормальной физиологической роли, но понять его участие в различных невропатии, которая может быть врожденной (Гиршпрунга болезнь), приобретенных (болезнь Шагаса), вторичной по отношению к болезненных состояниях (диабетическая гастропареза), наркотиков индуцированной (синдром опиоидной кишечника) или из-за травмы (послеоперационная непроходимость кишечника) 1. Кроме того, кишечные нейроны могут быть повторноservoir для вирусных инфекций (ветряной оспы) 3. Из-за его сходства с мозгом и высокий уровень серотонина в кишечнике, препаратов, направленных на лечение центральной нервной системы дефекты часто имеют нежелательные побочные эффекты на ЭНС 2. Следует также отметить, что многие невропатии, такие как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона показывают подобные клеточные изменения в кишечных нейронов задолго до их появления в центральных нейронов, в результате чего ENS доступной моделью для изучения патогенеза этих заболеваний 4. Таким образом, полное понимание ЭНС является необходимым для понимания болезненных состояний и предотвращения / прогнозирования фармакологических побочных эффектов.

Нейроны ENS ранее были изучены в морской свинки Wholemount использованием препаратов 5-7 или культивируемых нейронах 8. Несмотря на легкость, с которой нейроны могут быть изучены в этом большого животного, эта модель имеет много ограничений, в том числеотсутствие генетически модифицированных штаммов, отсутствие реагентов, специфичных для данного вида, и высокие затраты, связанные с заказом и жилищно этим предметам. Развитие мышиной модели кишечной нервной системы имеет уникальное преимущество различных нокаут системы, широкий спектр других установленных методик, которые могут быть использованы в сочетании с методом культуры клеток, а также возможность обеспечить проверку для модели морской свинки .

ЭНС состоит из трех плексигласа, которые работают длина желудочно-кишечного тракта: внешний мышечно-кишечного сплетения (между продольной и круговой мышцы), который в основном отвечает за перистальтического действия кишечника, а также подслизистой и слизистой плексигласа ( и найти в пределах слизистой оболочки, соответственно), которые в значительной степени контролирует всасывание жидкости / секреции и обнаружение стимула 1. Этот метод начинает с выделением продольной мышцы / мышечно-кишечного сплетения (LMMP) подготовка пилингас наружным слоем мышц желудочно-кишечного тракта. Это значительно сокращает загрязнение вопросы, которые возникают, когда слизистая оболочка участвует в изоляции. В результате этого процесса является идеальным для изучения нейронным контролем моторики, а не секреторного действия ЭНС.

Метод, представленный здесь результаты в смешанной культуре кишечных нейронов и глии. По крайней мере, двух различных типов нейронов присутствуют на основе предыдущих электрофизиологических и иммуноцитохимическое наблюдения 9. Наличие глии является большим преимуществом, так как они не только важный тип клеток учиться в их собственном праве, но они способствуют выживанию кишечные нейроны 10 и поддерживают родную экспрессии рецепторов на поверхности клетки нейронов 11. Кроме того, недостатки кишечной глии может привести к нарушениям желудочно-кишечного тракта болезненных состояний, придуманный 12 "нейро-gliopathies. Таким образом, культура ENS представленные здесь Results в нескольких типов клеток, которые созрели для проведения расследования.

Преимуществами данной методики являются простота изоляции, недорогой инструмент требования, и за короткое время освоить технику опытным персоналом лаборатории. Ограничения методики включают в себя низкий общий выход ячейки из больших объемов ткани и исключения нейроны ENS из слизистой и подслизистой сплетения. Эта процедура будет очень выгодно ученым, специализирующимся в электрофизиологии, иммуногистохимии, одноклеточные ПЦР и других методов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры по уходу за животными и эксперименты были одобрены и одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Университете Содружества Вирджинии.

1. Приготовление стерильных стеклянных покровных покрытий с покрытием из поли-D-лизина и ламинина в 24-луночных планшетах

  1. Все процедуры для шага 1 выполняются в стерильных условиях; под колпаком и со стерильными реагентами. Стеклянные покровные стекла и двойная деионизированная вода (ddH2O) должны быть предварительно стерилизованы. Подготовка пластин может быть выполнена за две недели до выделения нейронов.
  2. Под капюшон с помощью стерильных щипцов поместите автоклавные стеклянные покровные стекла в 12 лунок 24-луночного планшета.
  3. Заранее подготовьте поли-D-лизиновый бульон. Добавьте 50 мл стерильного ddH2O к 5 мг поли-D-лизина. Вортекс и хранить в 3 мл аликвот при температуре -20 °C. Разморозьте аликвоты перед использованием.
  4. Для окончательной концентрации поли-D-лизина на 25 см2: пипетку 80 мкл поли-D-лизина на верхнюю часть каждого стеклянного покровного стекла (2 см2). Дайте раствору отстояться в течение 10 минут.
  5. Удалите поли-D-лизин с помощью вакуума и промойте покровные стекла 3 раза стерильным ddH2O.
  6. Дайте тарелкам высохнуть не менее 2 часов под капотом.
  7. Пластины можно хранить при температуре 4 °C или -20 °C перед нанесением ламининового покрытия.
  8. Заранее приготовьте запас ламинина. Разморозьте ламинин на льду и держите на льду во время использования. Разбавить до концентрации 50 мкг/мл; обратите внимание на концентрацию лота; Каждый лот будет отличаться. В зависимости от концентрации партии в каждый флакон ламинина добавляется примерно 20 мл ddH2O. Аликвоту (5 мл) и хранить при температуре -80 °C. Разморозьте аликвоты на льду перед использованием.
  9. Покровное покрытие покрывающим листом содержит 5 мкг/см2 ламинина; пипетка 200 мкл запаса ламинина на каждом покровном листе.
  10. Инкубировать раствор ламинина на покровных листах в течение 1 часа.
  11. Отсадите оставшийся раствор ламинина и промойте покровные стекла один раз с помощью ddH2O. Избегайте соскабливания поверхности покровных стекол.
  12. Храните тарелки при температуре 4 °C до двух недель.

2. Заблаговременная подготовка растворов для выделения нейронов

  1. Приготовьте раствор Кребса (в мМ: 118 NaCl, 4,6 KCl, 1,32PO4, 1,2 MgSO4, 25 NaHCO3, 11 глюкозы и 2,5 CaCl2). Поместите 13,79 г NaCl (FW 58.44), 0,686 г KCl (FW 74.55), 0,312 г2PO4 (FW 120), 0,289 г MgSO4 (FW 120.4), 4,20 г NaHCO3 (FW 84.01), 3,96 г глюкозы (FW 180.2) и 0,555 г CaCl2 (FW 111) в 2 л ddH20. Охладите до 4 °C.
  2. Приготовьте промывочную среду (среда F12 с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и антибиотиком/антимикотиком): Во флакон F12 объемом 500 мл добавьте 50 мл FBS и 5 мл антибиотика/антимикотика 100x Liquid (Gibco).
  3. Приготовьте среду кишечных нейронов (нейробазальная среда А с B-27, 2 мМ L-глутамина, 1% FBS, 10 нг/мл, глиальный нейротрофический фактор (GDNF) и антибиотик/антимикотик 100x жидкость). Чтобы сделать бульон GDNF, добавьте 1 мл ddH2O к 10 мкг GDNF и заморозьте обратно в 50 мкл аликвот, храните при -80 °C. Для флакона объемом 50 мл полной нейронной среды смешайте 47,5 мл нейробазальной среды А, 1 мл B-27 (50x), 500 мкл FBS, 500 мкл 200 мМ L-глутамина (Gibco), 50 мкл запаса GDNF и 500 мкл антибиотика/антимикотика 100x жидкости. Среда изготавливается небольшими партиями по 50 мл, чтобы обеспечить свежесть GDNF и избежать загрязнения большого количества этой дорогостоящей смеси клеточных сред.

3. Сбор препарата для продольных мышц/миентерального сплетения (LMMP) у мышей

  1. Перед проведением экспериментов на животных должна быть принята соответствующая национальная и институциональная этика. Взрослые швейцарские мыши породы Вебстер весом более 25 г (обычно в возрасте более 8 недель) размещаются в группах по 6 особей перед началом экспериментов. Ткани двух мышей используются для выделения подвздошных энтеральных нейронов и глии, а ткани трех мышей используются для выделения клеток толстой кишки.
  2. Подготовьте операционное поле. Соберите небольшие хирургические ножницы, щипцы под углом, ватные палочки, три стеклянных стакана объемом 200 мл и стеклянный/пластиковый стержень (кисть). Убедитесь, что все принадлежности тщательно вымыты и прополосканы перед использованием, чтобы свести к минимуму загрязнение. Этот шаг можно выполнить за день до эксперимента.
  3. Поместите раствор Кребса на лед и пузыри с карбогеном (95% кислорода, 5%CO2) не менее чем на 30 минут для стабилизации pH.
  4. Включите различное оборудование и нагрейте химикаты для стабилизации до желаемой температуры; нагрейте водяную баню (бани) до 37 °C, охладите центрифугу до 4 °C, поместите сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS) и 0,5% трипсина в водяную баню (37 °C). Полные нейронные среды и промывочные материалы должны оставаться в холодильнике.
  5. Поместите 150 мл ледяного пузырькового Krebs в три стеклянные стакана объемом 200 мл с пометками «грязный», «чистый» и «LMMP». Пузырчатый стакан с маркировкой «LMMP» с карбогеном.
  6. После одобрения комитета по этике следует усыпить мышей путем вывиха шейки матки или удушьяСО2
    7. .
  7. Поместите мышь в положении лежа на операционную поверхность, очистите кожу 70% EtOH и подтяните кожу живота с помощью щипцов. С помощью ножниц откройте брюшную полость и обнажите внутренние органы пищеварения.
  8. Удалите длину желудочно-кишечного тракта, приподняв участок подвздошной кишки и обнажив ее брыжейку. Прорежьте брыжейку ножницами, чтобы аккуратно удалить и распутать подвздошную и толстую кишку, стараясь не вытянуть брыжейку из подвздошной кишки/толстой кишки.
  9. После того, как вся длина кишечника будет распущена, удалите подвздошную кишку, разрезав ее дистальнее желудка и проксимальнее слепой кишки. Примечание: эта процедура также может быть выполнена с тканью толстой кишки путем удаления толстой кишки от дистального к слепой кишке до проксимального к анальному отверстию.
  10. Ткани могут быть дополнительно разделены на проксимальный и дистальный отделы ободочной кишки, а также тощую и подвздошную кишку. Остальная часть этой процедуры будет касаться изоляции подвздошной кишки; процедура аналогична и для выделения толстой кишки LMMP. Поместите всю подвздошную кишку в стеклянную емкость с ледяным Кребсом с пометкой «грязный».
  11. Создайте инструмент для очистки подвздошной кишки; затупите большую иглу 20 G с помощью подпиливающего камня и прикрепите ее к большому шприцу (10 мл), содержащему ледяной Кребс.
  12. Очистите подвздошную кишку от каловых масс, разрезав подвздошную кишку на три или более крупных частей. Удалите подвздошную часть из стакана и поместите затупленную иглу в конец подвздошной кишки.
  13. Аккуратно пропустите Кребса через кишечную часть до тех пор, пока все фекалии не будут удалены в отдельный контейнер для отходов. Поместите очищенную часть в контейнер Krebs с пометкой «чистый». Повторяйте до тех пор, пока не будет очищена вся подвздошная кишка.
  14. Чтобы удалить LMMP, разрежьте подвздошную кишку на небольшие сегменты, примерно 2 - 4 см. Поместите сегмент подвздошной кишки на пластиковый или стеклянный стержень; подвздошная кишка должна плотно прилегать, но не быть рыхлой или тугой (~2 мм). Начните удаление LMMP с осторожного удаления кусочков брыжейки, все еще прикрепленных к желудочно-кишечному тракту (ЖКТ) с помощью щипцов. Предотвратите вращение желудочно-кишечного тракта вокруг стержня, аккуратно прикрепив трубку к стержню с помощью большого пальца.
  15. Отделите LMMP от нижележащей круговой мышцы; сначала аккуратно потрите край щипцов по всей линии, где была прикреплена брыжейка, сверху вниз сегмента, аккуратно создавая разрыв в продольной мышце. Затем аккуратно отденьте продольную мышцу ватным тампоном, смоченным Кребсом.
  16. Начните с верхней части щели в продольной мышце и дразните ее с помощью самого легкого горизонтального движения, оказывая очень легкое давление, пока продольная мышца не начнет отделяться от круговой мышцы; проделайте это вниз по всей полосе вдоль точки прикрепления брыжейки.
  17. Затем осторожно начните работать вокруг желудочно-кишечного тракта, двигаясь сверху вниз и обратно, по мере того как продольная мышца медленно отделяется от круговой мышцы по всему периметру трубки. По завершении LMMP естественным образом отсоединится от остальной части желудочно-кишечного тракта.
  18. Поместите полученную тонкую полоску продольной мышцы в стакан с надписью «LMMP». Повторите для всех сегментов.
  19. После того, как все полоски LMMP были собраны с одной мыши, повторите процедуру для любых других используемых мышей. Тщательно промойте «грязные» и «чистые» мензурки перед повторным использованием.
  20. Промойте LMMP 3x для удаления биологических загрязнений. Наполните три пробирки Eppendorf объемом 2 мл ледяным Krebs. Поместите полоски LMMP в первую пробирку и вращайте в течение 30 секунд при 356 x g в центрифуге, охлажденной до 4 °C. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и переместите полоски LMMP в следующую чистую пробирку, заполненную Кребсом. Повторите эту процедуру для каждой оставшейся трубки.

4. Дайджест LMMP

  1. Приготовьте раствор для пищеварения, поместив 13 мг коллагеназы типа 2 и 3 мг БСА в 10 мл раствора Кребса.
  2. Поместите сегменты промытого LMMP в раствор для сбраживания и ножницами нарежьте LMMP на мелкие кусочки.
  3. Варить LMMP в течение 60 минут при температуре 37 °C на водяной бане с помощью шейкера, слегка взбивая карбогеном.
  4. После завершения разложения соберите клетки центрифугированием в течение 8 мин при 356 х г в центрифуге, охлажденной до 4 °С.
  5. С этого момента все процедуры должны проводиться в стерильных условиях в колпаке для клеточных культур! Все реактивы и емкости должны быть стерилизованы перед использованием.
  6. Во время центрифугирования приготовьте 0,05% раствор трипсина, поместив 1 мл подогретого 0,25% трипсина и 4 мл подогретого HBSS в стерильную пробирку для клеточной культуры объемом 50 мл.
  7. После центрифугирования удалить и выбросить надосадочную жидкость. Не используйте пылесос; Это, скорее всего, приведет к всасыванию клеточной гранулы из-за низких скоростей центрифугирования. Осторожно извлеките клеточную гранулу и поместите в чистую пробирку с 5 мл 0,05% раствора трипсина.
  8. Растворить клетки в 0,05% растворе трипсина на водяной бане при температуре 37 °С с встряхиванием в течение 7 мин. Не превышайте 7 минут общего лечения трипсином, иначе нейроны погибнут.
  9. Нейтрализовать трипсин 10 мл холодного средства для полоскания после 7 минут обработки трипсином.
  10. Центрифугируйте ячейки в течение 8 мин при 356 x g. Извлеките и выбросьте носитель.
  11. Во время центрифугирования сбалансируйте секцию стерилизованной сетки Nitex на стерильной пробирке для клеточной культуры объемом 15 мл.
  12. После центрифугирования удалить и выбросить надосадочную жидкость. Мягко ресуспендируйте клеточную смесь, растирая в 3 мл полной нейронной среды. Избегайте образования пузырьков воздуха на этом этапе и на всех последующих этапах, на которых происходит растирание клеточной смеси. Все растирания должны выполняться очень аккуратно. Отфильтруйте клеточный раствор через сетку Nitex в чистую пробирку для клеточной культуры объемом 15 мл.
  13. Дополнительно: Закройте пробирку с клеточными культурами и поместите в охлаждаемый миксер Hula (или любой другой миксер, обеспечивающий вращение) с аккуратным прокатыванием и наклоном на 30 минут. Этот шаг необязателен, но рекомендуется.
  14. По желанию: После миксера Hula добавьте 2 мл холодной промывочной среды для промывки ячеек.
  15. Соберите клетки центрифугированием (8 мин, 356 х г). Удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
  16. Ресуспендируйте клетки в полной нейронной среде объемом 1 200 мкл. Аккуратно растирайте клетки с помощью пластикового наконечника для пипетки объемом 1 мл. Не образуйте пузырьков воздуха. Пипетка медленно и осторожно до тех пор, пока большая часть кусочков не будет разбита и клетки не будут суспензированы в жидкости.
  17. Добавьте 750 мкл готового фильтрующего материала в каждую из 12 лунок, содержащих стеклозащитное стекло с предварительно нанесенным покрытием, и добавьте 100 мкл раствора растиранных ячеек.
  18. Инкубируйте нейроны в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C с 5%CO2.
  19. Меняйте половину клеточных сред каждые 2 дня.
  20. Нейроны готовы к электрофизиологической регистрации через 1 - 2 дня в культуре.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сразу после выделения клеток из LMMP нейроны и другие типы клеток не будут четко различимы. Могут наблюдаться живые округлые клетки с неопределенным фенотипом, а также тканевой детрит из не полностью переваренных фрагментов ткани и соединительной ткани. Этот клеточный мусор не представляет проблемы и будет в значительной степени удален при первой замене среды через два дня. Не пытайтесь очистить предметные стекла до этого времени, так как вместе с ним будут удалены и здоровые жизнеспособные клетки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Используемые животные

Этот протокол был оптимизирован для швейцарских мышей Webster. Тем не менее, этот метод легко адаптируется к другим мелким млекопитающим, таким как крысы и к другим линиям мышей. Мы успешно выполнили предварительные выделения у мышей C57 и нокауты μ-опиоидных рецепторов. Тем не менее, также возможно, что другие линии мышей могут быть проблематичными из-за морфологических изменений в желудочно-кишечном тракте. Кроме того, существуют известные различия между линиями мышей (C57...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что никаких серьезных конкурирующих интересов не существует.

Благодарности

Грант Национального института здравоохранения DA024009, DK046367 & T32DA007027.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Reagents
Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glass (диаметр 12 мм)Fisher Scientific12-545-82 
Поли-D-лизинSigmaP6407- 5 мг 
24-луночный планшет для клеточной культурыCELLTREAT229124Можно использовать любую марку
LamininBD Biosciences354 232 
ddH2OМожет готовиться в лаборатории 
15 мл Стерильная центрифужная пробиркаGreiner Bio-one188261Можно использовать любую марку
50 мл Стерильная центрифужная пробиркаGreiner Bio-one227261Можно использовать любую марку
NaClFisher BioReagentsBP358-212MW 58,44
KClFisher BioReagentsBP366-500MW 74,55
2PO4 ,2H2OFisher ChemicalsS369-3MW137.99
MgSO4Sigma AldrichM7506-500GMW 120.4
NaHCO3Sigma AldrichS6014-5KGMW 84.01
глюкоза Fisher ChemicalsD16-1MW 180.16
CaCl22H2OSigma AldrichC5080-500GMW 147.02
F12 медиаGibco11330 
Фетальная бычья сывороткаQuality Biological Inc.110-001-101HIМожно использовать
антибиотик/антимикотик любой марки 100x жидкостьGibco15240-062 
Нейробазал А медиаGibco10888 
200 мМ L-глутаминGibco25030164 
Глиальный нейротрофический фактор (GDNF)NeuromicsPR27022 
Остроконечные ножницы для препарированияFisher Scientific8940Можно использовать
щипцы для рассечения тканейFisher Scientific13-812-41
аппликаторы с ватными наконечникамиFisher Scientific23-400-101Можно использовать любую марку
250 мл Градуированный стеклянный стаканFisherScientific FB-100-250Можно использовать любую марку
2 л Стеклянная колба ErlenmyerFisher ScientificFB-500-2000Можно использовать любую марку
Пластиковый стержень (детская кисть для рисования)Crayola05 3516Можно использовать любую марку
CarbogenAirgasUN 31565% CO2
10 мл Leur-lock ШприцBecton Dickinson309604Можно использовать любую марку
21 г x 1 1/2 дюйма. Игла для подкожных инъекцийBecton Dickinson305167Можно использовать любую марку
коллагеназы типа 2WorthingtonLS004174 
Бычий сывороточный альбуминАмериканский биоаналитическийAB00440 
2 мл Микроцентрифуга Eppendorf tubesFisher Scientific13-864-252Можно использовать любую марку
Nitrex Mesh 500 &микро; MElko Filtering Co100560Может использовать любую марку
Набор пипетокFisher Scientific21-377-328Может использовать любую марку
Sharpeining StoneFisher ScientificNC9681212Может использовать любую марку
Equipment
LabGard ES 425 Шкаф биологической безопасности (капюшон для клеточных культур)NuaireNU-425-400Может использовать любую марка
10 л Встряхивающая водяная баняEdvotek5027Можно использовать любую марку
Микроцентрифуга 5417REppendorf5417RМожно использовать одну центрифугу большего размера с размерами адаптеров
Allegra 6 SeriesCentrifuge Beckman Coulter366816Можно использовать любую марку
HuluMixer Sample MixerMixer Invitrogen15920D 
Водяная рубашка AutoFlow CO2 ИнкубаторNuiareNU-4750Можно использовать любую марку
Аналитические весыMettler ToledoXS104Можно использовать любую марку
любой марки Можно использовать любой марки

Ссылки

  1. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
  2. Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
  3. Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons. J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).
  4. Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).
  5. Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig. J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).
  6. Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig. Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).
  7. Rugiero, F., et al. Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia. J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).
  8. Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation. Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).
  9. Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels. PLoS One. 7 (9), e45251(2012).
  10. Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).
  11. Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55 (5), 630-637 (2006).
  12. Bassotti, G., et al. Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies. World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).
  13. Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).
  14. Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract. Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).
  15. Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).
  16. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).
  17. Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin. Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Продольная мышцаферментативное перевариваниеизоляция клетокиммуногистохимияэлектрофизиологиякальциевый имиджингПЦР единичных клетококрашивание на GFAP
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.