Микроинъекция раны Анализ и<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Локализация эпидермального ран реагирования журналистам в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Эмбрионы.

Michelle T. Juarez; Rachel A. Patterson; Wilson Li; William McGinnis

doi:10.3791/50750

Методическая статья

Микроинъекция раны Анализ и

13.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50750

⸱

1 ноября 2013 г.

Michelle T. Juarez¹ , Rachel A. Patterson² , Wilson Li² , William McGinnis²

¹Sophie Davis School of Biomedical Education, The City College of New York, ²Cell & Developmental Biology, University of California, San Diego

В этой статье

Краткое содержание

Эмбриональные эпидермис очень поздно стадии дрозофилы эмбрионов обеспечивает в естественных условиях системы экспресс-анализа отклика прокол раны и может сочетаться с генетических манипуляций или химических обработок микроинъекции для продвижения исследований в заживлении ран для перевода на моделях млекопитающих.

Аннотация

Drosophila эмбрион развивается надежную слоя эпидермиса, который служит как для защиты внутренних клетки от жесткой внешней среды, а также для поддержания клеточного гомеостаза. Прокол травмы со стеклянными иглами предоставляет прямой метод, чтобы вызвать быстрое эпидермальный раны ответ, который активирует раны транскрипционные журналистам, которые могут быть визуализированы локализованной сигнала репортера в живых эмбрионов или личинок. Прокол или лазерной травмы также обеспечивает сигналы, которые способствуют набору гемоциты в месте раны. Удивительно, но тяжелой (насквозь) травма прокол в конце эмбрионов на стадии редко нарушает нормальный эмбриональное развитие, а более 90% таких раненых эмбрионов выживают до взрослого когда эмбрионы вводят в масляной средой, которая минимизирует утечки немедленно гемолимфы от прокола . Процедура рана требует микроманипуляции эмбрионов дрозофилы, в том числе ручной расстановке эмбрионов на AGар тарелки и передача выровненных эмбрионов микроскопа. Drosophila ответ эпидермального рана анализ обеспечивает быстрый систему, чтобы проверить генетические требованиям различных биологических функций, которые способствуют заживлению ран, а также способ экран для потенциальных химических соединений, которые способствуют заживлению ран. Короткий жизненный цикл и легко процедура культивирования сделать дрозофилы мощный модельный организм. Дрозофилы чистым заживление раны появляется координировать эпидермальный регенеративный ответ, с врожденной иммунной реакции, способами, которые до сих пор под следствием, что обеспечивает отличную систему, чтобы найти консервативный регулирования механизмы, общие для дрозофилы и млекопитающих эпидермального ранения.

Введение

Манипуляция эмбрионов дрозофилы с помощью метода, микроинъекции является устоявшихся анализ ^1. Значимость метода эпидермального рана ответ репортера является сочетание протокол для прокола / микроинъекции с люминесцентными журналистами и визуализировать реакцию в естественных условиях на повреждение эпидермиса у эмбрионов дрозофилы. Цель этого метода заключается в обеспечении более широкий набор ученых использовать дрозофилы в качестве инструмента для исследования процессов, которые регулируют транскрипцию ответ на повреждение эпидермального прокола. Однослойного эпидермиса у дрозофилы предоставляет простую систему для изучения-ответ эпидермального раны после травмы прокола ^2. Drosophila эмбрион является надежным модельной системой для генетически препарировать этапы заживления ран, в том числе ответ раны, воспаления и реэпителизации ^3. Это отчасти потому, что многие или большинство зиготических мутанты выжить до конца embryogenesявляется и развитие эпидермиса барьеров, даже когда структурирование развития идет глубоко наперекосяк. Предыдущий характеристика хорошо сохраняется фактора транскрипции Grainy головы (GRH), установлено, что Grh-гены-мишени дофадекарбоксилаза (DDC) и тирозингидроксилазы (Чехии) транскрипционно активируется по сайтам травмы ^4. Дрозофилы в качестве модельного организма для заживления ответ обеспечивает дополнительную линию исследования для продвижения исследований в млекопитающих заживления ран ^5. Последующие исследования выявили дополнительные раны, вызванной гены дрозофилы и разработали «инструментарий» многих люминесцентных раневых журналистами для мониторинга в естественных условиях эпидермальный раны ответ для очистки ранив ^6. Недавние сообщения о регулировании дрозофилы заживления ран были сосредоточены на фенотип закрытия раны, позволяя открытие многих путей, регулирующих клеточную миграцию ^7,8. При анализефлуоресцентные раны репортеры, наши исследования выявили новый набор генов, необходимых для локализованной экспрессии эпидермального раневых генов, индуцируемых ^9. Одно из достоинств метода ответ рана репортера в том, что полученные результаты дают больше понимания механизма того, как сигналы трансдуцировали от места повреждения на соседние клетки. Тем не менее, одним из недостатков метода ответ рана репортера в том, что результаты не напрямую ссылаются на фенотипов в заживлении ран или ремонта. Более широкое использование чистого протокола рана прокола в генетических и химических экранов позволит новым регуляторами транскрипции ответ на эпидермальным ранив должны быть определены и далее перевод заживления ран открытий в модели млекопитающих травмы лечения.

Протокол

Протокол дрозофилы эмбриональных рана могут быть сведены в пять этапов: (1) сбор эмбрионов, (2) Эмбрион Подготовка (3) Эмбрион Ранение, (4) Эмбрион Микроинъекция, и (5) Эмбрион Фиксация.

1. Эмбрионов

Соберите взрослых мух, через 2-3 дня после eclosing, добавить 50 женщин и 25 мужчин к отбору эмбрионов клетки.
Поставьте свежий яблочный сок агар плюс дрожжевой тарелку каждое утро в течение 3-х дней.
Примечания: для оптимального по отбору эмбрионов, цикла мухи на 12 час суточного графика в инкубаторе 25 ° C (5:00 фары "ON" и 17:00 огни "OFF"); женские мухи реагировать на изменения в световом цикле и сдаст большее количество яиц во время перехода от огней "ON" на огни "OFF" ^10,11.
Во второй половине дня Дня-3, место свежего яблочного сока плюс дрожжевой агар пластины на клетке и собирать эмбрионов в течение 2 часов. Установите новую дрожжей пластину на клетке и сохранить2 коллекция ч пластины.
Храните сбора пластина для дополнительного 14 ч при 25 ° С с возрастом эмбрионов.
Примечания: Заживление ран можно анализировать на любом этапе развития Drosophila, рана-индуцированной транскрипции репортеры, описанные в данном документе, имеют оптимальную активность между этапами 15-16 ^12. К концу стадии 17, эмбрион слишком стар, чтобы легко проколоть созревания кутикулу и эффективно активировать раны журналистам или обнаружить раны, вызванной транскрипцию. Чтобы дать время сбор и ранение время происходят во время пика лабораторных часов, мы следуем график отбора эмбрионов в течение 2 часов (16:00-18:00), обменять сбора тарелку с новой пластинкой в 18:00, возраст сбор пластина при 25 ° С в течение 14 ч (в течение ночи), и наматывают эмбрионов в 08:00 (на следующий день).

2. Эмбрион Подготовка

Примечания: Этот протокол включает в себя использование многих инструментов и объектов, которые находятся острые или из гдевушка. Обращайтесь со всеми острыми инструментами и стеклянные объекты с осторожностью, чтобы избежать травм.

Аккуратно удалите эмбрионы из коллекции пластинок с кистью, добавляя 2-3 мл воды к пластине и закрученного. Перевести воду и эмбрионов от пластины к нейлоновая сетка и сбор трубки.
Добавить 4-5 мл отбеливателя на крышке пластиковой чашке Петри пластины и выдержите сетки покрытый конец коллекции пробирку, содержащую эмбрионов в отбеливателя в течение 2 мин; который удаляет внешнюю скорлупу эмбриона. Вручную поверните пробирку пару раз, чтобы предотвратить эмбрионы из слипания в отбеливатель. Промыть эмбрионы с водой в 10 раз и высушите сетки покрыта пробирку, содержащую dechorionated эмбрионов на бумажное полотенце.
Используйте рассекает иглу передать ~ 50 эмбрионов из нейлона сетка с агаром. Мы добавляем зеленый пищевой краситель в агаром добавить контраста и помощь в выравнивании эмбриона. Под микроскопом рассекает, сделать два параллельных ряда ~ 25 эмбрионов, совместив ЭмбриOS на слайде так, что они будут находиться под прямым углом к пункционной иглы на микроинъекции аппарата. Оставьте немного места (около 1 длина эмбриона) между эмбрионов для газообмена целей. Два параллельных ряда должна быть примерно 5 мм друг от друга.
Поместите слайд с двойным скотча на верхней части выровненных эмбрионов и осторожно нажмите слайд для передачи эмбрионов с зеленой пластиной к каретке. Тогда воздух сухой эмбрионов ~ 25 мин для снижения внутреннего давления на эмбрион и предотвратить взрыв, когда ранив.
Поместите 2-3 капли галоидоуглеводородов смеси нефти за эмбрионов, чтобы предотвратить дальнейшее обезвоживание.

3. Эмбрион Ранение

Поместите эмбриона слайд в стадии впрыска микроскопа. Найти эмбрионов в поле зрения и практики перемещения этап инвертированного микроскопа.
Примечания: Перед началом работы с иглой, сосредоточены на средней плоскости зародыша вдоль дорсовентральной оси. Для обеспечения эффективного ранениявыравненные эмбрионы, начинают ранение строку ближе к устройству иглы. Перемещение на сцену, чтобы привести в верхней части строки из выровненных эмбрионов в поле зрения.
Аккуратно положите и закрепите тушеной-иглу в иглодержатель. Используйте микроманипулятор для перемещения иглы вниз к слайду. Совместите стрелку с эмбриона, в то же фокальной плоскости. Как только игла находится в фокусе с эмбриона, не переместить иглу с микроманипулятора.
Перемещение на сцену, чтобы проколоть эмбрион насквозь, а затем перейти к следующему эмбриона в строке. Если все сделано ранив первую строку, используйте микроманипулятор для перемещения иглы полностью вверх и в сторону от сцены до переезда слайд; вручную повернуть слайд на 180 ° и ранить второго ряда.
Храните эмбрионов под галоидоуглеводородов масла при комнатной температуре и заполните эмбриона фиксации, если делать в гибридизация или окрашивания антител (см. процедуру шаг 5). Кроме того, хранить эмбрионы в течение 4-6 ч.под галоидоуглеводородов нефти и приступить к раневой транскрипции люминесцентные репортер визуализации (репрезентативные результаты).
Примечания: Для визуализации флуоресцентного репортера, мы обезболить эмбрионов, используя 50% 1-фенокси-2-пропанол ^13. Эмбрионы удаляются из фторо-углеродное масло и помещали на новый слайд. Мы размещаем стеклянные бусы вокруг эмбрионов, добавить несколько капель анестетика, и место покровное стекло на эмбрионах.

4. Эмбрион Микроинъекция

Примечания: микроинъекции аппарат, который мы используем в протоколе не автоматизирован, чтобы доставить удельный объем во время теста. Мы добавляем краситель к решению визуализировать микроинъекции и попытаться нормализовать объем доставлено. Если слишком много раствор вводят в эмбрионе, желточной оболочки лопнет.

Нагрузка игла с тыла с 1 мкл химическим раствором плюс красителя (например, 0,6 М H ₂ O _2). Разрешить капиллярДействие обратить химического раствора к наконечнику иглы.
Чтобы сломать иглу, место покровное стекло под углом на слайде и пальто края со смесью нефти галоидоуглеводородов. Принесите установленный иглу в фокусе с краю под углом покровным и осторожно двигаться покровным край через кончике иглы, пока не нарушена. Надавите на микроинъекции аппарата и убедитесь, что химический раствор плюс краситель течет иглу.
Поместите слайд, содержащий выровненные эмбрионов на столике микроскопа. Продолжать сосредоточиться эмбрион и иглу в одной плоскости. Одновременно проколу и microinject химический раствор плюс красить в каждого эмбриона.
Примечания: Засорение иглы происходят часто; сломать новую иглу, чтобы избежать неполного микроинъекции. Чаевые тупой иглой не ранит, как чисто, как под углом кончика иглы. Регулировка покровное к не углом 90 ° в течение поломки является оптимальным для получения углом кончик иглы.

5. Формальдегид Fixation

Примечания: Химические вещества, используемые в этой фиксации Drosophila вредны. Используйте средства индивидуальной защиты (например, перчатки, лабораторный халат и защитные очки) при обращении с химическими веществами. Следуйте отдельные институциональные рекомендации по утилизации регулируемых химических веществ.

После ранения, подождите 15, 30, 60, или более минут для активации транскрипции раны, вызванной генов произойти. Для удаления эмбрионы из нагнетательных горками, тщательно слейте смесь масла Галокарбоновое из слайдов, опереться слайд против стойку и промокните конец с Kimwipe.
Используйте стеклянную пипетку, чтобы ополоснуть гептан над горкой и мыть полоскания жидкость в стеклянную чашку Петри. Гептан растворится ленту и отпустите эмбрионов. Продолжайте промывать, пока все эмбрионы не будут удалены из слайда. Перейдите к следующему слайду, пока все эмбрионы не будут удалены из слайдов.
Перенести гептан плюс решение эмбриона от стеклянную посуду в 20 мл научноntillation флакон. Встряхните флакон в течение 2-3 мин, снять гептан и добавить 5 мл свежей гептана.
Добавьте 5 мл свежей, фиксирующем растворе (см. список реагентов для рецепта). Закройте флакон крышкой и прикрепить к орбитальной платформы шейкере. Встряхните флакон, содержащий зародыши для 25 мин при 220-230 оборотов в минуту.
После встряхивания, пускать пузыри на границе поп-музыки. Полностью удалить нижнюю водную фазу, с помощью пипетки, избегая подтягивания эмбрионов. Нижний слой состоит из фиксирующего раствора и должны быть утилизированы должным образом.
Добавьте 5 мл метанола, колпачок флакона и энергично встряхивают вручную в течение 20-30 сек, водоворот и поместить его на скамейке запасных. Раненые эмбрионы останется в интерфазе и не будет опускаться на дно.
Примечание: После фиксации желточной оболочки из эмбриона без ран, как правило, взрыв во время стадии дегидратации с метанолом. Тем не менее, желточной оболочки в раненой эмбриона уже сломан, и шаг обезвоживание не будет удалять желточной коррране. Рука-devitellinzation для ее завершения требуется протокол фиксации.
Осторожно снимите верхний слой гептан, а затем добавить 5 мл свежим метанолом. Встряхните флакон и эмбрионы должны тонуть.
Удалите метанол плюс решение эмбриона с стекло пипетки и собрать в нейлоновой сеткой пробирку в стеклянную посуду.
Удалите метанол и промойте эмбрионов с раствором 1x PBS.
Перенесите эмбрионы из нейлоновой сетки с соком пластины яблоко. Распространение эмбрионов вдоль поверхности пластины.
Перенесите эмбрионы в двойной скотч стекло. Покройте эмбрионов с 1x PBS.
Примечания: Эмбрионы, как правило, комок из-за желточной оболочки. Использование место сок яблочный позволяет быстро разделения слипаются эмбрионов. Эмбрионы должны быть удалены с пластинки и переносили в двойной скотч стекло, потому что эмбрионы погружаются в чашки с агаром при приложении силы, чтобы удалить из эмбрионажелточной оболочки.
Осторожно вставьте эмбрионов с препаровальной иглы "поп" желточной оболочки. Эмбрион должен тонуть в PBS.
С помощью стеклянной пипетки для передачи 1X PBS плюс эмбрионов в 1,5 мл трубки. Промыть эмбрионы с 1x PBS и хранить при температуре 4 ° С. Перейдите к обезвоживанию эмбрионов, используя этанол: Series PBS и продолжить в гибридизация или Иммунолокализация протокола ^14.

Результаты

Чтобы получить результаты, показанные в этом методе, открытая рамка считывания из зеленого флуоресцентного белка (GFP) сливают с промотором / раны, вызванной последовательности энхансера от дофадекарбоксилаза (DDC) и DsRed слита с последовательностью энхансера рана от тирозингидроксилазы ( Чехии) ^4,6. В прямом Drosophila эмбриона, созревание флуоресцентного репортерного белка рана является оптимальным 4-6 ч после ранения, что позволяет время для накопления достаточной для визуализации белка, а также время для флуоресцентного белка окислить до флуоресцентного состояния ^15. Для наблюдения локализации репортер, соединение флуоресцентный микроскоп достаточно. Чтобы соблюсти большее увеличение локализации репортера, конфокальной микроскопии является оптимальным для создания максимальный выступ нескольких оптических срезов (рис. 1). Конфокальной в естественных изображений эмбрионов Drosophila осложняется раПИД неровности эмбриона. . Полный вид эмбриона могут быть получены с 20X объективной и крупным планом раневого сайте можно получить с 40Х цели. Вид сверху локализации раны репортера эпидермиса могут быть отображены с 10 последовательными 1 мкм оптических срезов. Бокового зрения локализации раны репортера эпидермиса могут быть отображены с 40 последовательными 1 мкм оптических срезов.

Используя стандартные методы генетической пересечения, можно объединить раны журналистам с генетическими мутациями. Одним из примеров в данной работе является Flotillin-2 (Flo-2), так как с потерей функции (нулевой аллель генерируется со вставкой P-элемента) и коэффициента усиления из-функции (сверхэкспрессию сгенерированный с повсеместной экспрессии во всех клетках) мутанты из FLO-2 демонстрируют генный продукт Flo-2 необходимо и достаточно, чтобы ингибировать локализации DDC-GFP раны репортерам ⁹ (фиг.2А и 2В). Использование миПротокол croinjection, можно проверить, ингибирует ли введение химические растворы superactivates или локализацию раны журналистами. Химически раненых эмбрионы были одновременно ранеными и вводят в соотношении 1% толуидиновым синим красителем и растворенных соединений 1:04. Толуидиновым синим красителем разрешено для визуального подтверждения растворенных соединений, введенного в полость тела. Контрольных эмбрионов были ранены со сломанной иглы, содержащей 1:04 соотношение количества 1% толуидиновым синего красителя и растворенного вещества без химических веществ. Два примера, представленные в данном документе, являются перекись водорода (H ₂ O ₂₎ и метил-β-циклодекстрина (MβCD), потому что обе химические растворы являются достаточными для глобально активировать локализация DDC-GFP раны журналистам ⁹ (рис. 2С и 2D) . Перекись водорода (H ₂ O ₂₎ разводили в H ₂ O до 0,6 М. метил-β-циклодекстрина (MβCD) растворяли в 1 ММ NaOH до 3 мм. Использование протокола эмбрион фиксации, то можно обнаружить активацию транскрипции генов раневых реагирования в локализованной области, окружающий раны. Одним из примеров в данной работе является гибридизация РНК зондов в обнаружить DDC и с помощником стенограммы ^4,6,9 (рис. 3а и 3б).

figure-results-1
Рисунок 1. DDC-GFP и PLE-DsRed раны репортер локализации. Светлое и флуоресцентные изображения в раненых эмбрионов дикого типа. (А) вид сверху DDC-GFP раны репортера. (B) Топ-вид PLE-DsRed раны репортер. Все изображения были собраны на Leica SP2 конфокальной микроскопии, с 20-кратным цели. Стрелками сайт раны. Пунктирными линиями на панели данныхс пометить очертания эмбрионов. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

figure-results-2
Рисунок 2. Локализация ДКД-GFP раны репортером в генетических мутантов происхождения и химических микроинъецировали эмбрионов. Светлое и флуоресцентные изображения раненых Flotillin-2 (Flo-2) мутантных эмбрионов. (А) с потерей функции Flo-2 {KG00210} мутантов, расширение репортера деятельности во всех клеток эпидермиса. (В) Прибыль-из-функции Flo-2 (броненосец-GAL4, UAS-FLO2) мутанты, ингибирование репортера деятельности во всех клеток эпидермиса (С) перекиси водорода. (H ₂ O ₂ ) решение микроинъекции, расширение респOrter деятельность во всех клеток эпидермиса. (D) Метил-β-циклодекстрина (MβCD) решение микроинъекции, расширение репортера деятельности во всех клеток эпидермиса. Все изображения были собраны на Leica SP2 конфокальной микроскопии, с 20-кратным цели. Стрелками сайт раны. Пунктирные линии в панелях данных отмечают очертания эмбрионов. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

figure-results-3
Рисунок 3. Обнаружение реагирования рана ген РНК-транскриптов. Флуоресцентные изображения в гибридизация и обнаружения РНК в раненых эмбрионов дикого типа. Ddc (А) и PLE (В) РНК-транскрипты накапливаются вокруг раны. Все изображения были коллективноТед на Leica SP2 конфокальной микроскопии, с 20-кратным цели. Стрелками сайт раны. Пунктирные линии в панелях данных отмечают очертания эмбрионов. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

figure-results-4
Таблица 1. Резюме журналистов реагирования эпидермального рана. Вставки из четырех репортеров реагирования рана (DDC, образца, MSN, ККВ) доступны на обоих второго и третьего хромосом. Все из репортеров реагирования рана активировать ген флуоресценции (GFP) или DsRed в ограниченном количестве эпидермальных клеток, окружающих место повреждения прокола в дикого типа фона (например, "местный" фенотип). DDC и MSN раны репортеры ответа требуют GRH для активация fluorescenГен се после травмы прокола (например, "ни один" фенотип). Все раны журналистами требуют Flo-2 для локализации гена флуоресценции после травмы прокола (например, "глобальный" фенотип). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Обсуждение

Непосредственным транскрипционный регуляторный реакция на внешние сигналы позволяет клеткам координировать локализованную ответ на внеклеточные стимулы, который может включать стресс, повреждение или инфекцию. Ненадлежащее управление локализованной ответ может иметь разрушительные последствия для соседних клеток, а также пустая трата ресурсов на ремонт травмы. Дрозофилы эмбрионов обеспечивает отличную систему для проведения основных раны заживление эксперименты в недорогом и удобном для поддержания модельного организма. Потенциал для сотрудничества между исследованиями в других модельных организмов и дрозофилы предоставляет уникальную возможность изучить многие биологические вопросы.

Еще один метод из раны репортеров является генетический комбинацию мутантного слоев, что обеспечивает эффективный способ для тестирования вклад новых генов к активации ответного пути эпидермального рана. У нас есть эпидермиса раны, вызванной транскрипционные репортеры пр.ailable как на ^2-м и ^3-м хромосом ^5. В этом исследовании мы используем UAS и GAL4 системы избыточной экспрессии ^16. Для исследований с летальными мутантных аллелей мы определяем генетический фон, используя флуоресцентный балансировки хромосому, например Kruppel-GFP ^17. Мы проанализировали рана репортер локализацию в нескольких генетического происхождения (табл.1).

Возможная модификация метода заключается в сочетании микроинъекции и ранив. Микроинъекция могут быть использованы для введения химического раствора в эмбрионе. Некоторые химические соединения были проверены и были найдены, чтобы регулировать деятельность эпидермального раневых журналистами ^9. Этот метод одновременного ранения и микроинъекции могут быть полезны для увеличения количества клеток в эмбрионе дрозофилы, которые отвечают сигнал раны и может быть непосредственно использована для отслеживания изменений экспрессии генов после ранения ¹⁸. Будущее применение метода микроинъекции будет испытать новые химические вещества для регуляции ответа эпидермального раны.

Drosophila в качестве модельной системы для генетических исследований предлагает широкий ассортимент простых протоколов эффективно решать сложные вопросы. Недавние сообщения о целесообразности методов Drosophila подчеркивает использование гемоцитов миграции ¹⁹ и паразитарной осы инфекции ²⁰ в качестве средства дальнейшего расширения влияния научно-исследовательского сообщества Drosophila. В дополнение к раневой исследований ремонтных, дрозофилы обеспечивает классическую модель для регенерации с системой имагинального диска ^21,22. Объединенные достижения в имагинальных исследований регенерации диска и прокол / микроинъекции ранения обеспечивает отличную систему для обнаружения хорошо консервативные компоненты восстановления тканей.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Этот протокол был разработан в сотрудничестве с предыдущих членов McGinnis Lab, Ким А. Мейс и Джозеф С. Пирсон. Мы благодарим продолжающиеся усилия в Блумингтон дрозофилы Stock Center для их работы по организации и распространение ценных запасов. Эта работа была поддержана финансирование от Национального института здоровья (R01 GM077197 и K12 GM68524) и семье Герберта Стерн. MTJ в настоящее время поддерживается грантом Количество 5G12RR003060-26 из Национального центра по научной ресурсов и номер гранта 8G12MD7603-27 из Национального института Об здоровья меньшинств и неравенствам в отношении здоровья. Содержание является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института по меньшинств здоровье и здоровье диспаритета или Национальных Институтов Здоровья.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
дрожжи	Sigma Aldrich	51475
яблочный сок	Дженерик
агар	Fisher Scientific	50-824-297
отбеливатель	Дженерик
галогенное масло, 700 Вт	Sigma Aldrich	H8898
галогенное масло, 27 Вт	Sigma Aldrich	H8773
1- фенокси-2-пропанол	Sigma Aldrich	484423
перекиси водорода	Fisher Scientific	H324
метил-&бета;-циклодекстрин	Sigma Aldrich	C4555
толуидин синий	Sigma Aldrich	89640
формальдегид, 16%	Polysciences, Inc	18814-20	токсичное химическое
вещество гептан	Fisher Scientific	H360-1	токсичное химическое вещество
метанол	Fisher Scientific	A412-1	токсичное химическое вещество
10x PBS	Fisher Scientific	50-899-90013
0,5 м EGTA	Fisher Scientific	50-255-956
РНКаза без H<суб>2O	Fisher Scientific	BP2819-100
Drosophila инкубатор	Genessee Scientific	59-197
клетка	для мух Genessee Scientific	59-100
пробирка для сбора эмбрионов	Genessee Scientific	46-101
пластиковая чашка Петри	Fisher	Scientific 50-202-037
лента с двойным стиком	Дженерик

игла для пресечения	Fisher Scientific	08-965A игла	для острого предмета
стеклянная крышка скользка	Thermo Scientific	3306
предметное микроскоп для препарирования	Thermo Scientific	4445	острых предметов
	Carl Zeiss	Stemi-2000
капиллярная игла	FHC	30-30-1	для острого предмета
игольчатый съемник	Narishige	PC10
микроинъекционный иглодержатель	Narishige	MINJ4
микроманипулятор	Narishige	MN151
инвертированный микроскоп	Carl Zeiss	Primo-Vert
стеклянная чашка	Петри Fisher Scientific	08-747A	острые предметы
стекло пипетка	Пастера Fisher Scientific	22-063-172	острых предметов
	Fisher Scientific	03-448-25
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
сцинтилляционный флакон	Fisher Scientific	03-337-7	для острых предметов
	Fisher Scientific	14-259-260
1,5 мл туба	Fisher Scientific	05-408-129
лазерный сканирующий конфокальный	фиксации Leica	SP2
	(5 мл)
16% формальдегид	2,5 мл		токсичное химическое вещество
10x PBS	0,5 мл
0,5 м EGTA	0,5 мл
РНКазы без H<суб>2О	1,5 мл
Смесь галоуглеродных масел	(10 мл)
галоидоуглеродное масло, 700 Вт	5 мл
галоидоуглеродное масло, 27 Вт	5 мл

кисть Дженерик для препарирования лампа для переноса орбитальный шейкер раствор

Ссылки

Germeraad, S. Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA. Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).
Payre, F. Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).
Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head. Science. 308 (5720), 381-385 (2005).
Ting, S. B., Caddy, J., et al. A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice. Science. 308 (5720), 411-413 (2005).
Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, Ø, McGinnis, W. Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).
Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair. Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).
Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes. Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).
Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila. PLoS Genet. 7 (12), e1002424(2011).
Allemand, R. Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).
Allemand, R. Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster. Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).
Pierre, S. E., Thurmond, J. FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase. Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).
Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. 1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology. J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).
Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846(2004).
Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP. BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).
Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
Casso, D., Ramírez-Weber, F., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).
Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila. PloS one. 8 (4), e61773(2013).
Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations. J. Vis. Exp. (36), e1696(2010).
Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J. Vis. Exp. (63), e3347(2012).
Repiso, A., Bergantiños, C., Corominas, M., Serras, F. Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs. Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).
Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs. Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).