Нейтрофиловая трансэпителиальная миграция в ответ на мукосал бактериальную инфекцию способствует эпителиальной травме и клиническим заболеваниям. В пробирке была разработана модель, которая сочетает в себе патоген, нейтрофилов человека, и поляризованных слоев эпителиальных клеток человека, выращенных на трансуэлл фильтры для облегчения исследований к распутыванию молекулярных механизмов организации этого явления.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
In vitro Coculture Assay для оценки патогена индуцированной нейтрофил трансэпителиальной миграции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Слизистые поверхности служат защитными барьерами против патогенных организмов. Врожденные иммунные реакции активируются при зондировании патогена, что приводит к проникновению тканей с мигрирующими воспалительными клетками, в первую очередь нейтрофилами. Этот процесс может быть разрушительным для тканей, если чрезмерным или провел в нерешенном состоянии. Кокультурные модели in vitro могут быть использованы для изучения уникальных молекулярных механизмов, участвующих в патогенной индуцированной нейтрофиловой трансэпителиальной миграции. Этот тип модели обеспечивает универсальность в экспериментальном дизайне с возможностью контролируемых манипуляций с патогеном, эпителиальным барьером или нейтрофилом. Патогенная инфекция апической поверхности поляризованных эпителиальных монослой, выращенных на проницаемых трансвелловых фильтрах, провоцирует физиологически релевантную базолатерную к апикалиальной трансэпителиальной миграции нейтрофилов, применяемых к базолатеральной поверхности. Описанная в настоящем времени модель in vitro демонстрирует многочисленные шаги, необходимые для демонстрации миграции нейтрофилов через поляризованный эпителиальный монослой легких, который был заражен патогенной P. aeruginosa (PAO1). Описано посев и культивирование проницаемых трансвеллов с эпителиальными клетками легких человека, а также изоляция нейтрофилов от всей человеческой крови и культивирование ПАО1 и непатогенной кишечной палочки K12 (MC1000). Процесс эмиграции и количественный анализ успешно мигрировавших нейтрофилов, мобилизованных в ответ на патогенную инфекцию, показаны на основе репрезентативных данных, включая положительный и отрицательный контроль. Эта модельная система in vitro может быть использована и применена к другим слизистой поверхности. Воспалительные реакции, которые связаны с чрезмерным проникновением нейтрофилов, могут быть разрушительными для тканей организма и могут возникать при отсутствии патогенных инфекций. Лучшее понимание молекулярных механизмов, которые способствуют нейтрофиловой трансэпителиальной миграции путем экспериментальных манипуляций с системой анализа культуры in vitro, описанной в настоящем, имеет значительный потенциал для выявления новых терапевтических целей для целого ряда слизистых инфекционных, а также воспалительных заболеваний.
Введение
Слизистые поверхности служат физическими и иммунологическими барьерами, обеспечивающими защиту от внешних угроз, широко распространенных вокружающей среде 1,2. Этот защитный эпителиальный барьер может быть скомпрометирован, когда патогенные организмы вторгаются2. В случае бактериального патогена, эта встреча часто провоцирует воспалительный процесс, активируя врожденную иммунную систему и вызывая быструю мобилизацию гранулоцитов первого реагирования, известных какнейтрофилов 2-4. Химиотатические агенты, облегчающие набор нейтрофилов, частично вырабатываются слизистыми эпителиальными клетками, стремящихся избавить хозяина отпатоген....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Шаги (1-3) должны выполняться в стерильной среде под капотом ламинарного потока.
1. Коллагеновое покрытие трансвеллов
- Сделайте раствор коллагена 30 мкг/мл. Разбавить 3 мг/мл коллагенового бульона 1:100 в 60% этанола, который был пройден через блок фильтра 0,2 мкм.
- Вихрь разбавлен раствором 30 мкг/мл. Примечание: Не обязательно вихрь 3 мг / мл коллагена фондовый раствор, так как это решение является довольно вязким и пузырьки воздуха могут быть введены, потенциально снижая точность при пипетке.
- Удалите 0,33см 2 области роста трансвеллов с пор размером 3 мкм от внешней упаковки и поместите 24....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Несколько исследований показали, что патогенные эпителиальные слои облегчают нейтрофиловую трансэпителиаловуюмиграцию 3,8,19,24-28,31,32. Это происходит через патоген-специфической индукции эпителиальных клеток полученных нейтрофилов хемотаксического градиента3,23. Например, патогенные P. aeruginosa взаимодействующих с апической поверхности легких эпителиальных клеток вызывает значительное количество нейтрофилов мигрировать черезэпителиальный слой 18,22,25,26,33,34. Эта клиническ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Миграция нейтрофилов через слизистые эпителиальные поверхности является общей чертой в патологии заболеваний после заражения бактериальными патогенами3. Методология, описанная в настоящем, предлагает быстрый, простой подход к экспериментальной изоляции этого дискретного события с помощью человеческой клетки, полученной в пробирке системы анализа, что модели особенность воспалительного процесса, вызванного бактериальными инфекциями. Эта система была первоначально разработана с использованием поляризова.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана финансово NIH (1 R01 AI095338-01A1).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Клетки NCl-H292 | ATCC | CRL-1848 | |
| RPMI-1640 средний | ATCC | 30-2001 | |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | ATCC | #47085 | |
| Escherichia coli MC1000 | ATCC | #39531 | |
| D-PBS (1x) жидкий | Invitrogen | 14190-144 | без кальция и магния |
| Тепло инактивированная фетальная бычья сыворотка | Инвитроген | 10082-147 | 10% добавлен в питательную среду |
| Пенициллин-стрептомицин | Инвитроген | 15140-122 | 100х: 10 000 единиц пенициллина и 10 000 микро; г стрептомицина на мл. |
| Трипсин-ЭДТА (0,05%) | Инвитроген | 25300-062 | 50 мл аликвоты хранятся в замороженном виде при температуре -20 °С. Аликвота в использовании может храниться при 4°Ордм; C краткосрочный. |
| Сбалансированный солевой раствор Хэнка - HBSS(-) | Invitrogen | 14175-079 | Стерильный, без кальция и магния |
| Trypan Blue Solution | Invitrogen | 15250-061. | Акция = 0,4% |
| Коллаген, Крысиный хвост | Инвитроген | A10483-01 | Также может быть выделен в лаборатории непосредственно из хвостов крыс с использованием стандартных протоколов |
| Лимонная кислота | Sigma-Aldrich | C1909-500G | Компонент 1 М цитратного буфера и раствор кислотного цитрата декстрозы (ACD) |
| Цитрат натрия | Sigma-Aldrich | S4641-500G | Компонент 1 М цитратный буфер |
| Декстроза безводная | Sigma-Aldrich | D8066-250G | Компонент раствора кислого цитрата декстрозы (ACD) |
| Хлорид аммония | Sigma-Aldrich | 213330-500G | Компонент буфера для лизиса эритроцитов (RBC) |
| Бикарбонат натрия | Sigma-Aldrich | S6014-500G | Компонент буфера для лизиса эритроцитов (RBC) |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-100G | Компонент буфера для лизиса эритроцитов (RBC) |
| Порошок HBSS(+) | Sigma-Aldrich | H1387-10L | Ключевой компонент HBSS+ |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-500G | Компонент HBSS+ |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | Следуйте инструкциям производителя для покрытия стеклянных наконечников для пипеток |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| 2,2'-Azino-bis(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) диаммониевая соль (ABTS) | Sigma-Aldrich | A9941-50TAB | Ключевой компонент субстратного раствора ABTS |
| 30% Раствор перекиси водорода | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Компонент субстратного раствора ABTS |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP или fMLF) | Sigma-Aldrich | F-3506 | A Стоковый раствор 10 мМ в ДМСО следует приготовить и хранить аликвоты при температуре -20 °C. |
| Желатин типа B | Fisher Scientific | M-12026 | |
| Pseudomonas isolation agar | Fisher Scientific | DF0927-17-1 | Подписаться на информацию производителя s инструкция по изготовлению пластин |
| PIA Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-749 | Опционально, может улучшить чистоту нейтрофилов |
| 24-луночная миграционная пластина | Corning Incorporated | #3524 | |
| 24-луночная промывочная пластина | Falcon | 35-1147 | Может быть повторно использована, если замочена в 70% этаноле и тщательно промыта перед повторным использованием |
| 96-луночной пластины | Fisher Scientific | #12565501 | |
| Transwell Permeable Supports | Corning Incorporated# | 3415 | Поликарбонат; Диаметр: 6,5 мм; Площадь произрастания: 0,33 см<суп>2; Тип блюда: 24-луночная тарелка; Размер пор: 3.0 & микро; m |
| чашка Петри | Falcon | 35-1013 | Каждая чашка Петри вмещает 24 перевернутых 0,33 см2 Transwells. |
| 500 мл 0,2 мкм; м фильтр/колба | Fisher Scientific | 09-740-25A | Для стерилизации раствора кислого цитрата декстрозы (ACD) |
| 5-3/4 в стекле Пастеровская пипетка | Fisher Scientific | 13-678-20A | Покрытие наконечниками с Sigmacote перед использованием |
| Гемостат | Fisher Scientific | 13-812-14 | Изогнутый, зубчатый |
| инвертоскоп Инвертоскоп Инвертированный микроскоп | Zeiss | #342222 | |
| Versa-Max Молекулярные устройства для чтения микропланшетов | #432789 |
Ссылки
- Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
- Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threat....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
