Методическая статья

Метод подготовки слайдов для сохранения трехмерной хроматиновой архитектуры клеток яичек яичек

DOI:

10.3791/50819

⸱

10 января 2014 г.

1Division of Reproductive Sciences, Division of Developmental Biology, Perinatal Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Материал здесь описывает метод, разработанный для сохранения трехмерной хроматиновой структуры клеток зародыша яичек. Это было подемуно трехмерным (3D) методом слайда. Этот метод повышает чувствительность для обнаружения субядерных структур и применяется для иммунофлуоресценции, ДНК и РНК флуоресценции на месте гибридизации (FISH).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время дифференциации зародышевых клеток яичек структура ядерного хроматина динамически меняется. Ниже описывается метод, предназначенный для сохранения трехмерного хроматина расположение яичек зародышевых клеток, найденных у мышей; этот метод был объявлен трехмерным (3D) методом слайда. В этом методе, трубоубийства яичка сразу обработаны с шагом permeabilization который извлекает цитоплазмический материал, после этого шаг фиксации который фиксирует ядерные материалы. Трубы затем разобщены, подвеска клетки цитоспун, и клетки придерживаются слайдов. Этот метод повышает чувствительность к обнаружению субядерных структур и применим для иммунофлуоресценции, ДНК и РНК флуоресценции на месте гибридизации (FISH) и сочетание этих методов обнаружения. В качестве примера возможного применения метода 3D слайда показана РНК-6 FISH cot-1 для обнаружения зарождающихся РНК. Метод 3D слайда облегчит детальное изучение пространственных отношений между структурой хроматина, ДНК и РНК во время дифференциации зародышевых клеток яичек.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В яичках, зародышевые клетки дифференцируют от диплоидной сперматогонии через мейоз в зрелые, гаплоидные сперматозоиды. В ходе этого процесса ядерная хроматиновая структура зародышевых клеток непрерывно и динамически реконструируются. Поверхностные спреды обычно используются для цитологического исследования отдельных сперматозоидов. Преобладающий метод поверхностных спредов использует гипотоническое лечение, с помощью которого отдельные сперматозоидные клетки распространяются исплющиваются 1. Эти условия являются оптимальными для детального анализа мейотических хромосом. Хромосомные функции, такие как синаптический статус и очаги рекомбинации, легко наблюда....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.3D Подготовка слайда

  1. Подготовь следующие реагенты:
    1. Буфер CSK: 100 мм НаКл, 300 мм сахароза, 10 мМ PIPES, 3 мм MgCl2. Отрегулируйте рН до 6,8 с 1 M NaOH. Храните буфер CSK при 4 градусах Цельсия.
    2. Буфер CSK с 0,5% Triton X-100: Добавьте 200 мл буфера Triton X-100 до 40 мл буфера CSK. Смешайте раствор с помощью магнитного мешалки до полного растворения Triton X-100. Храните буфер CSK с 0,5% Triton X-100 при 4 градусах Цельсия.
    3. 4% Параформалдегид (PFA)-PBS, рН 7.4: Растворите 4 г ПФА примерно в 70-80 мл воды. Для ускорения процесса растворения добавьте приблизительно 20 мкл 4 N NaOH и держите раствор в водяной бане при ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репрезентативный результат 3D слайда показан на рисунке 2. В этом эксперименте, Cot-1 РНК FISH была выполнена для обнаружения зарождающейся транскрипции вместе с иммуностимулятором с использованием анти-CBX1 и антитела к Х2АКС. Для объединения РНК FISH и иммуностимулятора, иммуностимулятор был выполнен первым, а затем РНК FISH, как описано в3. CBX1 является хетерохроматином белка, который локализуется в перицентрометрический хетерохроматин и молчание половых хромосом при мейозе называется XY т.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В подготовке 3D слайда этап пермеабилизации предшествует этапу фиксации. Эти шаги выполняются непосредственно на семенных трубочки, тем самым сохраняя трехмерную структуру хроматина. Альтернативным вариантом сохранения хроматиновой структуры для РНК/ДНК FISH является одновременное выполнить шаг протеабилизации и шаг фиксации. Этот альтернативный метод был выполнен в сумчатых зародышевых клетках и в эмбрионах преимплантациимыши 7,8. Однако, если этап фиксации предшествует этапу пермеабилизации, это может привес.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автору нечего разглашать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Я благодарю Джинни Т. Ли за наблюдение за этим проектом, когда я была в лаборатории Ли, и Тайлера Броэринга за редактирование рукописи. Эта работа была поддержана Basil O'Connor Starter Scholar Award от Фонда Марта Dimes и NIH Грант GM098605.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ДНК Cot-1 Invitrogen18440-016
Stratagene Prime-IT Набор для флуоресцентного меченияAgilent300380
Раствор ДНК спермы сельдиInvitrogen15634-017
Этанол. 200 пруф (абсолют)Pharmco-aaper111000200
ацетат натрияSigma-AldrichS2889
Формамид деионизированныйAmerican BioanalyticalAB00600-00500
Цитрат натрия трехосновной дигидратSigma-AldrichC8532
Бычий сывороточный альбуминLifeblood Medical77110-100
Декстрана сульфат натрия соль из Leuconostoc spp.Sigma-AldrichD6001
RPMI 1640InvitrogenA10491-01
СахарозаSigma-AldrichS0389
PIPESSigma-AldrichP6757
Магния хлорид гексагидратSigma-AldrichM0250
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
ПараформальдегидSigma-Aldrich76240
Гидроксид натрияSigma-Aldrich221465
Фосфат буферизованный физиологический растворSigma-AldrichP4417
VECTASHIELD Монтажная среда с DAPIVector LaboratoriesH1200
Рибонуклеозид-ванадиловый комплексNew England BiolabsS1402S
Illustra MicroSpin G-50 КолонкиGE Healthcare27-5330-01
МикроцентрифугаEppendorf5424
ЩипцыVWR300-050
Микроцентрифуга пробиркиBioexpressC-3262-1
Cytospin 3Shandon
Coplin JarFisher08-815
Superfrost /Plus Предметные стекла для микроскопаФишер12-550-15
4-х луночная тарелкаФишер12-566-301
Крышка стекла Fisher12-544-G Воздушный
инкубаторРеволюционная наукаRS-IF-203

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
  2. Namekawa, S. H., et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germl....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3DFISHFISH 1XY

Похожие статьи