Методическая статья

Конфокальной микроскопии одиноких митохондриальных супероксид вспышек в интактных Сердце или В Vivo

DOI:

10.3791/50818

⸱

5 ноября 2013 г.

 , 
1Mitochondria and Metabolism Center, Department of Anesthesiology and Pain Medicine, University of Washington

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфокальной сканирующей микроскопии применяется для работы с изображениями одиночных митохондриальные события в перфузии сердца или скелетных мышц в живого животного. Мониторинг в реальном времени отдельных митохондриальных процессов, таких как супероксид вспышек и мембранных возможных колебаний позволяет оценку функции митохондрий в физиологически соответствующем контексте и при патологических возмущений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрия является одним из важнейших внутриклеточных органелл отвечает за производство энергии и внутриклеточной сигнализации в эукариотических системах. Митохондриальная дисфункция часто сопровождает и способствует болезни человека. Большинство из подходов, которые были разработаны для оценки функции митохондрий и дисфункции основаны на в пробирке или бывших естественных условиях измерений. Результаты этих экспериментов имеют ограниченные возможности в определении функции митохондрий в естественных условиях. Здесь мы описываем новый подход, который использует конфокальной сканирующей микроскопии для визуализации здоровых тканей в живых Aminals, что позволяет оценить одной функции митохондрий в режиме реального времени образом в естественных условиях. Во-первых, мы создаем трансгенных мышей, экспрессирующих митохондриальную целевой показатель супероксид, циркулярно переставленную желтый флуоресцентный белок (т-cpYFP). Наркозом т-cpYFP мыши фиксируется на заказ адаптера стадии и покадровой изображения взяты ером открытые скелетные мышцы задних конечностей. Мышь впоследствии пожертвовал и сердце настроен на Лангендорфа перфузии с физиологическими решений при 37 ° С Перфузии сердца позиционируется в специальной камере на конфокальной столик микроскопа и нежный давление применяется для иммобилизации сердце и подавлять сердцебиение индуцированной артефакт движения. Супероксидного вспышки обнаруживаются в реальном времени 2D конфокальной микроскопии на частоте одного кадра в секунду. Решение перфузии можно модифицировать, чтобы содержать различные субстраты дыхания или других флуоресцентных индикаторов. Перфузии также может быть скорректирована, чтобы произвести модели заболеваний, таких как ишемии и реперфузии. Эта техника является уникальный подход для определения функции одной митохондрии в здоровых тканей и в естественных условиях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии играют центральную роль в клеточных биоэнергетики, бесплатный сигнализации радикал, окислительно-восстановительного гомеостаза, регулирование ионного и клеточных судеб определения 1,2. Митохондрии дисфункция часто сопровождает и лежит в основе патогенеза заболеваний 3-6. Особенно в системах мышц, таких как сердце и скелетных мышц, дыхание митохондрий обеспечивает большую часть АТФ, чтобы поддержать своевременное регулирование внутриклеточного кальция и надежный 7,8 развития силы. Эти мышцы обладают большое количество митохондрий, которые часто занимают до 20-40% от общего объема клеток и "фиксированных" между миофиламентов 2.

Несмотря на многочисленные исследования, наше понимание регуляции митохондриальной функции, в частности, в естественных условиях и под физиологически соответствующих условиях, ограничен. Одной из причин является то, что большинство методов, разработанных для оценки функции митохондрий положиться в ВИТРо или Экс Vivo подходы, такие как мониторинг потребления кислорода изолированными митохондриями с добавлением искусственных субстратах, а также косвенное определение митохондриальной функции через морфологии (например, электронной микроскопии), активность фермента (например аконитаза деятельность), или внутриклеточные АТФ уровни 9-11 .

В последнее время низкомолекулярные люминесцентные индикаторы с относительной митохондриальной обогащения были применены, чтобы обеспечить представление о митохондриальных сигналов, в том числе мембранного потенциала, кальция и активных форм кислорода (АФК), в неповрежденных клеток 11-13. Кроме того, некоторые зеленый флуоресцентный белок (GFP) на основе окислительно-восстановительного потенциала и показатели ROS были разработаны для достижения более конкретную оценку на секции внутриклеточного редокс или ROS сигналов 14-16. Среди этого, мы разработали генетически закодированного индикатор супероксид, круговой переставляются желтый флуоресцентный белок, и targeteг он в митохондрии (мт-cpYFP) 17. м-cpYFP могут возбуждаться при 405 или 488 нм с обоих пиков выбросов на 515 нм. Излучение при возбуждении 488 нм именно реагировать на супероксид, на основании предыдущих в пробирке и в естественных калибровок 17,18. Излучение при возбуждении 405 нм используется в качестве внутреннего контроля (см. Рисунок 1 из Реф 17 для подробной информации о выбросах и возбуждения спектров MT-cpYFP в различных условиях). С конфокальной микроскопии покадровой, этот показатель обнаруживает разрыва производственных события супероксид, названные супероксид мигает, в отдельных митохондриях интактных клеток. Супероксид флэш служит сложной функции митохондрий дыхания, сопровождающего переходного митохондриальной деполяризации мембраны и продукции АФК 17-20. В последнее время мы сгенерировали пан-ткани т-cpYFP трансгенных мышей, используя вектор PUC-CAGGS-т-cpYFP 17,19 на C57/BL6 фоне и проверены сильные выраобсуждение этого показателя в сердце, скелетных мышцах и других тканях (рис. 2). Трансгенных мышей будут доступны для заинтересованных академических исследователей по запросу и утверждения MTA по Университете Вашингтона.

В этом исследовании мы описываем на месте изображений супероксидных вспышек в Лангендорфа перфузии сердца, а также в естественных изображений флэш событий в скелетных мышцах наркозом т-cpYFP трансгенных мышей 17,19. Эта технология позволяет осуществлять мониторинг в режиме реального времени отдельных митохондриальных производственных РОС событий в физиологически соответствующего условия или в естественных условиях 21,22. Возможно также использовать систему для мониторинга других одиночных митохондриальные такие параметры, как мембранного потенциала и кальция с соответствующими люминесцентных индикаторов. Кроме того, одновременно или параллельно оценка функции митохондрий с внутриклеточных событий (например, переходных кальция) или функции сердца (например,. Фракция выброса) может быть достигнута. Патологические возмущения, такие как ишемии и реперфузии, могут быть применены к перфузии сердца, чтобы оценить воздействие стресса на одной митохондриальной функции в интактном миокарде.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Эксперимент Подготовка

  1. Подготовьте изотонический сбалансированный солевой раствор (50 мл), содержащий: 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl 2, 2 мМ MgCl 2 и 10 мМ HEPES (рН 7,2) для скелетных мышц визуализации в естественных условиях.
  2. Подготовить 1 л Кребса-Хенселейта буфера (КАХАБ), содержащий: 118 мм NaCl, 5,3 мМ KCl, 1,2 мм MgSO 4, 0,5 мМ ЭДТА и 25 мМ NaHCO 3.
  3. Пузырь KHB с газом, содержащим 95% O 2/5% CO 2 в течение 10-15 мин перед добавлением 2 мМ CaCl 2. Добавить метаболические субстраты (например, 10 мМ глюкозы и 0,5 мМ пирувата).
  4. Подготовьте хирургических инструментов путем стерилизации зажимные, ножницы, и щипцы в 70% этаноле, а затем полоскать в стерилизованной DDH 2 O.
  5. Включите систему перфузии сердца, регулировать температуру на водяной бане и циркуляционным насосом, установить скорость перистальтического насоса до 6 мл / мин.
  6. Пузырь KHB с 95% O 2/ 5% СО 2 газ, и контролировать расход и температуру (37 ° С, по температурным датчиком волоконно-оптической) из сточных вод. Система должна около 20 минут для газа и уравновешивания температуры.

2. Конфокальной микроскопии скелетных мышц в естественных условиях

  1. Обезболить мышь с фенобарбиталом (80 мг / кг, внутрибрюшинно). Животное достигнет хирургической анестезии (не реагирует на носок щепотку) в течение 10-15 мин и остаются в этом состоянии в течение 1-1,5 ч, достаточного для того, в естественных изображений скелетных мышц.
  2. Удаление волос на одной из задних конечностей и стерилизации кожи с 70% этанола.
  3. Сделать надрез на коже вдоль внешней стороне конечности подвергать икроножных мышц.
  4. Поднимите epimysium осторожно острым пинцетом и сделать надрез через него с ножницами. Далее рассекают удалить epimysium и разоблачить мышечные волокна под ней.
  5. Для погрузки в естественных условиях TMRM в скелетныхмышц, включают TMRM (500 нм) в изотоническом сбалансированном солевом растворе погрузить мышцы в течение 30 мин, а затем промыть индикатором свободного раствора.
  6. Поместите курсор на боку на конфокальной микроскопии (Zeiss LSM 510) ступени и сдерживать заднюю конечность в положении, которое подвергается скелетных мышц обращена против покровного стекла, которое образует дно камеры. Покровное находится между мышечной ткани и перевернутом цели (40X масло).
  7. Нажмите ногу мягко, чтобы сделать плотный контакт между тканью и покровного стекла. Погрузитесь открытые мышцы в изотоническом сбалансированного солевого раствора.
  8. Запись двумерные (2D, ху) конфокальные изображения при частоте дискретизации в одну секунду на кадр. Интенсивность каждого пикселя в цифровую на глубине 8-битовой. Как правило, последовательный сканирования содержит 100 кадров.
  9. Сбор последовательных изображений от первого возбуждающего при 405 нм и сбора на> 505 нм, то при 488 нм, собирая на> 505 нм для двойного возбуждениями длин волнн визуализации MT-cpYFP. Используйте последовательный возбуждение в 405, 488 и 543 нм, и собирать излучение на 505-545, 505-545, и> 560 нм, соответственно, для тройной длин волн изображений возбуждения MT-cpYFP и TMRM.

3. Конфокальной микроскопии из перфузии мыши Сердце

  1. Сразу же после в естественных изображений скелетных мышц, вводят мыши с 200 единиц гепарина (IP). Десять минут спустя, усыпить мышь, торакотомии и быстро удалить сердце легких и тимуса, прикрепленных к нему.
  2. Быстро снять легкое в ледяной буфера. Определить доли тимуса и аккуратно отогните, чтобы разоблачить восходящей аорты.
  3. Снимите тимус и изолировать аорту, тщательно удаляя окружающие ткани.
  4. Сделайте надрез на верхнем конце восходящей аорты до первого филиала дуги аорты.
  5. Держите стенку аорты осторожно с двумя микро сшивания щипцов, чтобы разоблачить просвет и осторожно поместите аорты на окnnula (РЕ50 трубка). Аорта удерживается на месте с микро зажима судна в то время как швы быстро связали вокруг аорты.
  6. Снимите зажим, тщательно проверить канюли щипцами, чтобы убедиться, конец канюли выше корня аорты. Дополнительные связи добавляются по мере необходимости, чтобы держать сердце на месте.
  7. Включите перистальтического насоса и заливать сердце со скоростью 1 мл / мин. Сердце возобновит бить по перфузии.
  8. Отрегулируйте положение системы перфузии и положил сердце на столик микроскопа. Сцена имеет адаптер, который позволяет нагрев камеры, которая держит сердце.
  9. Добавить 1 мл КАХАБ перфузии раствора в камере, чтобы частично погрузить сердце. Монитор температуры камеры при 37 ° С Удалить эффлюента из камеры с помощью перистальтического насоса.
  10. Увеличение скорости перистальтического насоса постепенно, чтобы обеспечить достаточный поток (около 2 мл / мин) к сердцу.
  11. Через 10 мин стабилизации, заливать УВОRT с 10 мкМ blebbistatin и 100-500 нМ TMRM. Сердцебиение замедляется после 10 мин.
  12. Нежный давление на сердце, чтобы обеспечить плотный контакт сердца с покровным в нижней части камеры и дальнейшего подавления сердцебиение.
  13. Выполните ту же процедуру для конфокальной микроскопии интактного миокарда как описано в стадии 2,8 выше. Тщательно отрегулируйте фокальной плоскости выявить возможно более ясное изображение.

4. Обработка изображений и анализ данных

  1. Используйте инструменты, предоставляемые с помощью модуля "физиологический анализ" конфокальной программного обеспечения для анализа одиночных митохондриальные Вспышки и изменений мембранного потенциала. Этот модуль часто включается в изображении приобретения программного обеспечения конфокальной системы и позволяет определить некоторые области изображения, а также выход интенсивности флуоресценции с временных меток.
  2. Откройте базу данных, а затем серийный 2D файл изображения, которые необходимо проанализировать.
  3. Нажмите кнопку "РегионИнтересное (ROI) означает "для переключения в" среднем трансформирования "режиме. Нажмите кнопку" области интереса (ROI) в виду "для переключения в" среднем трансформирования режиме ".
  4. Выключите отображение других каналов, кроме канала cpYFP 488 нм для выбора вспышки.
  5. Увеличение изображения и вручную переместить ползунок играть серийные 2D-изображений.
  6. Определить одиночные митохондриальные супероксид вспышки за счет размещения на сайте, где используются люминесцентные сигнал увеличивается кратковременно. Используйте соответствующий инструмент ROI, чтобы отметить мигает. След показывая, зависящих от времени изменение флуоресценции каждого ROI будет отображаться рядом с изображением.
  7. После выбора всех мигает, включить отображение других каналов. Выберите ROI на изображение вне клетки для вычитания сигнала фона. Выход среднюю флуоресценцию каждого ROI вместе с временными метками.
  8. Запишите количество вспышек в каждой из файла образа серийный сканирования вместе со временем сканирования и областиклетка. Использование Excel для расчета частоты вспышки как количество вспышек в 100 сек / 1000 мкм 2 ячеек.
  9. Использовать пользовательский развитая программа, написанная на Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems), чтобы рассчитать параметры каждой вспышки (амплитуды, время пиковой и времени затухания). Программное обеспечение IDL является коммерчески доступным и специально разработаны программа для анализа параметров флэш могут быть получены у автора по запросу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В соответствии с этим протоколом, в естественных изображений отдельных митохондриальных событий может быть сделано в скелетных мышцах анестезированных мышей после чего на месте изображений в перфузии сердца (рис. 1). Оптимальная настройка условий обработки изображений обеспечит четкие изображения здоровых тканей мышц и с одной резолюции митохондрий (рис. 2). TMRM часто используется для проверки расположение MT-cpYFP и должны показать полную перекрытия модель с сигналом...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация одиночных митохондриальные события в живого животного или перфузированных органов имеет существенное преимущество по сравнению с традиционными методами митохондриальной 17,19,21,22,24,25 оценки функции. Техника, описанная здесь можно добиться реального времени в определении месте митохондриальной функции в реальной физиологического состояния на субклеточном резолюции. Это особенно полезно в сочетании с другими измерениями, чтобы системно изучить роль митохондрий в нормальной фун...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра. Хэпин Ченг, Huiliang Чжан и Стивен Kolwicz за их полезные комментарии и техническую поддержку в разработке этого метода. Работа выполнена при поддержке грантов НИЗ и ученый развития Грант от Американской ассоциации сердца к WW.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
REAGENTS
BlebbistatinToronto Research ChemicalsB592500
CaCl2Acros OrganicsAC34961-5000
EDTAFisher ScientificBP120-500
D-глюкозаSigma-AldrichG8270-1
HEPESSigma-AldrichH7006-500
KClSigma-AldrichP9541-1
MgCl2• 6H2OFisher ScientificBP214-500
MgSO4• 7H2OSigma-AldrichM1880-1
NaClFisher ScientificBP358-212
2PO4Sigma-AldrichS8282-500
NaHCO3Sigma-AldrichS6014-1
PyruvateSigma-AldrichP2256-25
TMRMInvitrogenT-668
EQUIPMENT
Конфокальный линейный сканирующий микроскоп (LSM 510 Meta, Zeiss), версия программного обеспечения 4.2 SP1, включая модуль "Физиологический анализ".

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).
  2. Scheffler, I. E. Mitochondria. , 2nd, J. Wiley and Sons, Inc. (2008).
  3. Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondria in heart failure. Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).
  4. Griffiths, E. J. Mitochondria and heart disease. Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).
  5. Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
  6. Pieczenik, S. R., Neustadt, J. Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease. Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).
  7. Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres. J. Physiol. 531, 393-403 (2001).
  8. Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).
  9. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).
  10. Lambert, A. J., Brand, M. D. Reactive oxygen species production by mitochondria. Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).
  11. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
  12. Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).
  13. Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species. Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).
  14. Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).
  15. Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).
  16. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).
  17. Wang, W., et al. Superoxide Flashes in Single Mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
  18. Wei-Lapierre, L., et al. Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity. J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).
  19. Fang, H., et al. Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals. Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).
  20. Wei, L., et al. Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease. FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).
  21. Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury. Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).
  22. Wei, L., Dirksen, R. T. Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies. J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).
  23. Johnson, I., Spence, M. T. Z. Ch. 12.2. The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , Life Technologies Corp. 510-511 (2013).
  24. Wang, X., et al. Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).
  25. Li, K., et al. Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes. Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).
  26. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
  27. Pasdois, P., et al. Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers. Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).
  28. Granville, D. J., et al. Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).
  29. Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation. Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vivoTMRM

Похожие статьи