Method Article

Чувствительностью и специфичностью Количественный метод определения Сыворотка Сердечная Миозина связывающий белок-C по электрохемилюминесценцию иммуноферментного

DOI:

10.3791/50786

⸱

August 8th, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, Loyola University Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Измерения биомаркеров в сложных биологических образцов все больше руководящих принятия клинических решений. Мы описываем высокочувствительным методом для одновременного измерения сердечного миозин-связывающего белка С, креатин киназы MB и сердечного тропонина I в образцах сыворотки пациентов с инфарктом миокарда и группой контроля.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биомаркеров становится все более важным в принятии клинических решений, а также фундаментальной науки. Диагностика инфаркта миокарда (ИМ) во многом основывается на выявлении сердечно-специфических белков в пациентов сыворотки или плазмы в качестве индикатора повреждения миокарда. Недавно показано, что сердечный миозин-связывающего белка-С (cMyBP-C) можно обнаружить в сыворотке крови после ИМ, мы предложили его в качестве потенциальных биомаркеров ИМ. Биологические маркеры обычно обнаруживаются традиционными сэндвич иммуноферментного анализа. Однако этот метод требует большого объема пробы, имеет небольшой динамический диапазон, и может измерять только один белок одновременно.

Здесь мы показываем, мультиплексе иммунотестом, в котором три сердечных белки могут быть измерены одновременно с высокой чувствительностью. Измерение cMyBP-C в Uniplex или вместе с креатина киназы MB и сердечного тропонина я показал чувствительность сопоставима. Эта техника использует мезо Масштаб Discovery(MSD) способ мультиплексирования в 96-луночный планшет в сочетании с электрохемилюминесценция для обнаружения. В то время как лишь небольшие объемы образцов требуются высокая чувствительность и широкий динамический диапазон будут достигнуты. Используя эту технику, мы измерили cMyBP-C, креатин киназы MB и сердечного тропонина I в сыворотке крови образцы из 16 пациентов с ИМ и сравнили результаты с 16 субъектами управления. Мы смогли обнаружить все три маркера в этих образцах и нашел всех трех биомаркеров быть увеличена после ИМ. Этот способ, следовательно, подходит для чувствительного обнаружения сердечных биомаркеров в образцах сыворотки.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Измерение небольших количеств белка в сложных биологических образцов, таких как сыворотка, приобретает все большее клиническое значение для лечения пациента, а также основные науки. Например, увеличение сывороточных уровней сердечных биомаркеров, таких как тропонин I, в клинических условиях согласуется с острым инфарктом миокарда (ИМ) 1. Для обнаружения белков в образцах сыворотки, стандартный твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) является наиболее часто используемым способом, как это имеет высокую чувствительность и позволяет абсолютного количественного определения анализируемого вещества. Однако традиционные ELISA, требуют относительно большого количества образца (как правило, 100 мкл), имеют высокую фонового сигнала в некоторых биологических жидкостей, а ограничиваются измерением только одного аналита в ELISA-2.

В последнее время новый метод иммуноанализа была введена в обход многие из этих недостатков. Этот модифицированный анализа, разработанного MSD, использует electrochemiluminescENCE (ECL) для обнаружения сигнала, которая позволяет очень низкий фон и повышенная чувствительность, что позволяет использовать небольшие объемы образца. Электрохемилюминесценция основан на молекуле-репортеру рутений (II) trisbipyridal, которая крепится на обнаружение антител. Это репортерной молекулой излучает свет при 620 нм на электрической стимуляцией в нижней части 96-луночный планшет который имеет углеродные электроды интегрированы в них 3. Кроме того, при использовании точечного покрытия, несколько антител захвата могут быть покрыты в одну лунку (до 10 на 96-луночном планшете), что обеспечивает одновременное определение количества различных белков в одном образце 4. Этот метод был недавно использован для измерения профилей провоспалительных цитокинов в сыворотке 5,6. Мультиплекс плиты из MSD выгодно отличаются от других платформ множественного аналитического 7.

Использование MSD в качестве основной платформы анализа, мы также разработали на заказ 3-комплекса, что с пластинойодновременного количественного определения уровня сердечного миозин-связывающего белка-C (cMyBP-C), креатин-киназы MB (CK-MB), и сердечный тропонин I (cTnI), и результаты сравнивали с monoplex обнаружения cMyBP-C. CK-MB и cTnI хорошо отлаженных биомаркеров для ИМ. Однако увеличение этих маркеров может быть вызвано патологий, кроме М.И., например, миокардит или почечной недостаточностью 8. Это свидетельствует о добавлении дополнительных биомаркеров для увеличения специфичности диагностики инфаркта миокарда. Недавно мы показали, что cMyBP-C также является потенциальным биомаркеров для MI 9. cMyBP-C представляет собой толстую нить ассоциированный белок, который экспрессируется в сердце, 10-12, но не в скелетной или гладкой мускулатуры. Таким образом, повышение уровня cMyBP-C в системе кровообращения является специфическим показателем повреждения сердца 13.

В этом исследовании сравнивали Uniplex обнаружения cMyBP-C с использованием пользовательского 3-комплекса анализе на определение сывороточных уровнейcMyBP-C, CK-MB, и cTnI в сыворотке крови больных с ОИМ. В будущем эта подпись техники может быть использован для диагностики инфаркта миокарда у пациентов с болями в груди в отделении неотложной помощи.

Учреждение обзор платы (IRB) из Университета Лойолы Чикаго одобрил исследования для использования deidentified человека образцы и использование иммуноферментного анализа (LU # 20392).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Uniplex cMyBP-C анализа

  1. За день до эксперимента, пальто 96-луночных стандартных MSD голой пластины с захватом антител. Для cMyBP-C, используя 30 мкл мышиных моноклональных анти-cMyBP-C антитела (желатина) в концентрации 5 мкг / мл разведенного в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS).
  2. Поскольку хорошо является гидрофобным, пипетки раствор в нижнем углу скважины; нажмите сторон пластины для распространения раствору в течение всей скважины.
  3. Планшет накрывают пластиной герметика и инкубировали O / N при 4 ° С без встряхивания.
  4. Снимите решение захвата антител, нажав на решение над раковиной, а затем на стопку бумажных полотенцах. Неспецифическое связывание к пластине блокировали добавлением 150 мкл 5% (вес / объем) блокатор (высокого класса BSA) раствора в PBS в каждую лунку.
  5. Закройте пластины и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре при встряхивании при 700 оборотах в минуту.
  6. Во время стадии блокирования подготовки стандартов и ейпримерам. Сделать стандартной серии разбавлением рекомбинантный cMyBP-C фрагмент белка (аминокислоты 1 - 271) до начальной концентрации 2000 нг / мл в 1% (вес / объем) блокатор / PBS. Затем последовательно разбавленной с коэффициентом 5 в 1% (вес / объем) блокатор / PBS. Всего 7 стандартами + 1 пустой (1% (масса / объем) блокатор / ЗФР), были использованы.
  7. Удалить блокирующий раствор и промыть пластины 3 раза по 150 мкл 0,05% (объем / объем) Tween-20/PBS. Каждый раз, удалите промывочного раствора опрокидыванием планшета над раковиной. После третьей стадии промывки, активно Флик планшет на раковине и погладить пластины энергично на слой бумажных полотенец, пока она полностью не высохнет. Это очень важный шаг, так как инкубационный объемы небольшие, и любые оставшиеся промывочного раствора значительно разбавить следующий инкубации.
  8. Внесите 25 мкл стандартов и образцов в лунки. Закройте пластины и инкубировать при комнатной температуре, при встряхивании при 700 оборотах в минуту в течение 1 часа.
  9. Подготовьте раствор обнаружение антител в концентрации 1 мкг / мл в 1%-блокатор / PBS. Cuльзовательская сделаны cMyBP-C антитела (эпитоп аминокислот 2 - 14) с MSD сульфо-TAG маркировки служит в качестве детектирующего антитела. Наборы доступны для сульфо-TAG маркировки, что делает его относительно простая процедура для обозначения любых антител.
  10. Повторите стадии промывки, как описано в пункте 1.4.
  11. Добавить 25 мкл детектирующего антитела раствора в каждую лунку, печать пластины, и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа в планшетном шейкере установлен на 700 оборотов в минуту.
  12. Во время инкубационного периода, запустите демо-MSD-пластины (пластина со светодиодами), чтобы обеспечить правильное функционирование Imager сектора и программного обеспечения (см. раздел реагента). Кроме того, разбавить чтения буфера, который обеспечивается MSD, путем добавления 5 мл 4x чтения буфера в 15 мл дистиллированной воды.
  13. Повторите стадии промывки, как описано в пункте 1.4.
  14. Добавить 150 мкл чтения буфера в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Будьте уверены, чтобы избежать воздушных пузырей (обратный пипетирование подходящий метод). После добавления чтения буфера, сразу сканирование пластины в сектореImager.

2. 3 комплексные cMyBP-C, CK-MB, и cTnI анализа

  1. 96-луночные 3-комплекса пластины и разбавитель решения уравновешивали до комнатной температуры перед использованием. Этот планшет предварительно покрытый с захватом антител для cMyBP-С, СК-МВ и cTnI на MSD.
  2. Добавить 25 мкл 1% (вес / объем) блокатор / PBS в каждую лунку. Нажмите на сторонах пластины, чтобы убедиться, что весь хорошо покрыта раствора.
  3. Печать пластины с заклеивания планшетов, поместите пластину на шейкере, и встряхните при 700 оборотах в минуту в течение 30 мин.
  4. В то же время серии разведений отдельных калибраторов готова. Поскольку каждую лунку имеет три антитела захвата трех калибраторов должны быть смешаны и серийно разводили перед использованием. Развести рекомбинантный cMyBP-С, СК-МВ (MSD) и cTnI (MSD), а также в 1% (вес / объем) блокатор / PBS, чтобы создать один образец с 2000 нг / мл cMyBP-C, 100 нг / мл CK- MB и 25 нг / мл cTnI (образец А).
  5. Конечный объем по меньшей мере 100 мкл подготовлена ​​для каждого стандарта. Длязавершить стандартной серии, серийно разбавленных образцов с коэффициентом 5. Использование 25 мкл образца в 100 мкл 1% (вес / объем) блокатор / PBS создать образец B. Затем с помощью 25 мкл образца B в 100 мкл 1% (вес / объем) блокатор / PBS создать образец C и так далее. Пробах сыворотки крови человека от 16 пациентов с ИМ и 16 субъектов управления были использованы для измерения cMyBP-C, CK-MB, и cTnI уровнях. Эти образцы разбавляли 2x в 1% (вес / объем) блокатор / PBS.
  6. Добавить 25 мкл стандартов и разбавленных проб в 25 мкл уже присутствует в лунки 3-комплекса пластины. Важно также включать заготовки (только разбавитель). Чтобы установить технику, образцы загружаются в технических трижды. В противном случае, дубликаты являются достаточными.
  7. Печать пластины снова (для заклеивания планшетов могут быть повторно использованы) и инкубировать на шейкере (700 оборотов в минуту) при комнатной температуре в течение 2 часов.
  8. Непосредственно перед инкубацией закончена, раствор обнаружение антител подготовлены. Разбавителя, используемого на 1% (вес / объем) блокатор в PBS. Все Чете сульфо-меченого антитела обнаружения разводят вместе в конечной концентрации 1 мкг / мл каждый. Обнаружение антител, как правило, предоставляется на 50x концентрации акций.
  9. Для полного 96-луночном планшете, 2700 мкл общего разбавленного раствора необходимо (с пипеткой ошибки включены). Добавить 54 мкл каждого обнаружение антител к 2538 мкл 1% (вес / объем) блокатор / PBS.
  10. Через 2 часа, удалите Решения по энергично стряхивая пластины выше раковины. Промыть 3 раза скважин с 150 мкл 0,05% Tween-20 в PBS. Добавить 25 мкл обнаружение решение антител в каждую лунку помощью многоканальной пипетки и сторонах пластины использован для того, чтобы весь хорошо покрыта раствора.
  11. Закройте пластины и инкубировать в течение 1 часа при встряхивании при 700 оборотах в минуту.
  12. Во время инкубационного периода, запустите демо-MSD-пластины (пластина со светодиодами), чтобы обеспечить правильное функционирование Imager сектора и программного обеспечения. Также разбавить чтения буфера, который обеспечивается MSD, путем добавления 5 мл 4x чтениябуфер на 15 мл дистиллированной воды.
  13. Повторите мыть шаг описан в шаге 2.8.
  14. Добавить 150 мкл чтения буфера в каждую лунку помощью многоканальной пипетки. Избегайте появления пузырьков является критическим (обратный пипетирование подходящий метод). После добавления чтения буфера, сразу сканирование пластины в секторе Imager.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основные принципы и процесс 3-комплекса анализа показаны на рисунке 1, а общий процесс описан в таблице 1. Uniplex анализов работать по тому же принципу, за исключением того, что все дно скважины покрыты одним иммобилизованным антителом. Обнаружение сигнала осуществляется ECL, в котором электрический сигнал подается на дне колодца. Это, в свою очередь, инициирует локальный производства легких посредством химической реакции для чтения буфер с сульфо-TAG этикетки на обнаружение антител. Э...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы покажем применимость мультиплекса иммуноанализа для обнаружения нескольких сердечных биомаркеров в сыворотке крови у пациентов. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными ELISA. Во-первых, в ECL набора для анализа используют вместо колориметрического обнаружения. В ECL, электрический сигнал стимулирует местное производство измеряемого свойства (свет), таким образом, разобщение стимуляции событие из сигнала, который уменьшает фоновый 14. Это позволяет обеспечить высоку...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полная патентная заявка находится на рассмотрении (заявка № 13/464, 466, Паб США № 2012/0282618 A1 и дата:. 05/04/12), чтобы определить факторы риска, связанные с cMyBP-C разложению и выделению жидкости в человеческие тела и количественного определения уровня cMyBP-C в человеческом теле жидкости.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось Национальным институтом здоровья и гранты R01HL105826 K02HL114749 (Dr. Sadayappan) и Американской Ассоциации Сердца Запада стипендий; 11PRE7240022 (г-н Barefield) и 13POST14720024 (Dr. Говиндана). Авторы выражают признательность за помощь доктор Джимми Пейдж, Джилл Clampit и д-р Джон Хадсон, MSD, за их отличную техническую поддержку и литературы в развитии анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) с поверхностно-активным веществомMeso Scale DiscoveryR92TC-2 
Твин-20Acros9005-64-5 
Блокиратор MSDМезомасштаб DiscoveryR93BA-1 
Фосфатно-солевой буфер, 10XFisher BioReagentsBP399-4Фильтр перед использованием
антитела к миозинсвязывающему белку C, мышиный моноклональный (E7), не содержащий желатинаSanta CruzSC-137180LДля покрытия антитела должны быть без
Plates and Equipment
Multi-Array 96-луночный стандартный планшетMeso Scale DiscoveryL15XA-3 
Прототип 3-плексного, четырехточечного, 96-луночного планшета с cMyBP-C, cTnI и CK-MBMeso Scale DiscoveryN452A-1 
Уплотнительная пленка ThermaSealLife Science Products Inc.СТ-3098 
MSD SECTOR Imager 2400AМезомасштаб Discovery 
Шейкер для микротитров МТС 2/4 IKA3208001 
желатина

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thygesen, K., et al. Third universal definition of myocardial infarction. Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).
  2. Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).
  3. Thompson, I., et al. Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains. Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).
  4. Kingsmore, S. F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).
  5. Altan, Z. M., et al. A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).
  6. Patel, K. D., et al. High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction. Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).
  7. Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. Comparison of multiplex immunoassay platforms. Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).
  8. Mahajan, V. S., Jarolim, P. How to interpret elevated cardiac troponin levels. Circulation. 124, 2350-2354 (2011).
  9. Govindan, S., et al. Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).
  10. Barefield, D., Sadayappan, S. Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease. J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).
  11. Kuster, D. W., et al. Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).
  12. Sadayappan, S., de Tombe, P. P. Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function. Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).
  13. Sadayappan, S. Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury. Biomark Med. 6, 69-72 (2012).
  14. Fichorova, R. N., et al. Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study. Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).
  15. Malekzadeh, A., et al. Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases. Methods. 56, 508-513 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiac Myosin Binding Protein CElectrochemiluminescence ImmunoassayMultiplex ImmunoassaySerum Biomarker DetectionMeso Scale Discovery96 Well PlateCalibrator Standard CurveDetection Antibody LabelingReid Buffer AdditionCross Reactivity Analysis

Related Articles