Методическая статья

Экспресс-протокол для интеграции внехромосомных матриц с высокой скоростью передачи в геном C. elegans

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50773

⸱

9 декабря 2013 г.

 ,  ,  , 
1Université Claude Bernard Lyon, 2Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaires et Cellulaires, CNRS UMR 5534

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает быструю и малозатратную процедуру интеграции трансгенных экстрахромосомных массивов в геном Caenorhabditis elegans с использованием ультрафиолетового (УФ) облучения. Кроме того, этот протокол особенно хорошо подходит для трансгенных линий, которые передают внехромосомные матрицы с высокой скоростью.

Аннотация

Микроинъекция ДНК в цитоплазму синцитиальной гонады Caenorhabditis elegans является основным методом, используемым для создания трансгенных линий, которые демонстрируют частичную и переменную скорость передачи внехромосомных массивов следующему поколению. Кроме того, трансгенные животные являются мозаичными и экспрессируют трансген в различном числе клеток. Экстрахромосомные матрицы могут быть интегрированы в геном C. elegans с помощью ультрафиолетового облучения для создания немозаичных трансгенных штаммов со 100% скоростью передачи трансгена. В этой степени F1-потомки трансгенных животных, облученных ультрафиолетом, проверяются на наличие животных, несущих гетерозиготную интеграцию трансгена, что приводит к 75% менделевской скорости передачи F2-потомству. Одна из задач этого метода состоит в том, чтобы провести различие между процентом передачи трансгенов в популяции до (X% трансгенных животных) и после интеграции (≥75% трансгенных животных F2). Таким образом, этот метод требует выбора неинтегрированной трансгенной линии с процентом трансгенных животных, который значительно ниже, чем менделевская сегрегация в 75%. Следовательно, для интеграции обычно предпочтительны неинтегрированные трансгенные линии с экстрахромосомной матрицей со скоростью передачи в следующее поколение ≤60%, а интеграция трансгенов в штаммах с высокой передачей затруднена. В данной работе показано, что эффективность интеграции экстрахромосомных матриц в геном повышается при использовании трансгенных линий с высокой передачей (≥80%). Описанный протокол позволяет легко выделить несколько независимых линий с гомозиготной трансгенной интеграцией в геном после УФ-облучения трансгенных червей, демонстрирующих высокую скорость передачи экстрахромосомных матриц. Кроме того, этот метод является достаточно быстрым и маломатериалоемким. Возможность быстрой генерации различных линий, экспрессирующих тот или иной интегрированный трансген, представляет большой интерес для исследований, посвященных структуре и регуляции экспрессии генов, локализации и сверхэкспрессии белков, а также для разработки субклеточных маркеров.

Введение

Трансгены широко используются в C. elegans для широкого спектра применений. Трансгенные штаммы обычно образуются путем инъекции ДНК в синцитиальную гермафродитную гонаду1,2. ДНК, несущая представляющий интерес трансген, коинъецируют вместе с плазмидами, кодирующими маркеры коинъекции1,3,4. Коинъекционные маркеры представляют собой установленные трансгены, приводящие либо к экспрессии флуоресцентного белка, либо к определенному поведенческому или морфологическому фенотипу. Введенные ДНК перестраиваются, образуя многокопийные экстрахромосомные матрицы; Таким образом, представляющий интерес трансген и маркер коинъекции передаются вместе5,4. Трансгенные линии отбираются в поколении F2 инъекционных животных в соответствии с фенотипом, индуцированным экспрессией маркера коинъекции (флуоресценция или специфический фенотип)1. Трансгенные линии демонстрируют частичную и переменную скорость передачи внехромосомных матриц следующему поколению. В зависимости от штамма, 10-100% (100% — редкое явление) животных наследуют внехромосомные массивы. Кроме того, трансгенные животные являются мозаичными и экспрессируют трансген в различном числе клеток. Этот мозаицизм, вероятно, коррелирует со скоростью передачи следующему поколению. Действительно, как в зародышевой линии, так и в соматических клетках скорость передачи зависит от сегрегации внехромосомных массивов во время деления клеток. Одним из способов избежать этой проблемы является интеграция трансгена в геном. Классически интеграция трансгена в хромосому опирается на облучение (ультрафиолетовое или гамма-излучение) трансгенных червей, несущих внехромосомныемассивы. Вкратце, 50-100 животных-гермафродитов облучаются на личиночной стадии L4. В поколении F1 отбирают 200-800 трансгенных животных и индивидуально культивируют их на планшетах. Согласно менделевской сегрегации, трансгенные животные F1, несущие гетерозиготную интеграцию трансгена в геном, произведут 1/2 трансгенных потомков, которые являются гетерозиготными для интегрированного массива, 1/4 трансгенных потомков будут гомозиготными для интегрированного массива, и 1/4 потомков, которые не интегрировали массив (рис.). Таким образом, планшеты, содержащие поколение F2, визуально проверяются на наличие ≥75% трансгенных животных, что наблюдается по экспрессии маркера коинъекции. Предполагается, что около 1/3 животных F2, отобранных в качестве кандидатов на интеграцию, являются гомозиготными для интегрированного массива и производят 100% гомозиготных животных F3. Следовательно, из каждой отобранной пластины индивидуально культивируют от трех до восьми трансгенных животных F2 и отбирают пластины со 100% трансгенных потомков. Затем восемь животных F3 индивидуально культивируют, чтобы подтвердить 100% наследование трансгена.

Основные недостатки этого метода заключаются в том, что

  1. для этого требуется визуальный скрининг нескольких сотен пластин F1 на ≥75% трансгенного потомства F2, что занимает много времени из-за изменчивого и непредсказуемого процента передачи неинтегрированных экстрахромосомных массивов. В качестве альтернативы, чтобы избежать скрининга планшетов F1, после облучения животных с P0 можно выполнить несколько последующих этапов голодания; с последующим отбором 100 трансгенных животных и скринингом на 100% трансгенное потомство3.
  2. Он не адаптирован для штаммов, демонстрирующих процент передачи экстрахромосомной матрицы выше 60%, поскольку этот процент трудно отличить от 75%.
  3. Поскольку можно использовать только штаммы с относительно низкой скоростью передачи, необходимо большое количество облученных трансгенных животных P0, а также наблюдение за многочисленными животными F1 и F2, что занимает много времени и требует значительного количества планшетов.

Облучение червей, по-видимому, вызывает двухцепочечные разрывы в ДНК, и интеграция внехромосомных массивов в хромосомы происходит во время репарации ДНК. Таким образом, вполне вероятно, что шансы на получение успешной интеграции, опосредованной облучением, прямо пропорциональны количеству клеток зародышевой линии, несущих внехромосомную решетку. Штаммы с высокой скоростью передачи могут содержать больше трансгенных массивов ДНК, чем штаммы с низкой скоростью передачи, как показано впункте 2, и демонстрируют большее количество клеток зародышевой линии, несущих внехромосомные массивы. Таким образом, мы пришли к выводу, что в линиях с высокой передачей трансгены может быть легче интегрировать, чем в линиях с низкой скоростью передачи. Тем не менее, стандартный протокол исключает возможность интеграции трансгенов с высокой частотой передачи, так как процент трансгенных животных с неинтегрированным экстрахромосомным массивом трудно отличить от процента потомства животного F1, несущего гетерозиготную интеграцию трансгена в геном (рис. 1).

Здесь мы показываем, что для конкретного трансгена количество интегральных линий, восстановленных после облучения ультрафиолетовым (УФ) светом, зависит от начального процента пропускания неинтегрированного массива. Мы представляем усовершенствованный протокол интеграции трансгенов, опосредованных ультрафиолетовым излучением, который особенно актуален для линий, демонстрирующих высокую скорость передачи трансгенных матриц.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культивирование трансгенных нематод до интеграции

Трансгенные линии могут быть сгенерированы, как описано впункте 1. Эти линии обычно содержат коинъекционную маркерную плазмиду, приводящую либо к экспрессии флуоресцентного белка, либо к специфическому поведенческому или морфологическому фенотипу на данной стадии развития1,3. Этот протокол интеграции может быть применен к штаммам, экспрессирующим флуоресцентные или нефлуоресцентные маркеры коинъекции. В следующем примере использовался штамм с флуоресцентным маркером коинъекции.

  1. Подготавливаем тарелки для культуры:
    1. Приготовьте около 500 больших чашек Петри диаметром 60 мм, залитых асептически 10 мл нематодной питательной среды (NGM)6,7.
    2. Засейте каждую пластину 0,3 мл насыщенной культуры Escherichia coli OP50 по стандартной методике6,7.
  2. Оцените скорость передачи трансгенной линии, которую необходимо интегрировать:
    1. Для каждой трансгенной линии выберите десять взрослых флуоресцентных гравид на десяти отдельных культуральных планшетах под флуоресцентным стереоскопом с помощью червячной палочки, как описано впункте 7.
    2. Выращивайте животных в инкубаторе для червей при температуре 15-25 °C (в зависимости от генетического фона), чтобы дать червям возможность размножения.
    3. Наблюдайте за потомством каждый день, чтобы оценить, на какой стадии развития маркер коинъекции экспрессируется и может наблюдаться лучше всего. Экспрессия большинства используемых в настоящее время маркеров коинъекции наблюдается на личиночной стадии L4 или во взрослом возрасте.
    4. Оцените скорость передачи потомства, определив процент флуоресцентного потомства путем наблюдения под флуоресцентным стереоскопом.
  3. Выберите трансгенную линию для трансгенной интеграции:
    1. Выберите трансгенную линию с максимально возможной скоростью передачи (в идеале ≥80%).
  4. Получить популяцию трансгенных животных, синхронизированных на личиночной стадии L4 для интеграции:
    1. Выберите 30 взрослых флуоресцентных гравиров на пяти культуральных планшетах (по шесть животных на тарелку).
    2. Дайте червям отложить яйца в течение 3-4 часов при температуре 15 °C.
    3. Удаляют взрослых особей из тарелок после проверки на наличие не менее 30 яиц по тарелкам.
    4. Выращивайте животных в червячном инкубаторе при температуре 15-25 °C до тех пор, пока потомство не достигнет личиночной стадии L4 (96 ч при 15 °C или 36 ч при 25 °C).

2. УФ-облучение и восстановление трансгенных червей

  1. Облучение червями:
    1. Соберите 30-100 флуоресцентных трансгенных животных L4 на отдельные культуральные планшеты (по 15-20 животных на планшет).
    2. Поместите пластины со снятыми крышками в УФ-сшиватель. Облучайте червей со скоростью 0,012 Дж/см2. Обратите внимание, что штаммы более или менее чувствительны к ультрафиолетовому излучению, и что результаты могут варьироваться в зависимости от используемого УФ-облучателя. Можно протестировать диапазон доз от 0,010 до 0,015 Дж/см2.
  2. Восстановление глистов после облучения:
    1. Поместите пластины с облученными червячками на ночь при температуре 15 °C для восстановления.
    2. Проверьте количество животных, которые остались в живых. В наших руках выживаемость составляет около 80-90% для эффективного облучения.
    3. Облученные животные выращивают при температуре 15-25 °C до тех пор, пока потомство не достигнет стадии развития, позволяющей наблюдать за экспрессией маркера коинъекции, как установлено на шаге 1.2.

3. Выделение интегрированных трансгенных линий

  1. Выбор животных F1:
    1. Одиночные 150-200 флуоресцентных животных F1 на отдельных культуральных планшетах. Для высокопередающих линий (≥80%) достаточно 100 животных F1.
    2. Держите эти планшеты F1 при температуре 15-25 °C до тех пор, пока потомство не достигнет подходящей стадии для наблюдения за флуоресцентными животными F2.
    3. Отбросьте все пластины F1, на которых либо i) отсутствует потомство, указывающее на то, что животное F1 было стерильным или умерло, либо ii) отсутствуют или только несколько флуоресцентных животных F2, указывающие на то, что животное F1 не передавало трансген с ожидаемой скоростью. Этот шаг является быстрым и представляет собой реальное преимущество по сравнению со стандартным протоколом, который требует оценки процента флуоресцентных червей F2 для выбора планшетов F1 с ≥75% флуоресцентного потомства (Таблица 1).
  2. Выбор животных F2:
    1. По одному четырем флуоресцентным трансгенным животным F2 из каждой выбранной пластины F1. При использовании флуоресцентных трансгенов (например, mCherry8, gfp9 или dsRed10) выбирайте червей F2 с высоким уровнем флуоресценции, так как это может указывать на то, что эти животные гомозиготны для интегрированного массива. Обратите внимание, что при отборе животных F2 крайне важно не носить с собой яйца или личинки, чтобы избежать ложноотрицательных результатов на следующем этапе.
    2. Выращивайте животных F2 при температуре 15-25 °C.
  3. Выделение и валидация интегрированных трансгенных штаммов:
    1. Экранируйте планшеты F2 на наличие 100% флуоресцентных трансгенных червей F3. Экран работает довольно быстро, так как наличие одного нефлуоресцентного червя указывает на то, что пластину следует выбросить. Животное F2, гомозиготное по интегрированному трансгену, даст 100% гомозиготное флуоресцентное потомство.
    2. Выделение восьми флуоресцентных животных F3 из выбранных планшетов для подтверждения 100% наследования трансгена. По идее, на этом этапе достаточно выбрать одно животное. Тем не менее, выбор восьми флуоресцентных животных F3 может быть необходим, чтобы избежать отбора бесплодных или нездоровых животных, поскольку облучение может случайным образом вызвать мутации, влияющие на гены, важные для физиологии червей.
    3. По возможности сохраняйте несколько независимых интегрированных трансгенных штаммов, т.е. штаммов, полученных от разных животных F1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Интеграция трансгенов в двух различных линиях, передающих внехромосомные массивы с примерно одинаковой частотой (50-60%), проводилась с использованием стандартного и улучшенного протоколов (Таблица 1). Стандартный протокол позволил получить три независимые интегрированные линии после УФ-облучения 91 трансгенного животного на стадии L4, в то время как улучшенный протокол позволил получить одну интегрированную линию после УФ-облучения 30 трансгенных животных на стадии L4. Это позволяет предположить, что эф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный здесь протокол обеспечивает эффективный метод интеграции внехромосомных трансгенных массивов в геном C. elegans. Используя различные неинтегрированные линии, которые передавали один и тот же трансген Pdyc-1::d yc-1::gfp (pKG45) с разной скоростью (10-15%, 50-60% и >80%), мы показали, что количество интегральных штаммов, восстановленных после УФ-облучения, зависит от исходного уровня пропускания неинтегрированной линии (табл. 2). Таким образом, трансгены легче интегрируются в л...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность Клэр Лекруази и Лорану Сегала за создание неинтегрированного Pdyc-1::d yc-1::gfp; Трансгенные штаммы Pmyo-2::d sRed и Pmyo-3::gfp. Мы благодарим Энди Файра за подаренную плазмиду Pmyo-2::d sRed и Памелу Хоппе за подаренную плазмиду Pmyo-3::gfp. Эта работа была основана Французским национальным центром научных исследований (CNRS) и Лионским университетом имени Клода Бернара.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AgarProlabo20768.292для препарата NGM (среда роста нематоды) (6,7)
NaClChimie-Plus40045для препарата NGM
Bacto-peptoneBD211820для препарата NGM
KH2PO4Roth3904-1для препарата NGM
K2HPO4Prolabo26930.293для препарата NGM
MgSO4RothP027.2для препарата NGM
CaCl2Prolabo22317.297для препарата NGM
ХолестеринRectapurдля препарата
LB-бульонSigmaL3022для культуры OP50 бактериологическое
оборудование
сшивающее устройствоFischer ScientificДлина волны 254 нм
Микроскоп SteREO Discovery V8Carl Zeiss, Inc.
Чашки Петри, 60 ммCMLBPS55E6
Платиниевая проволока 0,25 ммAlfa Aesar7440-06-4Сделать кирку для червей (7)

Ссылки

  1. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833(2008).
  2. Mello, C., Kramer, J. M., Stinchlomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  3. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  4. Hobert, O. PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans. BioTechniques. 32, 728-730 (2002).
  5. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  7. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).
  8. Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. A modular vector kit for transgenesis in C. elegans. International Worm Meeting. , (2007).
  9. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Green Prasher, D. Fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  10. Fleenor, J., Fire, A. Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (dsRED) as a reporter in C. elegans. Worm Breeder's Gazette. 16 (3), 16(2000).
  11. Lecroisey, C., et al. ZYX-1, the unique zyxin protein of Caenorhabditis elegans, is involved in dystrophin-dependent muscle degeneration. Mol. Biol. Cell. , (2013).
  12. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  13. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  14. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

F1F2

Похожие статьи