Кишечные бактериальной инвазии эпителиальных клеток кишечника<em&gt; In Vitro</em&gt; Резко усиливается с помощью вертикальной модели диффузионной камере

Краткое содержание

Выполнение анализа клеточной культуры для исследования бактериальной адгезии и инвазии в аэробных условиях, как правило, не представляющий В естественных условиях Окружающей среды. Вертикальная модель диффузионной камере позволяет изучение взаимодействия патоген человека Campylobacter джеджуни С эпителиальные клетки кишечника в более В естественных условиях-Подобных условиях, что приводит к повышению бактериальной инвазии.

Аннотация

Взаимодействие бактериальных патогенов с клетками-хозяевами были широко исследованы использованием методов пробирке культуре клеток. Однако, поскольку такой анализ культуры клеток в аэробных условиях, в пробирке эти модели не могут точно представлять в естественных условиях среды, в которой хозяин-патоген взаимодействия происходят. Мы разработали в пробирке модель инфекции, которая позволяет совместное культивирование бактерий и клеток-хозяев в различных средних и газа условий. Вертикальные диффузионной камеры (VDC) модель имитирует условия в кишечнике человека, где бактерии будут в условиях очень низкой в ​​то время как ткани кислородом будет снабжаться кислородом из крови. Размещение поляризованного кишечные эпителиальные клетки (МЭК) монослоя, выращенных в Snapwell вставки в пост создает отдельные апикальной и базолатеральным отсеков. Базолатеральной отделение заполнено среде клеточной культуры, герметизируют и перфузии кислорода безhilst апикальной отсек заполнен бульон, остается открытым и инкубировали в микроаэробных условиях. Оба Caco-2 и T84 IECS могут быть сохранены в постоянного тока в этих условиях без всякой видимой пагубные последствия для выживания клеток монослоя или целостности. Сокультивирования эксперименты, проведенные с различными C. джеджуни штаммы дикого типа и различных линий IEC в модели постоянного тока с микроаэробных условий в апикальной отсек воспроизводимо привести к увеличению числа взаимодействующих (почти в 10 раз) и внутриклеточные (почти в 100 раз) бактерий по сравнению с аэробных условиях культивирования ^1. Среды, созданной в модели постоянного тока более точно имитирует среду, с которыми сталкиваются C. джеджуни в кишечнике человека и подчеркивает важность выполнения анализов в пробирке инфекции в условиях, которые более точно имитировать в естественных условиях реальности. Мы полагаем, что использование модели постоянного тока позволит новые интерпретации взаимодействий ставкуWeEn бактериальных патогенов, и клетки-хозяева.

Введение

Взаимодействие бактериальных патогенов с клетками-хозяевами были широко исследованы использованием методов пробирке культуре клеток. Использование таких клеточных культур, бактериальной адгезии к клеткам хозяина, определение рецепторов клетки-хозяина, клетки-хозяина сигнальных путей и бактериальной инвазии клеток-хозяев, все были подробно изучены, в результате чего многие важные наблюдения. Однако такой анализ культуры клеток в аэробных условиях, которые не могут быть представителем в естественных условиях окружающей среды. Главное ограничение в пробирке модели, используемые для изучения желудочно-кишечных инфекций в том, что условия культивирования включая высокий уровень кислорода в целом одобряют эукариотических выживания клетки. Однако условия в просвете кишечника будет почти анаэробных. Кишечных патогенов в очень низкой кислородной среде выразить гены вирулентности, экспрессия которых изменения в аэробных условиях ^2. Таким образом, данные, полученные с использованием стандартных клеточных культур моделях май дают неточные указания бактериального взаимодействия с клетками-хозяевами.

Campylobacter джеджуни является ведущим возбудителем бактериального острого гастроэнтерита по всему миру, с симптомами, которые варьируются от легкой диареи до тяжелых воспалительных энтерита. Большинство С. джеджуни инфекции приводят в неосложненных гастроэнтерита, однако C. джеджуни также, наиболее часто упоминаемой инфекционного агента в периферические невропатии, включая синдром Гийена-Барре (СГБ). В Великобритании, по оценкам, насчитывается более 500 000 случаев энтерита вызванных C. джеджуни инфекции каждый год с прогнозируемой стоимостью в экономику Великобритании в размере £ 580 000 000. В развивающихся странах, C. джеджуни является ведущей причиной смертности среди детей. Несмотря на несомненную важность инфекции Campylobacter и десятилетия исследований, в том числе тщательное геномики на основе анализа, C. джеджуни патогенеза еще плохо understООД, в отличие от других кишечных патогенов, таких как сальмонелла, кишечная палочка, шигеллы, и холерный вибрион. Отсутствие удобных маленькая модель животного одна из главных причин для этого ^3. Также широко используется в моделях пробирке инфекции более подходит для изучения микроаэрофильная C. джеджуни, чем для других кишечных патогенных микроорганизмов, которые являются факультативными анаэробами. Хотя C. джеджуни признан инвазивного возбудителя, механизмы C. джеджуни вторжения в эпителиальные клетки кишечника (IECS) до сих пор неясны ^4,5. C. джеджуни вторжение было показано, зависит от или микрофиламентов, микротрубочек, сочетание оба или ни ^5. Путаницы в этой области, скорее всего, за счет использования ненадлежащих условиях в пробирке анализа.

Ряд различных анализах культуры клеток были использованы для исследования взаимодействия С. джеджунис клетками-хозяевами. Caco-2, ^{6, 7} INT 407 и T84 ⁸ клеточные линии все были использованы для изучения адгезии и инвазии возможностей различных C. джеджуни штаммов. Однако уровни бактериальной адгезии и инвазии для C. джеджуни с IECS значительно ниже, чем для других кишечных патогенов ^9. Сокультивирования С. джеджуни с IECS обычно выполняется в СО _{2-инкубаторе} в условиях, близких к атмосферному уровня кислорода, необходимого для выживания IECS. C. джеджуни экспрессии генов будет сильно отличаться в среде с низким кислородом просвет кишечника по сравнению с атмосферным условиям кислорода.

Использование вертикальной диффузионной камеры (VDC) была разработана система, которая позволяет совместное культивирование бактерий и клеток-хозяев в различных средних и газа условиях ^1,10,11. Эта система имитирует условия в кишечнике человека, где бактерии будет ООНдер условиях очень низких ткани в то время как кислород будет снабжаться кислородом из крови. Поляризованные монослоев IEC выращивают в специальных фильтров 0,4 мкм помещали в создании постоянного тока апикальной и базолатеральной отсек, которые были индивидуально заполнены бактериальный бульон и среды культуры клеток соответственно (рис. 1). В постоянного тока помещали в атмосферу переменной инкубаторе, содержащем 85% N _2, 5% O _{2 и} 10% CO ₂ при 37 ° С, представляя оптимальные условия для C. джеджуни. Верхушечный отсека осталась открытой и подверженной микроаэробных атмосфера в переменной атмосферу инкубатора, в то время как запечатанные базолатеральным отсек снабжаются кислородом постоянным введением 5% CO _2/95% O ₂ газовой смеси с выходной трубкой предотвращения накопления давления . Сасо-2 выживание клеток и монослой целостность при этих условиях были подтверждены путем мониторинга трансэпителиальная элементctrical сопротивления (TEER) через монослой в течение 24 часов, чтобы продемонстрировать выживаемость клеток Сасо-2 монослой клеток и физическое разделение апикальной и базолатеральной отсеков в условиях низкой кислорода в апикальной отсека. TEER монослоев в ДКР поддерживается в переменной атмосфере инкубатора (микроаэробных условий) и в стандартной клеточной культуры CO _{2-инкубаторе} (аэробных условиях) не показали значительных различий, что указывает на целостность монослоя клеток при различных атмосферных условиях ^1. В микроаэробных условиях плотных соединений остался настоящим и равномерно распределены между границами ячеек с помощью рисунка окклюдина окрашивания похожи на клетки поддерживаются в аэробных условиях ^1.

Взаимодействия C. джеджуни с Caco-2 и T84 клеток в VDC были исследованы оценки взаимодействия бактериальных (адгезия и инвазия) и вторжения. Два разных C. джеджуни дикого типа Straiнс были использованы ^1. C. джеджуни 11168H является hypermotile производной исходного штамма NCTC11168 последовательности. 11168H штамм демонстрирует гораздо более высокие уровни колонизации в модели колонизации кур и, таким образом, рассматриваться в качестве подходящего штамма использовать для хозяин-патоген исследования взаимодействия. 81-176 является человеком изолировать и является одним из наиболее широко изученных инвазивных лабораторных штаммов. С. джеджуни штаммы были добавлены к апикальной отсеке постоянного тока в соответствии либо микроаэробных или аэробных условиях. Мы наблюдали более высокие ставки для взаимодействия и вторжения были записаны для C. джеджуни в микроаэробных условия ^1. Повышенная C. джеджуни взаимодействия не за счет увеличения числа бактерий в микроаэробных условия ^1. Эти данные подтверждают нашу гипотезу, что низкая среде кислорода в апикальной отсеке VDC улучшает бактерии-хозяина взаимодействий и показывает, что инвазивные свойства C. джеджуни являются INCRоблегчили в этих условиях. Это было первое сообщение об использовании модели постоянного тока для изучения инвазивных бактериальных патогенов и подчеркивает важность выполнения анализов в пробирке инфекции в условиях, которые более точно имитировать в естественных условиях ситуации. Модель постоянного тока может быть использована для изучения хозяин-патоген взаимодействия для различных видов бактерий.

Протокол

1. Рост Монослои IEC на специальные фильтры 0,4 мкм

1. Культуры клеток Сасо-2 в модифицированной, по существу Дульбекко среды Игла (DMEM) с добавлением 10% (об / об) фетальной телячьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 1% (об / об), заменимые аминокислоты в стандарт культуре ткани инкубаторе при 37 ° С в 5% СО ₂ и 95% воздуха. Семенной 4 х 10 ⁵ Сасо-2 IECS за 0,4 мкм фильтр и расти к поляризации более 21 дней, заменяя СМИ каждые 2-3 дня.
2. Измерьте TEER для подтверждения статуса поляризации монослоя использованием Вольт Ом сопротивления метр. В наших исследованиях, TEER из 21 день Сасо-2 клетки, выращенные в этих фильтрах 0,4 мкм составляет 700-800 Ом · см ^2.

2. Подготовка C. джеджуни и бактериальные Среда для анализа сокультивирования

1. 24 ч до желаемую исходную точку анализа сокультивирования VDC, подготовить новую тарелку кровяной агар С. джеджуни и инкубировать при 37 ° С в микроаэробных условия (85% N _2, 5% O ₂ и 10% СО ₂₎ в атмосфере переменной инкубатора.
2. В то же время, preincubate 30 мл бруцелл бульоне при 37 ° С в микроаэробных условий в переменной атмосфере инкубатора.

3. Подготовка и стерилизация палат VDC Половина До анализа

1. Полностью погрузить постоянного тока половина камеры, а также уплотнительные кольца и пробки в стерилизации раствора.
2. Используя стерильный шприц 20 мл, промойте стерилизации раствора через входы газа в обе половины камер. Невыполнение этого требования может привести к загрязнению образцов при сокультивирования.
3. Оставьте все компоненты, погруженных в раствор стерилизации в течение> 1 часа.
4. Тщательно промойте все компоненты со свежим стерильной водой, используя другую стерильную 20 мл шприц для промывки газа заливов.

4. Подготовкабактериального Посевной

1. Урожай половину тарелки C. джеджуни роста от пластины кровяной агар подготовлены в предыдущий день в 1 мл бульона предварительно инкубированной бруцелл. Это должно дать ~ ¹⁰ 10 КОЕ / мл.
2. Измерение оптической плотности бактериальной суспензии при 600 нм в semiquantify бактериальных колониеобразующих единиц (КОЕ).
3. Регулировка бактериальной суспензии до нужного уровня инокулята в 4 мл предварительно инкубированной бульоне Brucella.
4. Выполнение серийных разведений этого окончательного бактериальной суспензии последующим покрытием из соответствующих разведений в чашках с кровяным агаром в трех экземплярах, а затем инкубируют при 37 ° С в атмосфере переменной инкубаторе в течение 48 часов для количественного определения количества бактериальных КОЕ присутствует в инокулята.

5. Настройка VDC

1. Поместите нижнюю палату VDC плоские на скамью. Установите уплотнительное кольцо на нижнюю половину камеры.
2. Снимите один фильтр проведения IECS от TОн носитель и вымыть три раза с 400 мкл стерильной PBS. Поместите фильтр на нижнюю половину камеры, убедившись, что уплотнительное кольцо остается на месте.
3. Аккуратно опустите верхнюю палату половина на месте. После двух половин камеры собран, зажимают между собой с помощью кольцевого зажима. Поместите VDC горизонтально на настольный, с двумя отверстиями вверх.
4. Добавить 4 мл бактериальной посевной в апикальной половине камеры.
5. Добавить 4 мл клеточной культуральной среде в базолатеральной камеры наполовину.
6. Поместите конец части в отверстия по обе половины камер.

6. Прикрепление VDC к газовый коллектор в переменной Атмосфера инкубатор

1. Поместите постоянного тока в переменный атмосфере инкубаторе в непосредственной близости от газовой магистрали.
2. Открыть регулятор газа соединены с газовым коллектором. Прикрепите трубу от коллектора в газовую входе на базолатеральной камеры половины постоянного тока. Прикрепить GAс выпускной трубой, ведущей из переменной атмосферы инкубатора к одной из торговых точек в конечной части на камеру базолатеральным половину.
3. Закройте другой выход в наконечник на базолатеральной камере половину. Откройте газовый поток на газовом коллекторе, заботясь, чтобы открыть его очень медленно, чтобы избежать избыточного давления газа, так как это может привести к изгнанию базолатеральную среду.
4. Цель состоит в газовом потоке 1 пузырь каждые 2-5 сек. Периодически проверять на газовый поток в ходе эксперимента и при необходимости отрегулировать.

7. Разборка VDC после Coculture

1. После соответствующего периода совместного культивирования, закройте регулятор газа подключен к газовой магистрали. Закрыть подачу газа в постоянного тока на коллекторе. Отключите газа на входе, выходе газа и пробку из постоянного тока.
2. Удалить пост из переменной атмосферы инкубатора. Удалить апикальной и базолатеральным супернатантами и хранить при температуре -80 ° С в течение subsequenT анализа.
3. Снимите кольца зажима и осторожно разобрать постоянного тока. Снимите фильтр с камеры и передачи половины в стерильную 6-и блюдо культуре клеток. Промыть IECS три раза 400 мкл стерильного PBS.
4. Для перечисление общее количество взаимодействующих бактерии, добавляют 400 мкл стерильного PBS, содержащим 0,1% (об / об) Тритона X-100 до IECS и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре, чтобы лизировать МЭК. Выполнение серийных разведений этого клеточный лизат последующим покрытием из соответствующих разведений в чашках с кровяным агаром в трех экземплярах, а затем инкубируют при 37 ° С в атмосфере переменной инкубаторе в течение 48 часов для количественного определения количества взаимодействующих бактериальных КОЕ.
5. Для перечисление общего числа вторжения бактерий, добавляют 400 мкл DMEM культуральной среды, содержащей 150 мкг / мл гентамицина в IECS и инкубируют в течение 2 ч в стандартном культуре ткани инкубаторе при температуре 37 ° С в 5% СО ₂ и 95% воздух, чтобы убить бактерии внеклеточной,следуйте за шагом 7,4 выше.

8. Очистка VDC после Coculture

Вымойте VDC стерильной водой и хранят для следующего раунда экспериментов.

Результаты

Сокультивирования экспериментов, выполненных с С. джеджуни штамма дикого типа и IECS в модели постоянного тока с микроаэробных условий в апикальной отсек продемонстрировали увеличение числа взаимодействующих (почти в 10 раз) и внутриклеточные (почти в 100 раз) бактерий по сравнению с аэробных условиях культивирования в момент -зависимым способом ^1. Это наблюдение было воспроизводимым с помощью двух различных C. джеджуни штаммы дикого типа (11168H и 81-176) и двух различных линий IEC (ЦАС-2 и...

Обсуждение

Использование в пробирке методами клеточной культуры для изучения взаимодействия бактериальных патогенов с клетками-хозяевами является метод широко используется во многих исследовательских лабораториях. Однако, поскольку такой анализ культуры клеток в аэробных условиях, в пробирке эти модели не могут точно представлять в естественных условиях среды, в которой хозяин-патоген взаимодействия происходят. Широко используется в моделях пробирке инфекции особенно подходят для изучен...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Специальная вертикальная диффузионная система для использования со вставками Snapwell	Гарвардский аппарат	66-0001	Коллектор и шесть камер Snapwell
Колпачки Гарвардский	аппарат	66-0020
Уплотнительные кольца	Гарвардский аппарат	66-0007
Зажимы	Гарвардский аппарат	66-0012
Фильтры Snapwell (размер пор 0,4 и мкм; m)	Corning Costar	3407
Millicell ERS-2 Вольт-Ом измеритель сопротивления	Millipore	MERS00002
WPA Lightwave II спектрофотометр		Biochrom 80-3003-72