Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Флуоресцентный экзонуклеазный анализ для характеристики dmWRNexo, ортолога прогероида человеческого WRN экзонуклеазы, и его применения к другим нуклеазам

4.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50722

⸱

23 декабря 2013 г.

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Oxford

В этой статье

Краткое содержание

Экзонуклеазы играют важнейшую роль в обеспечении стабильности генома. Потеря функции экзонуклеазы WRN приводит к преждевременному старению. Изучение субстратов и других требований нуклеазы in vitro может помочь выяснить ее роль in vivo. Здесь мы демонстрируем быстрый и воспроизводимый флуоресцентный анализ для измерения его нуклеазной активности.

Аннотация

WRN экзонуклеаза участвует в устранении повреждений ДНК, которые происходят либо во время репликации ДНК, либо после воздействия эндогенных или экзогенных генотоксинов. Вероятно, он играет роль в предотвращении накопления рекомбиногенных промежуточных продуктов, которые в противном случае накапливались бы на временно остановленных репликационных вилках, что согласуется с гиперрекомбинантным фенотипом клеток, лишенных WRN. У человека экзонуклеазный домен содержит N-концевую часть гораздо более крупного белка, который также обладает геликазной активностью, вместе с дополнительными сайтами, важными для взаимодействия ДНК и белка. Напротив, у дрозофил экзонуклеазная активность WRN (DmWRNexo) кодируется отличным генетическим локусом от предполагаемой геликазы, что позволяет биохимически (и генетически) анализировать роль экзонуклеазной активности в механизмах стабильности генома. В данной работе мы демонстрируем флуоресцентный метод определения активности экзонуклеазы WRN с использованием очищенного рекомбинантного DmWRNexo и флуоресцентных олигонуклеотидов, меченных на концах. Эта система обеспечивает большую воспроизводимость по сравнению с радиоактивными анализами, поскольку олигонуклеотиды субстрата остаются стабильными в течение нескольких месяцев, и обеспечивает более безопасный и относительно быстрый метод для детального анализа активности нуклеазы, позволяя определить полярность нуклеазы, процессивность и предпочтения субстрата.

Введение

Нуклеазы играют жизненно важную роль в клетках в удалении поврежденной ДНК, разрешении недуплексных структур, таких как соединения Холлидея, и обеспечении способности к корректуре во время репликации ДНК, как присущих ДНК-полимеразам, так и внешних по отношению к ним1. Нуклеазы могут действовать либо путем последовательного разложения ДНК со свободных концов (экзонуклеазы), либо путем расщепления внутренних фосфодиэфирных связей в более длинной молекуле ДНК (эндонуклеазы). Потеря нуклеазной активности может привести к высокоспецифичным фенотипам нестабильности генома. В то время как мутация члена семейства хеликаз RecQ BLM приводит к чрезмерно высокой скорости обмена сестринских хроматид и глобально повышенному уровню заболеваемости раком (рассмотрено Payne and Hickson2), мутация высокородственного белка WRN приводит к преждевременному старению3; основным значимым различием между этими двумя членами семейства является наличие 3'-5' экзонуклеазного домена с WRN4. Доказательства критической роли экзонуклеазы WRN в поддержании стабильности генома были получены в результате анализа генотипов у пациентов с WS5, а также исследований точечных мутаций и делеций в клетках человека, подкрепленных кристаллографическими исследованиями изолированного экзонуклеазного домена6. Тем не менее, сотрудничество и перекрестное взаимодействие между экзонуклеазной активностью WRN и его центральной геликазнойактивностью 7 затрудняет разграничение функциональности каждого из них и их относительного вклада в стабильность генома. У растений и животных с низкими клетками экзонуклеаза WRN присутствует на одном полипептиде, лишенном геликазнойактивности 8-10 (рассмотрено в Cox and Boubriak11); Биохимически у Arabidopsis было продемонстрировано, что эта экзонуклеаза действует согласованно с родственной WRN helicase, эффективно восстанавливая комбинированную активность фермента, наблюдаемую у позвоночных WRN9. Мы изучали экзонуклеазу WRN у дрозофил, поскольку превосходные генетические инструменты позволяют анализировать влияние мутации экзонуклеазы (без влияния на предполагаемую родственную геликазу) на уровне всего организма и на протяжении всего развития10,12. Кроме того, мы клонировали, экспрессировали и очистили рекомбинантную экзонуклеазу Drosophila WRN (DmWRNexo), что позволило провести полный биохимический анализ ее ферментативных свойств13,14.

Нуклеазный анализ in vitro традиционно проводился с использованием радиоактивно меченых олигонуклеотидов, оценивая деградацию путем поиска лестничных продуктов на акриламидных гелях4,8,15. Несмотря на свою чувствительность, такие анализы не могут быть количественно воспроизведены изо дня в день из-за радиоактивного распада меченых субстратов. Кроме того, обращение с радиоактивными реагентами и их захоронение создают серьезные проблемы для окружающей среды и здоровья; Поиск источников радиометок также становится все более проблематичным. Альтернативный новейший метод позволяет оценить количество конечного продукта разложения с помощью масс-спектрометрии16. Тем не менее, он занимает много времени (занимает несколько дней), требует специализированного оборудования, а считывание представляет собой количество конечного продукта (одного нуклеотида), поэтому не подходит для чувствительного измерения таких аспектов, как процессивность фермента или для определения того, приводят ли некоторые нуклеотиды, последовательности или модификации к приостановке или остановке нуклеазы. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы адаптировали традиционные анализы на основе геля для использования с флуоресцентными олигонуклеотидными субстратами, создавая стабильно меченые субстраты, которые можно воспроизводить в течение длительных периодов времени и, таким образом, позволяют напрямую сравнивать активность нуклеазы в различных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Получение субстратных олигонуклеотидов

  1. Синтезируйте пользовательские олигонуклеотиды.
    1. Спроектируйте один одноцепочечный олигонуклеотид с 5'-конъюгированной молекулой флуоресцеина; это будет основой для каждого субстрата. (Обратите внимание, что это относится к 3'-5' экзонуклеазе; для экзонуклеазы 5'-3' полярности используйте 3'-конъюгированную основную цепь). Если полярность неизвестна, следует проверить как 3', так и 5'.
    2. Сконструируйте комплементарные цепи таким образом, чтобы при отжиге до флуоресцентно меченного олигонуклеотида образовывались дуплексные субстраты по выбору. Обратите внимание, что комплементарная цепь не конъюгирована с флуорофором. При заказе укажите PAGE-очистку (обессоливания недостаточно).
    3. Храните запасы олигонуклеотидов в буфере в 10 мМ при концентрации 1 нмоль/мкл при −20 °C и в темноте.
  2. Смешайте основной меченый олигонуклеотид с каждым комплементарным немеченым олигонуклеотидом в молярном соотношении меченый:немеченый в буфере 1:1,2 (10 мМ Tris-HCl pH 7,6, 1 мМ ЭДТА pH 8,0, 50 мМ NaCl). (Примечание: соотношение 1:1 является наиболее желательным, но более важно, чтобы ВСЯ помеченная прядь была связана. Могут подойти соотношения 1:1 - 1:1,5.)
  3. Нагрейте водяную баню или нагревательный блок до 95 °C и поместите в него смесь для отжига на 3 минуты, затем выключите и дайте всему медленно остыть (1 °C/мин) до температуры ниже 30 °C.
  4. Проверьте полный отжиг меченого олигонуклеотида путем нанесения полученной дуплексной подложки на нативный 10% полиакриламидный гель (10% 19:1 акриламид:бис-акриламид в 1x Трис-борат-ЭДТА (TBE, 89 мМ трис-основание, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА), полимеризованный 0,05% масс.v/v персульфата аммония (APS) и 0.005% v/v TEMED). Визуализируйте с помощью PhosphorImager (см. раздел 5 ниже).

2. Приготовление акриламидных гелей

  1. Настройте систему литья гелем, например, гелевую оснастку Hoefer SE400 с пластинами 16 см x 18 см и распорками 1,5 мм.
    1. Тщательно очистите стеклянные пластины и распорки с помощью моющего средства и воды. Надевайте чистые перчатки, чтобы избежать повторного загрязнения пластин маслом из пальцев, которое будет препятствовать равномерному образованию геля.
    2. Промойте пластины большим количеством дистиллированной (деионизированной) воды, чтобы удалить остатки моющего средства, затем протрите безворсовой салфеткой (например, Kimwipes).
    3. Наконец, опрыскайте 70% этанолом и протрите - стеклянные пластины должны скрипеть, если они чистые. Отставьте в вертикальное положение, чтобы дать остаткам этанола испариться.
    4. Очистите оставшуюся часть оборудования для формования геля дистиллированной водой (при необходимости сначала используйте моющее средство) и высушите.
    5. Установите стеклянные пластины и распорки в желеобразующую установку, убедившись, что система герметична.
  2. Приготовьте раствор геля до нужного процентного содержания полиакриламида
    1. Для нуклеазного анализа используют денатурирующие 14% полиакриламидные гели с 8 М мочевиной в 1x TBE.
    2. Для приготовления 100 мл (достаточно для 2 гелей с большим избытком для вытекания) возьмите 48,05 г мочевины в широкий стакан и добавьте 35 мл 40% раствора акриламида 19:1 и 10 мл 10x TBE (890 мМ Трис, 890 мМ борной кислоты, 20 мМ ЭДТА, pH 8,3 с NaOH). ВНИМАНИЕ: Надевайте перчатки - акриламид является мощным нейротоксином. Растворите мочевину с помощью мешалки и магнитной мешалки (это займет некоторое время).
    3. Когда растворится, добавьте milliQ-деионизированную воду до 100 мл. Фильтруйте-простерилизуйте с помощью мембраны 0,22 мкм. Если не использовать сразу, кратковременно дегазируйте с помощью аспиратора и храните в темноте (сохранится несколько дней). Не храните в холодильнике, так как мочевина выпадет в осадок.
  3. Полимеризуйте и отлите гель.
    1. Возьмите мочевину-акриламид и добавьте 0,5 мл 10% (w/v) персульфата аммония (APS, составленного в дистиллированной воде) и 50 μл TEMED. Медленно взболтайте емкость, чтобы перемешать, не пропуская воздух (который будет препятствовать полимеризации) и влейте в нее гелеобразователь. Действуйте быстро, иначе гель может застыть до окончания заливки.
    2. Добавьте подходящую расческу, чтобы сформировать лунки для загрузки проб (выбираются в зависимости от гелевой установки и номера анализируемого образца, например, гребни с 15 или 29 зубьями подходят для использования с гелевой установкой Hoefer). Убедитесь, что под зубья расчески не попадают пузырьки воздуха.
    3. Оставьте застывать. Следите за утечкой. Полная полимеризация на гребнях замедляется из-за контакта с атмосферой. Когда лунки станут твердыми, остальная часть геля будет схватываться.
    4. Снимите расчески и промойте неполимеризованный акриламид с помощью воды и пипетки.
  4. Настройте гель для бега.
    1. Установите литой гель в систему подачи геля и добавьте соответствующее количество 1x TBE рабочего буфера в нижнюю камеру и в гелевые лунки. Теперь гель готов к загрузке.

3. Получение меченого им рекомбинантного белка DmWRNexo

  1. Бактериальная экспрессия белка DmWRNexo
    1. Используя петлю инокуляции, собирайте бактерии, соскребая по поверхности запасов глицерина, поддерживаемых при температуре -80 °C (бактерии представляют собой E. coli T7 Iq LysY (NEB), преобразованные с pIVEX2.3d-DmWRNexo). Нанесите на пластины LB-агар (10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl, 15 г агара, приготовленного до 1 л дистиллированной водой с pH до 7,4) с 50 мкг/мл ампициллина. Инкубировать в перевернутом виде в течение ночи при температуре 37 °C.
    2. Соберите одну колонию из тарелки на 50 мл LB (10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на 1 л дистиллированной воды) с добавлением 50 мкг/мл ампициллина (приготовленного в воде и стерилизованного фильтром до 0,22 мкм). Выращивайте при встряхивании при 220 об/мин при 37 °C в течение ночи.
    3. Инокулируйте 1,8 л (аликвоты по 600 мл каждая в три конических колбы по 2 л для обеспечения адекватной аэрации) LB-ампициллина с культурой 50 мл на ночь и выращивайте до наружного диаметра600 ~ 0,8. Добавьте IPTG до конечной концентрации 0,7 мМ и инкубируйте при 26 °C (для предотвращения агрегации белка) с встряхиванием в течение 4-8 часов.
    4. Соберите клеточную гранулу центрифугированием при 8 000 об/мин при 4 °C в течение 10 мин - используйте 6 стерильных пластиковых флаконов центрифуги объемом 500 мл с клеточной суспензией по 300 мл в каждой. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в небольшом объеме (10 мл) исходного LB-ампера, переложите в пробирку Falcon объемом 15 мл и затем повторно вращайте при 5 000 об/мин, чтобы гранулировать ячейки - снова удалите надосадочную жидкость и заморозьте при -80 °C (это помогает при лизисе).
  2. Лизис бактериальных клеток
    1. Составить 3,2 мл лизисного буфера, содержащего 1 мл 5 М NaCl, 1 мл 1 М DTT, 200 мкл 1 М бензамидина и 1 мл 10 мг/мл лизоцима (ресуспендировать в дистиллированной воде).
    2. К каждой грануле, полученной из 300 мл бактериальной суспензии, добавьте 320 мкл лизисного буфера. Восстановите как можно больше суспензии - используйте «отпиленный» наконечник p1000 и перемешивайте, а также пипетируйте вверх и вниз. Выдерживать на льду 20 мин. Добавьте еще 100 мкл лизисного буфера и хорошо перемешайте, затем перенесите как можно больше ресуспендированного лизата в микрофуговую пробирку (она будет очень вязкой и трудной для пипетки).
    3. Центрифугируйте лизат при 14 000 об/мин в предварительно охлажденном роторе микрофуга при температуре 4 °C в течение 30 минут, затем поместите надосадочную жидкость в чистую микропробирку: она содержит рекомбинантный белок.
  3. Очищение хис-ловушек
    1. Приготовление реагентов: Пометьте 5 микрофуговых пробирок для каждой из следующих концентраций имидазола: 40 мМ, 60 мМ, 100 мМ, 300 мМ и 500 мМ (например, метка 40-1, 40-2, 40-3 и т.д.), которые будут использоваться для сбора фракций в колонке. Храните пробирки на льду в решетке с открытыми крышками (но неплотно накройте пищевой пленкой или чем-то подобным, чтобы сохранить чистоту во время приготовления всего остального). Составьте 25 мл 20 мМ имидазола и по 10 мл запасов каждой из остальных концентраций имидазола в универсальных пробирках по 25 мл, используя в качестве разбавителя 1x PBS (8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na2 HPO4, 0,24 г KH2PO4, рН скорректирован до 7,4 и доведите до 1 л дистиллированной водой) в качестве разбавителя.
    2. Отрегулируйте бактериальный лизат до 20 мМ имидазола, используя соответствующий объем 2 М имидазола стокового раствора, и отрегулируйте объем по меньшей мере до 1 мл (<5 мл) с использованием 20 мМ имидазола.
    3. Промойте колонку His-Trap объемом 1 мл (Amersham) 10 мл воды MilliQ с помощью шприца объемом 5 или 10 мл с замком Люэра и легким ручным давлением, затем уравновесьте колонку, пропустив через нее 10 мл 20 мМ имидазола, содержащегося в PBS (см. шаг 3.3.1 выше).
    4. Загрузите лизат на колонку. По мере того, как лизат загружается на колонку, может наблюдаться значительное противодавление; Это совершенно нормально. Не поддавайтесь искушению прикладывать слишком большое усилие к шприцу и поддерживайте постоянное равномерное давление. Обычно наблюдается незначительное изменение цвета при попадании лизата в колонку. Соберите стекающий поток в бутылку Sterilin bijou (емкость 7 мл) и храните на льду.
    5. Промойте колонку 10 мл имидазола 20 мл и соберите его в универсальный тюбик объемом 25 мл на льду, помеченный как 'wash'.
    6. Пропустите через колонку 5 мл имидазола 40 мМ, собрав по 1 мл фракций в каждую из микропробирок (помеченных 40,1, 40,2, 40,3 и т.д.): внимательно следите за поршенем шприца, так как это позволяет отмерить 1 мл.
    7. Теперь последовательно пропустите по 5 мл каждого из 60 мМ, 100 мМ, 300 мМ и 500 мМ имидазола, снова собирая 5 х 1 мл фракций при каждой концентрации соли.
  4. Анализ колоночных фракций
    1. Точечная блотка: Нанесите по 2 мкл каждой фракции столбца (а также загрузите, протечьте и промойте) на лист нитроцеллюлозы - проще, если это предварительно проделать сеткой с помощью мягкого карандаша). Дайте высохнуть на воздухе. Обработайте дот-блот, заблокировав от 15 минут до 1 часа комнатной температуры в 5% обезжиренном сухом молоке, приготовленном в PBS с 0,2% v/v Tween 20, затем промойте в PBS-Tween несколько раз и инкубируйте с антителом HRP-anti-his, разведенным в соотношении 1:500 в PBS-Tween, в течение 30-60 минут. Обильно промойте с помощью PBS-Tween, затем PBS, и обнаружите связанное антитело с помощью усиленной хемилюминесценции (ECL), визуализированной на Hyperfilm MP. Этот точечный блот дает отличное представление о пиковых фракциях до анализа SDS-PAGE и при необходимости может информировать о последующих этапах очистки (например, если стабильность белка является проблемой, можно объединить пиковые фракции на основе результатов дот-блоттинга и загрузить их прямо в колонки для фильтрации геля - см. шаг 3.5 ниже).
    2. SDS-PAGE: Соберите 50 μл каждой фракции колонки в меченую микрофужейную пробирку, содержащую 50 μл 2x SDS-PAGE загружающих красителей (4% по сравнению с SDS, 20% v/v глицерина, 120 мМ Tris-HCl pH 6,8 с 200 мМ DTT). Кипятите эти образцы в течение 5 минут при температуре 95-100 °C (обратите внимание, если вы используете горячий блок без нагреваемой крышки, сделайте небольшое отверстие в крышке каждой пробирки с помощью иглы для шприца узкого калибра, чтобы пробирки не «взорвались» при нагревании). Запустите 10% минигели SDS-PAGE, загрузив по 10 мкл каждой фракции колонки, и окрасьте их в бриллиантовый синий цвет Coomassie, чтобы проверить пиковые фракции и % чистоты белка. При необходимости также можно провести вестерн-блоттинг для меченого им белка путем переноса белков, разделенных с помощью SDS-PAGE, на нитроцеллюлозу; Блокируйте мембраны 5% обезжиренным молоком в PBS-0,2% Tween 20, затем промойте и прозондируйте HRP-конъюгированными антителами против HIS (1:500) как для точечного блоттинга.
  5. Для повышения чистоты пиковые фракции из колонны с ловушкой могут быть объединены и загружены в гелевую фильтрационную колонну Superdex 75 с элюированием в возрастающей соли (как ранее было описано Boubriak et al.13 и Mason et al. пункт 14).

4. Нуклеазный анализ

  1. Сделайте рабочие запасы субстратов.
    1. Используйте субстрат 20 пмоль на реакцию (хотя это количество может варьироваться в зависимости от вопроса, который необходимо решить), поэтому удобным рабочим материалом является 200 пмоль/мкл (т.е. 10x). Рабочие массы составляют в небольших объемах буфера для отжига (10 мМ Tris-HCl pH7,6, 1 мМ ЭДТА pH 8,0, 50 мМ NaCl) или в 10 мМ Tris-HCl pH 7,0 (до pH 8,5, по нуклеазе) без соли или ЭДТА, в зависимости от чувствительности фермента или проводимого анализа.
    2. Хранить при температуре 4 °C и в темноте (завернутым в фольгу). Подложки служат в течение многих недель без потери целостности дуплекса или флуоресцентного сигнала.
  2. Определение концентрации белка экзонуклеазы колориметрическим анализом или УФ-спектрометрией на Abs260.
    1. Хранить в небольших аликвотах при температуре -80 °C.
    2. Если образцы замораживаются/размораживаются один раз, предположите, что коэффициент неправильного сворачивания белка составляет 5% (или определите опытным путем для каждого тестируемого белка) и соответствующим образом скорректируйте концентрацию.
    3. Отбросьте белки для анализа активности экзонуклеазы после двух циклов замораживания/размораживания и обратите внимание на состояние белка для каждого эксперимента.
  3. Проектирование, эксперимент и расчет количества мастер-микса (MM) для образцов.
    1. Сделайте ММ, содержащую все компоненты, общие для тестируемых образцов (обычно все, кроме фермента или субстрата), чтобы уменьшить вариацию между образцами.
    2. Учитывайте ошибку пипетирования при составлении ММ, например, рассчитывайте объемы для N образцов, делая достаточные для (N + 0,1N) образцов.
    3. Настройте реакции в общем объеме 20 μл/образец, содержащие 1 пмоль фермента и 20 пмоль субстрата (по умолчанию до оптимизации - очевидно, что количество варьируется в зависимости от того, что тестируется, например, изменение количества фермента при тестировании эффекта концентрации фермента). Для DmWRNexo эмпирически было установлено, что оптимальный буфер для нуклеазной активности содержит 40 мМ Tris-HCl pH 8,0, 4 мМ MgCl2, 5 мМ дитиотреитол с 0,1 мг/мл молекулярно-биологического класса BSA.
  4. Настройте реакции.
    1. Храните все реагенты при температуре 4 °C (ведро со льдом или криостойка).
    2. Составьте мастер-смесь и аликвоту в соответствующее количество стерильных пробирок без ДНКазы объемом 0,5 мл. Включите контроль без ферментов для визуализации исходного субстрата (контроль без деградации).
    3. Установите нагревательный блок на температуру, соответствующую активности фермента (37 °C, с конечным временным моментом 30 минут, что было оптимальным для DmWRNexo, хотя это может потребоваться определить опытным путем, сравнивая активность выбранного фермента в диапазоне температур и времени). Потенциальные ингибиторы ферментов, обычно присутствующие в буферах, должны быть тщательно проверены на наличие (например, ЭДТА ингибирует DmWRNexo, как и избыток АТФ14, предположительно путем хелатирования Mg2+, имеющего решающее значение для нуклеазной активности). Обратите внимание, что даже высокие концентрации имидазола (>300 мМ) не влияют ни на активность фермента DmWRNexo, ни на гашение флуоресценции.
    4. Составьте раствор СТОП (80% формамид, 1х ТБЭ). Это в 3 раза. При необходимости он может содержать красители, такие как бромфенольный синий. Храните в RT.
    5. Установите рядом с тепловым блоком следующее: конечный реагент (реагенты), который должен быть добавлен в реакционную смесь (обычно фермент); пипеттор объемом 1-10 мкл и наконечники, таймер, криостойка или ведро со льдом и раствор STOP.
  5. Начните реакцию.
    1. Установите таймер на добавление фермента в первую пробирку. Поместите трубку в нагревательный блок.
    2. Продолжайте добавлять фермент в остальные трубки через соответствующие промежутки времени. (15 секунд достаточно для простых реакций, для завершения которых требуется только раствор STOP). Поместите в тепловой блок, как только будет добавлен фермент.
  6. Остановите реакцию.
    1. Когда таймер достигнет нужного времени (например, 15 минут), добавьте 10 μл раствора STOP в первый образец и перемешайте с помощью пипетирования. Поместите немедленно на лед/в криостойку.
    2. Продолжайте останавливать реакции через соответствующие промежутки времени и в том же порядке, в котором они были настроены, чтобы каждая реакция имела точно такое же время инкубации.
  7. Теперь образцы готовы к загрузке на подготовленный денатурирующий гель.
    1. Загружайте половину (или всю) каждого образца с помощью наконечников для загрузки геля для точного пипетирования. При уровнях олигонуклеотида, используемых в реакции, половина реакции даст хороший результат для визуализации и позволит провести повтор (например, если исходный гель работает неправильно).
    2. Удобно загрузить 1x раствор STOP, содержащий краситель (например, бромфенольный синий) в одну или несколько дорожек, чтобы убедиться, как работает гель.
    3. Флуоресцентные олигонуклеотиды известных размеров могут быть введены вместе с образцами в качестве маркера размера.
  8. Запустите гель.
    1. Добавьте верхнюю рабочую буферную камеру в гелевый аппарат и заполните рабочим буфером (1x TBE), убедившись, что образцы не потревожены. Проверьте наличие утечки буфера.
    2. Подключите гелевую установку к источнику питания и работайте при напряжении 200 В (постоянное напряжение) в течение 150-200 минут или до тех пор, пока бромофенольный синий краситель (если используется) не окажется примерно на двух третях пути вниз по гелю (он находится на уровне 10nt ДНК в этом процентном соотношении геля). Следите за утечкой буфера, которая может перекосить или предотвратить разделение.
    3. Остановите гель и снимите с бегового аппарата.

5. Анализ и визуализация геля

  1. Определите чувствительность используемого тепловизора, например, люминесцентный имидж-сканер Fuji FLA-3000 может обнаруживать флуоресценцию флуоресцеина с помощью синего лазера с длиной волны 473 нм, используя его максимальную настройку чувствительности F1000 и наименьшее считывание пикселей (разрешение) 50 мкм.
  2. Отсканируйте гель.
    1. Осторожно снимите распорки и одну гелевую пластину. Тщательно (но осторожно) смойте оставшийся на другой гелевой пластине гель, чтобы удалить следы осажденной мочевины, которые в противном случае будут мешать сканированию.
    2. Установите пластину (с прикрепленным гелем) на стеклянную поверхность держателя геля и поместите его в имидж-сканер. Обратите внимание на координаты геля на стекле (если он не заполняет всю поверхность).
    3. Откройте соответствующее программное обеспечение на подключенном компьютере и отсканируйте отмеченную область области сканирования, где находится гель. Используйте наилучшие условия, определенные как в шаге 5.1. Полученный файл будет относительно большим (несколько МБ), но при необходимости изображение можно обрезать и сжать.
    4. Сохраните, затем экспортируйте в виде файла, который может быть прочитан аналитическим программным обеспечением, например, экспортируйте в качестве .tiff для анализа с помощью ImageJ.
  3. Проанализируйте данные.
    1. Успешный экзонуклеазный анализ вызовет деградацию субстрата последовательно вдоль олигонуклеотида по направлению к флуорофору, что приведет к характерному лестничному рисунку флуоресцентных фрагментов ДНК на геле. Вещества с более высокой подвижностью на геле (которые распространяются дальше) меньше, чем неразложившийся исходный субстрат, и поэтому представляют собой продукты деградации экзонуклеазы.
    2. Используйте инструмент «Gels» в ImageJ для количественной оценки относительных интенсивностей веществ в каждой полосе в зависимости от их подвижности, чтобы определить уровни деградации, а следовательно, и экзонуклеазной активности в каждом образце.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Проведение анализа экзонуклеазной активности in vitro требует ряда подготовительных этапов в дополнение к самому анализу. Обзор процедур представлен на Рисунке 1.

Перед проведением анализов экзонуклеазной активности на основе флуоресценции крайне важно оптимизировать детектирование флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного субстрата после разделения на мочевин-акриламидных гелях с использованием подходящей системы флуоресцентной визуализации. Выбор фильтра имеет решаю...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Определение экзонуклеазной активности очищенных белков требует анализа продуктов расщепления ДНК. Последовательное расщепление ДНК экзонуклеазами может быть визуализировано путем разделения меченых продуктов расщепления на акриламидных гелях. Исторически сложилось так, что это включало в себя мечение субстрата ДНК радиоактивной меткой (например, 32P или 35S), но с недостатками, присущими использованию радиоактивной метки (стоимость, проблемы с безопасностью и нестабильность с течением време...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим межсоветскую программу "Новая динамика старения" за финансирование этой работы [ES/G037086/1] и профессора Дэйва Шерратта (факультет биохимии, Оксфордский университет) за доступ к Fuji FLA-3000.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Reagent/Material
Custom oligonucleotidesEurogentecНеобходимо получить их высокой чистоты например с очисткой PAGE.
5'FLOфлуоресцеин-5' GAACTATGGCTCTC
GAGTGCTAGGACATGTCTGA
CTACGTACAAGTCACC - 3'bubble
5'- GGTGACTTGTACGT
AGTCAGACATGTCCTAGCAC
TCGAGAGCCATAGTTC-3'40
% 19:1 Раствор акриламидаSevern Biotech20-2400-05ВНИМАНИЕ: сильнодействующий нейротоксин, поэтому перчатки следует носить постоянно.
His-Trap колонки (1 мл)GE Healthcare17-5247-01
Все остальные реактивылюбого уважаемого поставщикаНеобходим класс молекулярной биологии (без ДНКазы); микрофуговые пробирки также должны быть без ДНКазы и РНКазы
EquipmentHoefer SE400 гелевый аппарат Hoefer SE400-15-1.5 FLA-3000 (люминофор и флуоресценция
imager)Fuji
Image Reader V2.02FujiFilm
Image Gauge V3.3FujiFilm

Ссылки

  1. Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).
  2. Payne, M., Hickson, I. D. Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndrome). Biochem. Soc. Trans. 37, 553-559 (2009).
  3. Yu, C. E., Oshima, J., Fu, Y. H., Wijsman, E. M., Hisama, F., Alisch, R., Matthews, S., Nakura, J., Miki, T., Ouais, S., et al. Positional cloning of the Werner's syndrome gene. Science. 272, 258-262 (1996).
  4. Huang, S., Li, B., Gray, M. D., Oshima, J., Mian, I. S., Campisi, J. The premature ageing syndrome protein, WRN, is a 3'-->5' exonuclease. Nat. Genet. 20, 114-116 (1998).
  5. Goto, M. Syndrome-causing mutations in Werner syndrome. Biosci. Trends. 2, 147-150 (2008).
  6. Perry, J. J., Yannone, S. M., Holden, L. G., Hitomi, C., Asaithamby, A., Han, S., Cooper, P. K., Chen, D. J., Tainer, J. A. WRN exonuclease structure and molecular mechanism imply an editing role in DNA end processing. Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 414-422 (2006).
  7. Opresko, P. L., Laine, J. P., Brosh, R. M., Seidman, M. M., Bohr, V. A. Coordinate action of the helicase and 3' to 5' exonuclease of Werner syndrome protein. J. Biol. Chem. 276, 44677-44687 (2001).
  8. Plchova, H., Hartung, F., Puchta, H. Biochemical characterization of an exonuclease from Arabidopsis thaliana reveals similarities to the DNA exonuclease of the human Werner syndrome protein. J. Biol. Chem. 278, 44128-44138 (2003).
  9. Hartung, F., Plchova, H., Puchta, H. Molecular characterisation of RecQ homologues in Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 28, 4275-4282 (2000).
  10. Saunders, R. D., Boubriak, I., Clancy, D. J., Cox, L. S. Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity. Aging Cell. 7, 418-425 (2008).
  11. Cox, L. S., Boubriak, I. DNA Instability in Premature Aging, in DNA Damage Repair, Repair Mechanisms and Aging. Thomas, A.E., Eds. Nova Science Publishers. , 1-34 (2010).
  12. Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).
  13. Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease. Biogerontology. 10, 267-277 (2009).
  14. Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro. Age (Dordr). , (2012).
  15. Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains. BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).
  16. Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry. Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).
  17. Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities. Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).
  18. Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA. Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

DmWRNexoWRN
Флуоресцентный экзонуклеазный анализ для характеристики dmWRNexo, ортолога прогероида человеческого WRN экзонуклеазы, и его применения к другим нуклеазам
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.