Методическая статья

Противоопухолевые комплексы металлов: синтез и цитотоксичности оценка по методу МТТ-анализ

DOI:

10.3791/50767

⸱

10 ноября 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способ синтеза титана и ванадия противораковых агентов воздушных чувствительных описано, вместе с оценкой их цитотоксической активности по отношению к клеточной линии рака человека со стороны МТТ.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Титана (IV) и ванадий (V) комплексы весьма эффективными противораковыми агентами. Проблема в их синтезе относится к их гидролитической нестабильности, поэтому их получение должно проводиться в инертной атмосфере. Оценка противоопухолевой активности этих комплексов может быть достигнуто с помощью МТТ-анализе.

МТТ-анализ представляет собой колориметрический анализ жизнеспособности на основе ферментативного восстановления молекулы МТТ до формазана, когда она подвергается воздействию жизнеспособных клеток. Исход сокращения является изменение цвета молекулы МТТ. Измерения оптической плотности относительно контроля определить процентное соотношение оставшегося жизнеспособные раковые клетки после их обработки с различными концентрациями тестируемого соединения, что в переводе на соединения противоопухолевой активности и ее IC 50 значений. МТТ является широко распространенным в цитотоксичности исследований из-за его точности, быстроты и относительной простотой.

При этом мы заранеенаправил подробный протокол для синтеза чувствительны воздуха металла на основе наркотиков и измерений жизнеспособность клеток, включая подготовку клеточных пластин, инкубации соединений с клетками, измерения жизнеспособности с помощью МТТ, и определение IC 50 значений.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Химиотерапия остается одним из основных курсов лечения, применяемых в клинике для различных раковых заболеваний, и, следовательно, огромное количество исследований проводится по всему миру с целью разработки новых и усовершенствованных противоопухолевых препаратов. Такие исследования в основном начинаются в химическом уровне, с проектирования и подготовки соединений, а затем биологической оценки цитотоксических свойств в пробирке. Жизнеспособность клеток может быть определена с помощью различных анализов, которые обеспечивают информацию о клеточной активности 1-2.

Цисплатин является примером комплекса платины, который широко используется в качестве химиотерапевтического препарата, который считается эффективное лечение в основном для яичек и яичников 3-4. Тем не менее, его узкий диапазон деятельности и серьезные побочные эффекты вызывают исследования других мощным комплексов переходных металлов 5-8. В частности, титана (IV) и ванадий (V) комплексы показали обнадеживающие результаты высокой активности и уменьшениетоксичность 9-16. Ti (IV) комплексы были первыми, чтобы войти клинические испытания после цисплатин из-за этих свойств, однако они не смогли испытания из-за трудностей разработки и гидролизного нестабильности. Существует, таким образом ток необходимость в разработке улучшенных производные этих комплексов металлов, которые могут сочетающих высокую противоопухолевую активность с водостойкость 15,17-21.

Проблема в подготовке Ti (IV) и V (V) комплексы относится к гидролитической нестабильности реагентов-предшественников, поэтому инертная атмосфера должна быть сохранена. Получение (V) соединений Ti (IV) и V проводится в атмосфере N2 или Ar условий в перчаточном боксе, или с использованием методов Шленка строки.

Один общий метод для оценки противораковой активностью на основе MTT (3 - (4,5-диметилтиазолил) -2,5-дифенилтетразолийбромид) анализ. Этот анализ является колориметрический жизнеспособность анализ, который был представлен в 1983 году Mosmann22. Это очень хорошо изучены и характеризуется, и это считается весьма эффективным при оценке эффективности новых цитотоксических соединений из-за его точности, быстроты, и его способность быть применены на различных клеточных линиях. Это жизнеспособность анализ основан на изменении цвета молекулы МТТ, когда она подвергается воздействию жизнеспособных клеток. Измерение оптической плотности, которое пропорционально числу жизнеспособных клеток, а по сравнению с необработанными контрольными, позволяет оценку ингибирования роста клеток возможностей тестируемого соединения.

МТТ колориметрический анализ проводят в формате 96-луночного планшета 23. Эти клетки могут потребовать предварительной инкубации в лунки перед добавлением испытуемого препарата. Времена предварительной инкубации может варьировать от 0-24 часов в зависимости от свойств клеточных линий. Клетки обычно воздействию препарата на 24-96 ч в зависимости от активности лекарственного средства. Раствор МТТ затем добавляют к обработанных клеток, где YELLМТТ вл снижается до фиолетового формазана различными митохондриальных и цитозольных ферментов, которые действуют в жизнеспособных клеток (фиг. 1) 24. Молекула МТТ не уменьшается мертвых клеток или эритроцитов (метаболически неактивные клетки), клеток селезенки (покоящиеся клетки) и лимфоциты конканавалин А-стимулированной (активированные клетки) 22. После 3-4 часов инкубации МТТ формазана выпадает в осадок. Формирование формазана начинается после 0,5 ч инкубации но для достижения оптимальных результатов лучше подвергать клетки МТТ в течение по крайней мере 3 ч. 22. Следовательно, выращивание среду удаляли и формазана растворяют в органическом растворителе, предпочтительно изопропанол 25, хотя ДМСО могут быть также использованы 26. Ликвидация среды имеет решающее значение для достижения точных результатов, поскольку фенола красного, который широко распространен в среде роста, и осаждения белков может создавать помехи для измерения оптической плотности 25. Когда FormaРаствор зан достигает однородной, оптическая плотность раствора измеряют с использованием микропланшет-ридера спектрофотометра. Поглощение при 550 нм прямо пропорциональна числу клеток в диапазоне 200-50,000 клеток на лунку, и таким образом очень малые количества клеток могут быть обнаружены 22. Оптическую плотность указывает на количество жизнеспособных клеток, которые остались после обработки лекарственным средством и по сравнению с оптической плотности контрольных клеток, которые не подвергались воздействию препарата. Анализ результатов по соответствующим программным обеспечением обеспечивает (концентрация ингибирования; 50%) IC 50 значения и их статистические ошибки на основе нескольких повторений измерения.

МТТ является широко распространенным в цитотоксичности исследований для скрининга новых противораковых соединений, благодаря своей точности и относительной простоты. Однако, когда с помощью МТТ-анализа, который зависел от ферментативной реакции, необходимо учитывать, что различные ингибиторы ферментов может повлиять на снижение МТТ ANг привести к ложным результатам 27. Кроме того, МТТ не дает никакой информации о молекулярном механизме цитотоксической активности препарата 2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Подготовка V (V) комплекс (рис. 2); 18 поведение шаги 1.1-1.4 в перчаточной ящик, если перчатка-поле недоступно, перейдите к альтернативы шаги 2 (2.1-2.6).
    1. Растворите 0,42 ммоль лигандов H 2 L в сухом ТГФ и добавить его в перемешивании к раствору эквивалентных количеств VO (O я Pr) 3 в ТГФ.
    2. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 мин, и удалить летучие вещества в вакууме.
    3. Добавить холодную гексан и удалить его в вакууме. Темно-фиолетовый порошок должен быть получен с количественным выходом.
    4. Взвешивание 8 мг соединения, полученного в флакон Эппендорфа. Перейти к шагу 3.
  2. Подготовьте (V) комплекс с использованием линии Schlenk.
    1. Растворите 0,42 ммоль лиганда H 2 л в сухом ТГФ в сухом колбе Шленка с перегородкой крышкой, приложите к линии Шленка и применять переменный вакуум / инертный газ (N 2 или Ar) среды; рекомендуется применять три секуч раундов и ждать 2-5 мин на вакуумных этапа.
    2. Добавить сухом ТГФ при помощи шприца через мембрану крышки.
    3. Добавить эквивалентных количеств В.О. (O I Pr) 3 в растворе ТГФ, который был подготовлен аналогично за счет подключения надлежащего сухой колбе Шленка на линию, применяя инертной среде и добавления реагентов через шприц от ванадия решение, что из лиганд.
    4. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 мин и удаления летучих веществ в вакууме, если существует опасение, неустойчивых продуктов, выполнять типа Шленка перегонки летучих веществ в атмосфере инертного газа; использовать инертный газовый поток приложить необходимое посуды, которые были предварительно сушат .
    5. Добавить холодную гексан и удалить его в вакууме. Темно-фиолетовый порошок должен быть получен с количественным выходом.
    6. Взвешивание 8 мг соединения, полученного в флакон Эппендорфа.
  3. Подготовка Ti (IV) комплекс (рис. 2); 28 поведение шаги 3.1-3.3 в перчаточном коробки, если перчатка-поле недоступно, настроить альтернативные шаги обсуждались на ванадия аналога (шаг 2), которые используют линию Schlenk вместо этого.
    1. Растворите 0,35 ммоль лиганда H 2 л в сухом ТГФ и добавить его в перемешивании к раствору эквивалентных количеств Ti ​​(O я Pr) 4 в ТГФ.
    2. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов. Удаление летучих веществ в вакууме с получением желтого продукта с количественным выходом.
    3. Взвешивание 8 мг соединения, полученного в флаконе Эппендорфа.
  4. Подготовка HT-29 клетки 96-луночный планшет
    1. Культура HT-29 клетки в 75 см 2 колбе с RPMI-1640, содержащей 1% пенициллина / стрептомицина антибиотики, 1% L-глутамина и 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), при 37 ° С с 5% СО 2 .
    2. Снимите среду, когда НТ-29 клетки достигают максимального слияния (90-100%, каждые 3-4 дня без субкультуры). Промыть 1 млтрипсина (0,25%) / ЭДТА (0,05%) Решение и снимите ее.
    3. Добавить 1 мл трипсина (0,25%) / EDTA (0,05%) раствора и инкубируют в течение 5 мин.
    4. Отсоединение HT-29 клетки из колбы и добавляют 10 мл среды для отключения активности трипсина. Передача 5 мл смеси клеток в пробирку.
    5. Используйте пипетки для передачи несколько капель смеси клеток в камеры счетчика. Счетчик камера включает в себя 5 х 5 квадратов.
    6. Граф клеток в 5 представительств квадратов с помощью микроскопа: в 4 квадратов в углах и тот, который находится в середине.
    7. Подсчитать количество клеток, присутствующих. Подводя клетки в 5 представительств квадратов и разделить на 20.
    8. Разделить 0,6 по результату шага 4.7. Полученный число это количество смеси клеток, необходимого на пластине. Этот расчет относится к пластине, содержащей 0,6 × 10 6 клеток (9000 клеток на лунку).
    9. Используйте пипетку, чтобы перевести сумму смеси клеток, необходимого на рпоздно (рассчитанный в разделе 4.8) и добавить 13,2 мл среды (200 мкл на лунку × 66 скважин).
    10. Добавить смесь до 96-луночного планшета на 11-канальной пипетки (200 мкл на лунку, 6 линий, 66 скважин в сумме). Один хорошо каждой линии должен оставаться пустым пустой контроля.
    11. Инкубировать при 37 ° С с 5% CO 2 в течение 24 часов, чтобы позволить клеткам прикрепиться к пластине.
  5. Введение соединений
    1. Добавить 200 мкл (или разное количество в зависимости от желаемого диапазона концентраций) сухого ТГФ до 8 мг каждого соединения взвешивали как описано в стадии 1,4 (или 2,6) или 3,3. Взвешивание 8 мг лиганда H 2 л, тоже.
    2. Развести каждый сложный раствор путем добавления 60 мкл ТГФ в 9 различных флаконов Эппендорф.
    3. Перевести с пипеткой 60 мкл из смеси в разделе 5.1 на первый Эппендорф флакона, ресуспендируют и передачи 60 мкл до следующего флакона, и так далее, пока 10 различных концентрациях не оbtained (в том числе материнской смеси в разделе 5.1).
    4. Развести 20 мкл каждой концентрации в ТГФ с 180 мкл среды.
    5. Приготовьте раствор управления только ТГФ; 20 мкл ТГФ с 180 мкл среды в каждом измерении.
    6. Добавить 10 мкл из полученного раствора (в том числе контроль ТГФ), в каждую лунку, который уже содержит 200 мкл вышеуказанного раствора клеток в среде с получением конечных концентраций соединения до 200 мг / л (диапазон концентраций может изменяться в зависимости от соединения активности).
    7. Вы можете наблюдать некоторую осадков при самой высокой концентрации применяется в зависимости от растворимости соединения.
    8. Повторите каждое измерение составных 3x (3 строки в пластине того же соединения); каждая строка содержит: клетки, обработанные соединением в 10 различных концентрациях, а один содержащих клеток, обработанных только растворителем для контроля и 1 хорошо без клеток для пустой управления.
    9. Выдержите загруженной пластины в течение 3 дней при 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы.
  6. Измерение цитотоксичности с помощью МТТ
    1. Готовят раствор МТТ путем добавления 1 г порошка МТТ в 200 мл раствора RPMI-1640 без фенолового красного. Исходный раствор можно разделить на 15 мл пробирки и хранили в -20 ° C.
    2. Добавить 20 мкл раствора МТТ в каждую лунку с помощью 11-канального дозатора (за исключением контрольных лунок контроля без клеток из шага 4,10), и инкубировать пластины для дополнительной 3 часов.
    3. Снимите среднюю решение от каждой лунки.
    4. Добавить 200 мкл изопропанола в каждую лунку, чтобы растворить формазана. Размешайте пластину в течение 0,5 часа, пока однородность не будет достигнута.
    5. Измеряют поглощение при 550 нм на 200 мкл вышеуказанного раствора на микропланшет-ридере спектрофотометра.
    6. Повторите каждое измерение (что включает в себя 3 повторений, см. шаг 5.8) на 3 разные дни.
    7. Рассчитать тон процент жизнеспособности клеток путем вычитания пустой значение абсорбции управления из измеренной величины, разделив результат на поглощение в ТГФ контрольного значения растворителей и умножением на 100%.
    8. Рассчитать значения IC50 с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (или эквивалент).
    9. Сообщили IC 50 представляет собой среднее значение всех значений IC 50, собранных на по крайней мере три разные дни, а значение ошибки стандартное отклонение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Комплексы были подготовлены на основе установленных процедур 18,28 и их чистота может быть оценена с помощью ЯМР и элементного анализа.

Данные, полученные от МТТ анализируется для оценки цитотоксичности соединения 18,21. Во-первых, вычитание заготовки величиной абсорбции управления от всех других значений выполняется. Во-вторых, ТГФ контрольное значение растворитель установлен на 100% жизнеспособность, а не добавляли рост ингибирующего соединения. Все остальные значения...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способ, описанный в этой рукописи сочетает в себе химический синтез с биологического анализа жизнеспособности клеток. Как и с любым биологических методов, касающихся жизнеспособных клеток, жизненно важно работать в ламинарным укрытием, и поддерживать стерильные условия, в том числе с использованием стерильных органических растворителях. Кроме того, подготовка и хранение лекарственных средств гидролитически нестабильны на основе металла следует проводить в инертных условиях, для которых камере с перчатками или Шленка лин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование было получено от Европейского исследовательского совета при рамочной программы Европейского сообщества Седьмой (FP7/2007-2013) / не ERC соглашение Грант не [239603]

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Reagent/Material
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Biological Industries04-007-1A
Hexane ARGadot830122313Высушено с помощью системы сушки растворителем
HT-29 клеточная линияATCCHTB-38
Изопропанол ARGadot830111370
L-глутаминБиологическая промышленность03-020-1B
MTTSigma-AldrichM5655-1G Антибиотики
пенициллин/стрептомицинБиологическая промышленность03-031-1B
RPMI-1640 с феноловым красным с L-глутаминомSigma-AldrichR8758
RPMI без фенола красныйBiological Industries01-103-1A
Тетрагидрофуран (ТГФ) AR Gadot830156391высушен с использованием системы сушки растворителем
Ti(OiPr)4Sigma-Aldrich205273-500MLвлагочувствительный
Trypsin/EDTABiological Industries03-052-1B
VO(OiPr)3Sigma-Aldrich404926-10Gвлаги sensitive
Equipment
12-канальный пипетка 30-300 μ lThermo Scientific
12-канальный дозатор 5-50 μ lFinnpipette
75 см<суп>2 колбаNUNC156472
96-луночный планшет с крышкой (плоское дно)NUNC167008
CO2 Binder IncubatorBinderAPT.line C150
CounterchamberMarienfeld-Superior650030
Флакон EppendorfKARTELL
БардачокM. Braun
Ламинарный капюшонADS LAMINAIREOPTIMALE 12
Микропланшетный ридер спектрофотометрBio-TekEl-800
МикроскопNikonEclipse TS100
Пипетка 20-200 μ lПипетка Finnpipette
5-50 μ lФиннпипетка

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).
  2. Hatok, J., et al. In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells. Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).
  3. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
  4. Muggia, F. Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).
  5. Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. New trends for metal complexes with anticancer activity. Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).
  6. Ott, I., Gust, R. Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs. Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).
  7. Desoize, B. Metals and metal compounds in cancer treatment. Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).
  8. Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. Antitumour metal compounds: more than theme and variations. Dalton Transactions. , 183-194 (2008).
  9. Meléndez, E. Titanium complexes in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 309-315 (2002).
  10. Evangelou, A. M. Vanadium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 249-265 (2002).
  11. Djordjevic, C. Antitumor activity of vanadium compounds. Metal ions in biological systems. 31, 595-616 (1995).
  12. Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C. Anticancer titanium agents. Expert Opinion on Therapeutic Patents. 11, 969-979 (2001).
  13. Caruso, F., Rossi, M. Antitumor titanium compounds. Mini-Review in Medicinal Chemistry. 4, 49-60 (2004).
  14. Kostova, I. Titanium and vanadium complexes as anticancer agents. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).
  15. Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A. Cytotoxic Titanium(IV) Complexes: Renaissance. European Journal of Inorganic Chemistry. , 2203-2218 (2009).
  16. Buettner, K. M., Valentine, A. M. Bioinorganic Chemistry of Titanium. Chemical Reviews. 112, 1863-1881 (2012).
  17. Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species. Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).
  18. Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis. Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).
  19. Tzubery, A., Tshuva, E. Y. Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies. Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).
  20. Tshuva, E. Y., Peri, D. Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis. Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).
  21. Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands. Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).
  22. Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival - Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays. Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).
  23. Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay. Journal of Visualized Experiments. (26), e1191(2009).
  24. Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).
  25. Denizot, F., Lang, R. Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival - Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability. Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).
  26. Alley, M. C., et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Research. 48, 589-601 (1988).
  27. Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. A practical note on the use of cytotoxicity assays. International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).
  28. Chmura, A. J., et al. Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters. Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).
  29. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).
  30. Yung, W. K. A. In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas. Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).
  31. McCarthy, N. J., Evan, G. I. Current Topics in Developmental Biology. 36, 259-278 (1997).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

IC5096

Похожие статьи