Мы демонстрируем простой мультиплексный ПЦР-анализ для быстрого скрининга и типирования типов I-V стафилококковой кассетной хромосомы mec для метициллин-резистентного золотистого стафилококка, а также предоставляем некоторые важные шаги и процедурные нюансы, которые делают его успешным для адаптации этого анализа к отдельным лабораториям.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
??????????? ??? ??? ??????????? ??????????????? ??????? ????????? ??? ????? I ?? V ? ??????????-??????????
В этой статье
Уведомление об исправлении
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Краткое содержание
Аннотация
??????????????? ??????? ????????? MEC (SCC MEC) ????????? ???????? ????? ?????? ???????????? ???????????? ??? ????????? ??????? ????????????? ? ??????????? ????? ??????????-?????????? ?????????? ??????????? (MRSA), ? ?????????, ? ?????? ????????? ????????????? MRSA (CA-MRSA), ???????????? ?? ????? ????. ???????????? ?????? ??? ????? ????????????? SCC ??? ????? ?????? ? ????????????? ?????????? ??? ? CCR ??? ??????? ?????, ?? ??????? ????????????? ????? ??????? ????????? ? ?????????? ????????? ????????????? ???. ?? ??????????? ? ???????????? ??????? ??????????? ???-??????? ??? ???????? ?????? ??????? SCC MEC ????? ? ???????? ? ? V, ? ????? ??????? ??? ??? ????? ?????????????? ?????????????????? ????? ?????????. ???? ??????? ?????? ????? ????????? SCC MEC ????? ? ????? ???????, ????? ???????????????? ? ?????? ??????????? ?? ???? ????. ?????? ??-?? ??????? ????? ?? ??????? ? ???????? ????? ?????????, ?????????????? ? ??????????? ?????????? ??????????? ????????? ??? ????????? ???? ??????? ????????? ???????????. ??? ?????????? ???????? ???????? MRSA SCC MEC ???????, ????? ?? ???????, ??? ??????? ??? ??????????? ???-???????, ? ????? ???????? ????????? ???????? ?????? ???? ? ??????????? ??????, ??????? ?????? ??? ????????.
Введение
??????????-?????????? ?????????? ??????????? (MRSA) ????????? ? ??????????????? ? ????? 21-67-?? ????????? ???????????? ?????????, ?????????? ??????????????? ??????? ????????? MEC (SCC MEC), ??????? ???? ? ???? ???????????? ? ??????????? (M
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
??? ????????? ?????? ??????????? ? ?????? ??????????????? 2 ????????????????? ????????????. ??????????????? ???????? ?????????????? ??????, ????? ??? ???????? ? ?????? ?????? ???? ???????????? ? ????? ?????.
1. ?????????? ????????
- ?????? ?????? ???????? ??????? MRSA ?????????. ? ???? ????? ??? ?????? ???? ???????, ???????? ???? ??????? MRSA ?????????? ???????? ???????? ? ??????????? ??????? ?????? ???????? ?? ???????????? ?????? ???? (TSA) ????????. ????????? ???????? ????? ??????? ?? ????? ????????. ?????????? ? ??????? ???? ??? 37
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Данный обновленный метод M-PCR позволяет определять (классифицировать) типы SCCmec I-V, а также основные подтипы SCCmec IV. Анализ направлен на уникальные и специфические локусы SCCmec I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE и V с одновременным выявлением гена mecA. Также возможна предварительная идентификация SCCmec VI и VIII, однако для подтверждения потребуется дополнительное тестирование. На рисунке 3 представлены репрезентативные SCCmec I-VI и VIII, ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описанный здесь мультиплексный ПЦР-анализ обеспечивает простой и надежный метод классификации типов и основных подтиповSCC mec I-V у стафилококков с одновременным отличием MRSA от MSSA. Анализ надежен, его удобно проводить в рамках одной ПЦР-реакции, а результаты легко интерпретировать. Анализ имеет ограничения в том, что он нацелен на отдельные локусы в каждом типеSCC mec , но не предлагает комплексного типирования ccr и mec, и поэтому не может считаться золотым стандартом. Несмотря н...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликт интересов не декларируется.
Благодарности
Мы благодарим Т. Ито, К. Хирамацу, Р. Даума, Х. де Ленкастра и Д. Коулмана за любезный подарок в виде некоторых эталонных сортов, использованных в этом исследовании. Эта работа была частично поддержана Центром устойчивости к противомикробным препаратам (CAR), Службой здравоохранения Альберты-Калгари/Лабораторной службой Калгари/Университетом Калгари.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Триптический соевый агар | Fisher (BD) | CA90002-700 (236920) | |
| Стерильная дистиллированная вода | Life Technologies | 10977-015 | |
| Platinum Taq: включая 10x ПЦР-буфер и 50 мМ MgCl2 | Life Technologies | 10966-034 | |
| 100 мМ dNTP | Life Technologies | 10297-018 | |
| Трис-основание | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Борная кислота | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| EDTA | Life Technologies | 15576-028 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Глицерин | Life Technologies | 15514-011 | |
| Бромофеноловый синий | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| 1Kb+ ДНК-лестница | Life Технологии | 10787-026 | |
| Бромид этидия | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| 1,5мл Микроцентрифуга пробирки | VWR (Axygen Scientific) | 10011-700 | |
| Культуральные палочки | VWR | CA10805-018 | |
| ПЦР пробирки | Diamed | AD0210-FCN (новинка #: DIATEC420-1250) | |
| Центрифуга | Eppendorf | 5417c | |
| VWR | 13259-030 / 13259-286 | Термоамплификатор | |
| Applied Biosystems (2720) | 4359659 | ||
| Горизонтальная, погружная гелевая камера электрофореза с гелевой формой | BioRad | 170-4469 | |
| Источник питания | BioRad | 164-5050 | |
| Шейкер качалки | VWR | 40000-300 | |
| Molecular Имидж-сканер Gel Doc System | BioRad | 1708170 |
Ссылки
- IWG-SCC. Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).
- Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).
- Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community. Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).
- Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).
- Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).
- Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).
- Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).
- Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).
- Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).
- de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification. Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).
- McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII. Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).
- Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Исправление
Formal Correction: Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
Posted by JoVE Editors on 3/19/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. There was a typo in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG
