Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

In vitro Coculture Assay для оценки патогена индуцированной нейтрофил трансэпителиальной миграции

17.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50823

⸱

6 января 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 2Department of Pediatric Gastroenterology, MGH for Children, 3Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Нейтрофиловая трансэпителиальная миграция в ответ на мукосал бактериальную инфекцию способствует эпителиальной травме и клиническим заболеваниям. В пробирке была разработана модель, которая сочетает в себе патоген, нейтрофилов человека, и поляризованных слоев эпителиальных клеток человека, выращенных на трансуэлл фильтры для облегчения исследований к распутыванию молекулярных механизмов организации этого явления.

Аннотация

Слизистые поверхности служат защитными барьерами против патогенных организмов. Врожденные иммунные реакции активируются при зондировании патогена, что приводит к проникновению тканей с мигрирующими воспалительными клетками, в первую очередь нейтрофилами. Этот процесс может быть разрушительным для тканей, если чрезмерным или провел в нерешенном состоянии.  Кокультурные модели in vitro могут быть использованы для изучения уникальных молекулярных механизмов, участвующих в патогенной индуцированной нейтрофиловой трансэпителиальной миграции. Этот тип модели обеспечивает универсальность в экспериментальном дизайне с возможностью контролируемых манипуляций с патогеном, эпителиальным барьером или нейтрофилом. Патогенная инфекция апической поверхности поляризованных эпителиальных монослой, выращенных на проницаемых трансвелловых фильтрах, провоцирует физиологически релевантную базолатерную к апикалиальной трансэпителиальной миграции нейтрофилов, применяемых к базолатеральной поверхности. Описанная в настоящем времени модель in vitro демонстрирует многочисленные шаги, необходимые для демонстрации миграции нейтрофилов через поляризованный эпителиальный монослой легких, который был заражен патогенной P. aeruginosa (PAO1). Описано посев и культивирование проницаемых трансвеллов с эпителиальными клетками легких человека, а также изоляция нейтрофилов от всей человеческой крови и культивирование ПАО1 и непатогенной кишечной палочки K12 (MC1000).  Процесс эмиграции и количественный анализ успешно мигрировавших нейтрофилов, мобилизованных в ответ на патогенную инфекцию, показаны на основе репрезентативных данных, включая положительный и отрицательный контроль. Эта модельная система in vitro может быть использована и применена к другим слизистой поверхности. Воспалительные реакции, которые связаны с чрезмерным проникновением нейтрофилов, могут быть разрушительными для тканей организма и могут возникать при отсутствии патогенных инфекций. Лучшее понимание молекулярных механизмов, которые способствуют нейтрофиловой трансэпителиальной миграции путем экспериментальных манипуляций с системой анализа культуры in vitro, описанной в настоящем, имеет значительный потенциал для выявления новых терапевтических целей для целого ряда слизистых инфекционных, а также воспалительных заболеваний.

Введение

Слизистые поверхности служат физическими и иммунологическими барьерами, обеспечивающими защиту от внешних угроз, широко распространенных вокружающей среде 1,2. Этот защитный эпителиальный барьер может быть скомпрометирован, когда патогенные организмы вторгаются2. В случае бактериального патогена, эта встреча часто провоцирует воспалительный процесс, активируя врожденную иммунную систему и вызывая быструю мобилизацию гранулоцитов первого реагирования, известных какнейтрофилов 2-4. Химиотатические агенты, облегчающие набор нейтрофилов, частично вырабатываются слизистыми эпителиальными клетками, стремящихся избавить хозяина отпатогена-нарушителя 2-4. Чрезмерное или неразрешеное нейтрофиловое проникновение слизистой оболочки эпителиальной поверхности может вызватьзначительную патологию 1,5. Это следствие неспецифического повреждения тканей, вызванного антибактериальным нейтрофиловым арсеналом5-7. В таких случаях бактериальная клиренсная способность нейтрофилов омрачается разрушением тканей хозяина во время инфекционного оскорбления.  Нарушение функции защитного эпителиального барьера может привести к усилению воздействия основных тканей на микроорганизмы и/или токсины, еще больше усугубивпатологию заболевания 8,9. Эти последствия можно наблюдать в нескольких системах органов, включая легкие и пищеварительныйтракт 1,5. Кроме того, неинфекционные воспалительные заболевания, такие как тяжелые приступы астмы, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), острый респираторный дистресс-синдром (ARDS) и воспалительные заболевания кишечника (IBD) отмечены патологическим нарушением слизистой эпителиального барьера чрезмерным нейтрофилическимответом 4,5,10-12.

Сложный процесс набора нейтрофилов после слизистой инфекции включает в себя несколько разрозненныхшагов 1,5,13,14. Во-первых, нейтрофиловы должны отойти от циркуляции через ряд взаимодействия клетки с клеткой к клетке, которые облегчают транс-эндотелиальноймиграции 1,13. Нейтрофилов далее перемещаться существующих интерстициального пространства, содержащего внеклеточнойматрицы 1,14. Чтобы достичь люмена инфицированной слизистой оболочки, нейтрофилов должны затем мигрировать черезэпителиальный барьер 1,4,5. Это сложное многоступенчатое явление часто расследуется в совокупности с использованием in vivo животных моделейинфекции 15. Такие модели полезны для установления необходимости конкретных факторов, таких как хемокины, молекулы адгезии, или сигнальные пути, которые участвуют в общем процессе, но в значительной степени недостаточны для решения молекулярных взносов, критически важных для каждого отдельного разобщеногошага 16. Кокультурные системы in vitro, моделируемые транс-эндотелиальные, транс-матрицы, или трансэпителиальной миграции нейтрофилов были особеннополезны в этом отношении 1,14,16,17.

Для расшифровки механизмов, ответственных за нейтрофиловую трансэпителиаловую миграцию в ответ на патогеннуюинфекцию 18-22, разработананадежная система анализа кокультуры. Эта модель включает в себя заражение апической поверхности поляризованных слоев эпителиальных клеток человека бактериальным патогеном с последующим применением свежеиспеченные человеческие нейтрофилы на базолатеральнойповерхности 18-22. Нейтрофилов мигрировать через эпителиальный барьер в ответ на эпителиальные производные химиотатические продукты, выделяется послепатогенной инфекции 18,21-23. Эта модельная система была использована с использованием кишечных и легких эпителиальных культур, подверженных соответствующим тканей конкретных бактериальных патогенов и обнародовал новые молекулярные механизмы, вероятно, важное значение для процесса набора нейтрофиловво время слизистой инфекции 3,8,19,24-28. Сила этой модели совместной культуры in vitro заключается в том, что дрениционистский подход позволяет исследователю экспериментально манипулировать патогеном, эпителиальным барьером и/или нейтрофилом в хорошо контролируемой, высокоразвумной, довольно недорогой системе. Insight, собранные из этого подхода могут быть эффективно использованы для проведения целенаправленного анализа разрозненных событий во время набора нейтрофилов с использованием in vivo инфекции модели 22,29,30.

Эта статья демонстрирует многочисленные шаги, необходимые для успешного создания этой воспроизводимой модели для изучения патогена индуцированной нейтрофиловой трансэпителиальной миграции. Эпителиальные барьеры легких, инфицированные патогеном Pseudomonas aeruginosa, представлены в данной статье; однако, другие эпителии тканей и патогенных микроорганизмов могут быть заменены незначительными изменениями. Посев и культивирование поляризованных слоев эпителиальных клеток легких на перевернутых коллагеновых проницаемых трансуэлловых фильтрах подробно описано в настоящем, как и рост патогенных P. aeruginosa и изоляция нейтрофилов от всей крови. Как эти компоненты объединяются для наблюдения патогена индуцированной нейтрофиловой трансэпителиальной миграции представлен вместе с соответствующими положительными и отрицательными контроля для создания воспроизводимых анализ. Универсальность этого подхода для изучения различных аспектов патогенной индуцированной нейтрофиловой трансэпителиальной миграции обсуждается со ссылкой на конкретные исследования в литературе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Шаги (1-3) должны выполняться в стерильной среде под капотом ламинарного потока.

1. Коллагеновое покрытие трансвеллов

  1. Сделайте раствор коллагена 30 мкг/мл. Разбавить 3 мг/мл коллагенового бульона 1:100 в 60% этанола, который был пройден через блок фильтра 0,2 мкм.
  2. Вихрь разбавлен раствором 30 мкг/мл. Примечание: Не обязательно вихрь 3 мг / мл коллагена фондовый раствор, так как это решение является довольно вязким и пузырьки воздуха могут быть введены, потенциально снижая точность при пипетке.
  3. Удалите 0,33см 2 области роста трансвеллов с пор размером 3 мкм от внешней упаковки и поместите 24-хорошо пластины, содержащие 12 трансвеллов вверх дном внутри капота.
  4. Смойте нижнюю тарелку и отложите в сторону. Примечание: Transwells теперь будет вверх ногами отдыхая на крышке 24-хорошо пластины
  5. Включите горелку Bunsen. Пламя гемостата для бесплодия и дайте остыть.
  6. С помощью стерильного гемостата перенесите трансвеллы в чашку Петри диаметром 150 мм х 25 мм, удерживая ее в перевернутом положении. Примечание: Не забудьте сохранить стерильность пустой пластины 24-хорошо плюс крышка, которая будет использоваться для дома трансвеллов, как только они были посеяны с эпителиальными клетками.
  7. Pipette 70 мкл коллагенового раствора 30 мкг/мл на фильтровальную мембрану каждого перевернутого трансвелла. Примечание: Поверхностное натяжение должно удерживать этот объем раствора на месте, так как вокруг мембраны фильтра нет стенок при доступе к поверхности нижней стороны. Будьте осторожны, чтобы коллагеновый раствор не капал вниз по стороне трансвелла и не перемещал трансвеллы во время процедуры покрытия.
  8. Оставьте крышку чашки Петри как минимум на 4 часа, чтобы раствор этанола испарился. Для поддержания стерильности во время этого процесса держите вентилятор капота и ультрафиолетовый свет.
  9. После того, как трансвеллы высохли, они могут быть использованы немедленно или храниться при комнатной температуре до недели при условии, что крышка чашки Петри на месте и стерильность сохраняется.

2. Проход колбы эпителиальных клеток для посева Трансвеллс

(Этот протокол конкретно описывает обработку легочной эпителиальной клеточной линии H292 для генерации эпителиальных барьеров, выращенных на трансвеллах. Другие эпителиальные клеточные линии могут быть использованы с небольшими изменениями.)

  1. Подготовьте культурную среду, добавив 10% тепловую инактивированную сыворотку плода (HI-FBS) и 1x пенициллин/стрептомицин в RPMI 1640.
  2. Теплые средства массовой информации, трипсин-ЭДТА (T-EDTA) и D-PBS в водяной бане 37 oC.
  3. Удалите колбу Т-75, содержащую клетки, из инкубатора и оцените визуальное слияние с перевернутым микроскопом. Примечание: При использовании клеток H292 колбы должны быть близко или полностью совлияться.
  4. Аспирировать мультимедиа из колбы. Сократите время, что клетки сухие, имея следующее решение в капюшоне с крышкой ослабил.
  5. Добавьте 5 мл D-PBS в колбу Т-75 и вихрем. Избегайте создания пузырьков. Удалите PBS по устремлениям.
  6. Добавьте 3 мл T-EDTA в колбу Т-75 и закружить, чтобы покрыть дно.
  7. Удалите большую часть T-EDTA, оставив примерно 0,3 мл в колбе Т-75.
  8. Распределите небольшой оставшийся объем T-EDTA по площади поверхности клеток и поместите в увлажненные инкубаторы в стандартных условиях культуры (37 oC, 5% CO2).
  9. Через некоторое время удалите колбу из инкубатора. Примечание: Клетки должны легко отделяться от поверхности колбы, осторожно нажав колбу на бок. Клетки теперь должны быть округлыми и плавающими при визуализации под микроскопом. Среднее время, затязаемое для ячеек H292, составляет 5-10 мин.
  10. Добавьте 10 мл культурных средств массовой информации в колбу, чтобы нейтрализовать T-EDTA и повторно использовать ячейки. Нарисуйте клеточный раствор в наконечник пипетки и выброс на поверхность колбы, содержащей клетки примерно пять раз, чтобы повторно использовать все клетки.
  11. Передача повторного перерасхода клеток в 15 мл трубки для посева трансвеллов. Примечание: Концентрация повторно нажатых клеток H292, подготовленных таким образом, должна варьироваться от примерно 1 х 106-1,8 х 106 клеток/мл.

3. Посев коллагена покрытием Трансвеллс с эпителиальными клетками

  1. Добавьте 70 мкл повторного клеточного раствора из 15 мл трубки в каждую перевернутую трансвеллу с коллагеновым покрытием. Примечание: Решения клеток H292 с диапазоном концентрации между 1 х10 6-1,8 х 106 клеток / мл даст примерно 70000-120000 клеток / трансвелл.
  2. Смешайте клеточной подвески, осторожно инвертирования трубки периодически, чтобы предотвратить клетки от урегулирования на дно 15 мл трубки во время посева трансвеллов. Примечание: Не вихревые клетки и будьте осторожны, что наконечник пипетки не вступают в прямой контакт с коллагеновым мембранным фильтром.
  3. После того, как все перевернутые трансвеллы были посеяны с эпителиальными клетками, заменить Петри крышка чашки и тщательно место в инкубаторе культуры тканей, увлажненной, 37 oC, 5% CO2. Позаботьтесь, чтобы избежать нарушений клеточной подвески, которая была добавлена в мембрану фильтра с коллагеновым покрытием.
  4. Поддержание перевернутых трансвеллов в инкубаторе культуры тканей, увлажненной, 37 oC, 5% CO2 в одночасье. Примечание: Пузырь жидкости, содержащей клетки, должен оставаться связанным с проницаемой фильтруемой мембраной трансвелла на протяжении всей ночной инкубации. Если фильтровальная мембрана становится сухой из-за испарения жидкости или потому, что жидкость капает вниз стороне трансвеллов, эпителиальные слои не могут расти должным образом.
  5. На следующий день добавьте 1 мл мультимедиа в оригинальную стерильную пластину 24-колодец и переверните каждый перевернутый трансвелл с помощью стерилизованного гемостата в каждую хорошо содержащую 1 мл мультимедиа.
  6. Добавить 0,2 мл средств массовой информации в верхней камере каждого трансвелла и вернуться к культуре ткани инкубатор, увлажненной, 37   oC, 5% CO2.
  7. Перевернутые трансвеллы H292 могут использоваться от 8 дней до 1 месяца после посева. Примечание: Мы предлагаем ждать как минимум 8 дней после посева трансвеллов, чтобы убедиться, что эпителиальные монослойщики полностью сформированы и обладают функциональным барьером. Можно проверить эпителиальный барьер H292, определив, способен ли монослой ограничить трансэпителиальный поток белка редиса peroxidase (HRP) после добавления к базолатеральной поверхности18.

4. Подготовка бактерий к инфекции эпителиальных слоев на трансвеллах

  1. За день до эксперимента извлекайте одну колонию P. aeruginosa PAO1 из пластины Pseudomonas Isolation Agar и одну колонию K12 E. coli MC1000 из пластины Luria-Bertani (LB) Agar и поместите в отдельные трубки, содержащие 3 мл бульона LB. ВНИМАНИЕ: P. aeruginosa является патогеном человека, стандартные меры безопасности BSL2 должны быть приняты при обращении с этим организмом.
  2. Встряхните на ночь при 225 об/мин в среде 37 oC.
  3. На следующий день удалите 1 мл из плотных бактериальных культур и поместите в 1,5 мл трубок Эппендорфа.
  4. Спин в микрофуге при 15800 х г в течение 5 мин, а затем удалить супернатант.
  5. Заранее подготовьтесь к сбалансированному соляной раствору Hanks с кальцием и магнием (HBSS). Добавьте 23,8 г HEPES и 97,5 г порошка HBSS к 9,5 л дистиллированной воды. Добавьте в раствор небольшие количества 10 M NaOH, одновременно отслеживая рН до тех пор, пока не будет достигнут стабильный рН 7,4. Довекаем объем до 10 л и храним при 4 oC.
  6. Повторное производство каждой бактериальной гранулы с 1 мл HBSS. Vortex, чтобы быть уверенным, что даже бактериальная суспензия достигается.
  7. Спин снова на 15800 х г в течение 5 мин и удалить супернатант.
  8. Повторное производство гранул PAO1 с 0,6 мл HBSS и гранул MC1000 с 0,5 мл HBSS. Вихрь бактериальных суспензий.
  9. Дальнейшее разбавление PAO1 и MC1000 перерасход гранул 1:100 в HBSS. Например, добавьте 50 мл 0,6 мл гранул PAO1, перерасходуемых на 5 мл HBSS. Примечание: Использование оптических измерений плотности (OD) для определения плотности культуры, а также стандартной единицы формирования колонии (CFU) методологии разбавления, PAO1 и MC1000 решения, подготовленные таким образом, последовательно дают между 3 х10 7-6 х 107 CFU/ml. Плотность бактериальной культуры положительно коррелирует с измерением ОД культуры на уровне 600 нм, и эта корреляция может быть использована для оценки концентрации бактериальных клеток. Для подтверждения концентрации бактериальных клеток, культура может быть разбавлена до очень низкой предполагаемой концентрации и поцаралена на агарной пластине таким образом, что можно было бы ожидать, между 30-200 бактериальных клеток, которые присутствуют на пластине. Клетки распространяются по всей пластине и инкубируется в одночасье при 37 oC таким образом, что каждая клетка образует индивидуальную колонию клеток, которая достаточно велика, чтобы быть видимой и колонии могут быть подсчитаны.

5. Изоляция нейтрофилов от целой крови

  1. Кислотный раствор декстрозы (ACD) используется в качестве антикоагулянта и готовится путем добавления 6,9 г лимонной кислоты, 12,5 г цитрата натрия и 10 г декстрозы до 500 мл дистиллированной воды. После растворения всех компонентов раствор ACD стерилизуется, проходя через блок фильтра 0,2 мкм. Храните раствор ACD при 4 oC.
  2. Перед рисованием крови добавьте 5 мл ACD в 50 мл шприца и прикрепите 21 х 3/4 Г иглы бабочки с 12 в трубках.
  3. Нанесите турникет, протрите вену алкоголем и вставьте иглу. Примечание: Любой протокол исследования с участием людей должен быть одобрен институциональным советом по обзору, и от каждого донора крови должно быть предоставлено письменное информированное согласие. Например, эксперименты, проведенные с использованием этого протокола, были одобрены Советом по институциональному обзору больницы штата Массачусетс и назначен протокол #1999-P-007782.
  4. Медленно нарисуйте 45 мл крови, гарантируя, что кровь смешивается с ACD один раз в шприце.
  5. Когда 45 мл было нарисовано (50 мл общего объема), развязать турникет перед удалением иглы. Немедленно нанесите давление на рану стерильной марлей при снятии иглы.
  6. Передача крови медленно вниз стороне 50 мл трубки в течение примерно 5-10 сек.
  7. Спин в центрифуге при температуре 1000 х г с отключенным тормозом в течение 20 минут при комнатной температуре. Примечание: Дополнительный шаг, включающий разбавление всей крови в PBS- и тщательное наложение разбавленной крови на Ficoll-Paque до центрифугации могут быть использованы для достижения несколько более высокого уровня чистоты нейтрофилов более эффективно отделяя баффи пальто от гранулоцитов8. Опуская этот шаг служит, чтобы сэкономить время без резкого воздействия урожайности или чистоты для целей этого анализа, и, таким образом, мы выступаем за не включая наложения крови на Ficoll-Paque шаг.
  8. В то время как кровь вращается, очень медленно добавить 1 г желатина в 50 мл подогревом Хэнкса сбалансированный раствор соли без кальция и магния (HBSS(-)) для подготовки 2% желатина раствора. Держите раствор при 37 oC.
  9. Аспират и отбросить плазму из 50 мл трубки крови с помощью стеклянной пипетки отзыв, который был обработан с Sigmacote.
  10. Продолжайте аспирировать очень тщательно, чтобы удалить баффи пальто, которое содержит белые кровяные тельца, в том числе лимфоцитов.
  11. По мере того как buffy пальто медленно удаляется, беловатый желтый облачный материал над слоем красной кровяных телец (РБК) исчезнет. Прекратите стремление, как только баффи пальто удаляется и слой РБК может быть четко визуализированы при просмотре сверху трубки.
  12. Старайтесь не беспокоить слой РБК, так как гранулоциты, в основном нейтрофиловы, находятся вблизи поверхности слоя РБК, но не видны.
  13. К объему 15 мл слоя РБК добавьте 30 мл теплого 2% желатина (2x объем слоя РБК).
  14. Инвертировать трубку осторожно смешивать, заботясь, чтобы свести к минимуму образование пузырьков.
  15. Инкубация при 37   oC в течение 25 мин. Примечание: РБК должны агрегировать и осесть на дно. В качестве альтернативы желатину, большой молекулярный вес dextrans может быть использован для осадка РБК8.
  16. После инкубации перенесите верхний слой светло-красноватого раствора, который содержит гранулоциты, в новую 50-млную трубку с пипеткой, будьте осторожны, чтобы не нарушить оседлый темный слой РБК во время передачи. После того, как отделены, отбросить темный слой РБК.
  17. Спин передается свет красноватый раствор, содержащий гранулоциты и некоторые РБК в центрифуге на 1000 х г с тормозом активируется в течение 10 мин при комнатной температуре для того, чтобы гранулы клеток.
  18. Слейте или аспирировать супернатант тщательно, как красноватые гранулы клеток, которые образуют следующие центрифугации, как правило, свободно.
  19. Подготовь буфер рбк лиза заранее и храните при 4 oC, добавляя 8,29 г хлорида аммония (NH4Cl), 1 г бикарбоната натрия (NaHCO3)и 0,038 г ЭДТА до 1 л дистиллированной воды в стакане. Храните буфер РБК лиза при 4 oC.
  20. Resuspend и разбить красноватые гранулы клеток с небольшим объемом холодного буфера РБК лиза. Как только гранулы клетки в растворе, заполните трубку до 50 мл буфером РБК лиза. Примечание: На данный момент и идти вперед, держать клетки на льду или при 4 oC.
  21. Спин в центрифуге при 300 х г в течение 10 мин   при 4 oC, а затем слить или аспирировать супернатант. Примечание: Супернатант будет несколько красноватый, содержащий лизные РБК. Гранулы должны быть желтовато-белыми в этой точке. Если в гранулах остаются значительные РБК, как указано в красноватой грануле, шаг 5.20-5.21 может быть повторен. Значительные РБК остаются в клеточной грануле, если красноватые гранулы из шага 5.20 недостаточно разбиты.
  22. Resuspend и разбить беловатые гранулы с небольшим объемом HBSS (-), а затем заполнить трубку до 50 мл с HBSS (-). Примечание: HBSS (-) и не HBSS должны быть использованы для повторного перерасхода беловатых гранул клеток. HBSS (-) не хватает кальция и магния.
  23. Спин снова в центрифуге при 300 х г в течение 10 мин при 4   oC.
  24. Слейте супернатант и повторно посовелите гранулы до конечного объема 1 мл HBSS (-).
  25. Добавьте 5 мкл 1 мл клеточной суспензии до 250 мкл HBSS (-) в трубке 1,5 мл Eppendorf и аккуратно смешайте вверх и вниз по пипетке.
  26. Добавьте 25 мкл разбавленной клеточной суспензии до 25 мкл 0,4% Трипан синий.
  27. Добавьте 12 мкл смеси с каждой стороны стандартного гемоцитометра.
  28. Подсчитайте количество живых клеток, которые исключили трипан синий краситель и присутствуют в среднем квадрате обеих сторон гемоцитометра.
  29. Чтобы рассчитать концентрацию клеток, умножьте среднее значение 2 квадрата на 100 (разбавленный фактор), а затем умножьте на 104, чтобы дать количество клеток/мл.
  30. Отрегулируйте окончательную концентрацию до 5 х 107 клеток/мл. Если больше 5 х 107 ячеек/мл, отрегулируйте, добавив HBSS (-). Если меньше, гранулы клеток и повторного в соответствующий объем.
  31. Держите клетки на льду до готовности к миграции анализа. Примечание: Эти клетки представляют популяцию гранулоцитов белых кровяных телец. Большинство гранулоцитов, изолированных от всей человеческой крови, являются нейтрофилами. Клетки хранятся на льду, подвешенном в HBSS (-) до тех пор, пока не будет добавлена миграционная анализ для поддержания клеток в состоянии тихие.

6. Подготовка эпителиальных слоев клеток для анализа миграции

(Этишаги не должны выполняться в стерильном капюшоне.)

  1. Удалить из инкубатора 24-хорошо пластины поддержки эпителиальных слоев, которые были культурно на нижней части мембраны трансвелл фильтра, по крайней мере восемь дней.
  2. Возьмитесь за край каждого трансвелла с гемоста, поднимите из 24-хорошо пластины и инвертировать трансуэлл над ведро отходов, чтобы отбросить культуры средств массовой информации из внутренней камеры трансвелла. Окуните каждый трансвелл в стакан для мытья, содержащий HBSS, чтобы заполнить внутреннюю камеру трансвелла HBSS. Выбросьте жидкость из внутренней камеры в ведро с отходами.
  3. Повторите шаг 6.2 для второй стирки в HBSS. После двух моет, поместите трансвеллы в новую пластину из 24-колодец, содержащую 1 мл HBSS в каждой хорошо. Примечание: Все мойки должны быть выполнены с HBSS, который нагревается до 37 oC.
  4. Наблюдайте верхнюю камеру каждого трансвелла для оценки целостности эпителиального слоя клеток. Примечание: HBSS не должен просачиваться в верхнюю камеру трансвелла и заполняться при размещении в колодец пластины из 24-х колодец, содержащей 1 мл HBSS.
  5. После тщательного наблюдения за каждым трансвеллом добавьте 0,2 мл HBSS в верхнюю камеру.
  6. Поместите в инкубатор при 37   oC, 5% CO2 во влажной камере в течение 30-60 минут, чтобы уравнотворить эпителиальные слои клеток.

7. Нейтрофил Трансэпителиальный миграционный анализ

  1. Удалите из инкубатора 24-хорошо пластины промытых трансвеллов, уравновешенных в HBSS.
  2. Возьмитесь за каждый трансвелл с гемостата и отбросить жидкость в верхней хорошо в ведро отходов.
  3. Поместите каждый трансвелл вверх дном в 150 мм х 25 мм Петри блюдо.
  4. К шести перевернутым Трансвеллам добавьте 25 мкл HBSS. Для трех перевернутых трансвеллов, заразить 25 йл P. aeruginosa (PAO1) разбавленной в HBSS, подготовленных, как описано в шаге 4. К заключительным трем перевернутым трансвеллам, заразить 25 йл кишечной палочки K12 (MC1000), разбавленной в HBSS, подготовленных, как описано в шаге 4. Это примерно 0,8 х 106-1,5 х 106 CFUs / эпителиальный слой для каждого бактериального вида, поскольку концентрация бактериальных растворов, подготовленных в шаге 4 составляет примерно 3 х 107-6 х 107 CFU/ml.
  5. Инкубация при 37   oC, 5% CO2 во влажной камере в течение 60 мин.
  6. Подготовка fMLP в качестве положительного контроля для миграции нейтрофилов, добавив 5 мкл из 10 мМ fMLP запасов до 5 мл HBSS, давая 10 МКМ решение.
  7. Вымойте трансвеллы, схвяв с гемостата и листать обратно в 24-хорошо мыть пластины, которая содержит 1 мл HBSS в нижних камерах. Добавьте 0,2 мл HBSS в верхние камеры.
  8. Возьмитесь за трансвелл с гемоста и снимите с первой пластины стирки. Перед размещением трансвеллов во вторую 24-хорошо вымытую пластину, содержащую 1 мл HBSS, выбросьте жидкость из верхней камеры в ведро с отходами. Добавьте 0,2 мл HBSS в верхнюю камеру.
  9. Повторите шаги 7.8 еще раз в общей сложности 3 моет. Примечание: Все трансвеллы должны подвергаться одинаковому режиму обработки и мытья, независимо от того, были ли они инфицированы бактериями, чтобы гарантировать, что все трансвеллы, подвергаемые анализу, манипулировали одним и тем же способом. 60 мин инфекции либо PAO1 или MC1000 не снижает жизнеспособность или изменить барьерные свойства монослойного H292, как оценивается лактат дегидрогеназы на основе токсикологического анализа и HRP поток анализа,соответственно 18,22.
  10. Приготовьте 24-хорошо миграционную пластину, добавив 1 мл HBSS в 12 скважин 24-хорошо пластины. Примечание: Эта пластина может быть подготовлена заранее.
  11. После третьей стирки выбросьте жидкость из верхних камер трансвеллов в ведро с отходами с помощью гемостата и поместите три неинфицированных трансвеллы в три скважины 24-колодной миграционной пластины, содержащей 1 мл HBSS, что представляет собой отрицательный контроль.
  12. Pipette 10 хл 10 МК раствора fMLP в каждой из трех скважин 24-ну миграционной пластины, содержащей 1 мл HBSS (100 нм).
  13. Поместите три неинфицированных трансвеллов в три скважины 24-ну миграционной пластины, содержащей 100 нм fMLP, что представляет собой положительный контроль за способностью изолированных нейтрофилов мигрировать.
  14. Поместите три трансвелла, инфицированных PAO1, и три трансвелла, инфицированных MC1000, в три скважины каждая, соответственно, из 24-ну миграционная пластина, содержащая 1 мл HBSS. Добавьте 0,1 мл HBSS в верхнюю камеру каждого трансвелла.
  15. В дополнение к 0,1 мл HBSS в каждом трансвелле, осторожно добавьте 20 мкл нейтрофиловой суспензии (5 х 107 клеток/мл), подготовленных, как описано в шаге 5. Примечание: Это представляет приблизительно 1 x 106 нейтрофилов/трансвеллов.
  16. Инкубация при 37 oC, 5% CO2 во влажной камере в течение 2 часов, чтобы позволить трансэпителиальной миграции нейтрофилов.
  17. Подготовь стандартную кривую для определения количества нейтрофилов, которые мигрировали через 2 часа. Добавьте 40 мкл подвески нейтрофила (5 x 107 клеток/мл) в 2 мл HBSS () и перенесите 1 мл в 1 мл HBSS () и выполните серийные 2 раза разбавления восемь дополнительных раз в общей сложности 10 стандартов, начиная от приблизительно 2000 клеток/мл до 1 х 106 ячеек/мл. Включите 1 мл HBSS (я) для пустого.
  18. После 2 часов миграции поднимите трансвеллы, схвячаясь гемоста и осторожно коснитесь внутренних стен 24-хорошой миграционной пластины. Откажитесь от трансвеллов.
  19. Оцените миграцию нейтрофилов в скважинах, просматривая скважины 24-хорошой миграционной пластины под перевернутым микроскопом с помощью цели 10X (см. рисунок 1 для изображений мигрирующих нейтрофилов в каждом условии).
  20. Добавьте 50 мкл 10% тритон X-100 к каждому хорошо используется в 24-ну миграционной пластины, каждый стандарт, и пустой.
  21. Поверните 24-хорошо миграционную пластину, стандарты и пустой на низкой скорости в течение 20 минут при   4 oC.
  22. Подготовь 1 М цитрат буфера заранее. Добавьте 52,5 г лимонной кислоты и 73,5 г цитрата натрия в 400 мл дистиллированной воды в стакане. Доведи рН до 4,2. Добавьте дистиллированную воду для окончательного раствора 500 мл. Храните раствор при 4 oC.
  23. Приготовьте в этот день субстратное решение ABTS. Добавьте 3 таблетки ABTS (по 10 мг каждая) и 5 мл буфера 1 м цитрата в 45 мл дистиллированной воды. Разрешить таблетки полностью раствориться в растворе. Удержание добавления 50 мкл 30% перекиси водорода до тех пор, пока не будет необходим субстратный раствор ABTS (см. шаг 7.27).
  24. Добавьте 50 мкл буфера цитрата к каждому хорошо используемому в 24-ну миграционной пластине, каждому стандарту и пустой.
  25. Передача 100 мкл каждого образца хорошо в дублировать на 96-хорошо пластины. Примечание: Очень важно тщательно смешивать содержимое в каждом образце задолго до перехода к пластине 96-колодец. Pipette раствор вверх и вниз, по крайней мере пять раз до передачи.
  26. Передача 100 мкл каждого стандарта и пустой на 96-хорошо пластины после смешивания (пустой в дубликате).
  27. Добавьте 50 мкл 30% перекиси водорода в раствор ABTS и вихрь.
  28. Добавьте 100 мкл субстратного раствора ABTS к каждому образцу на пластине из 96 колодец.
  29. Разрешить пластины развиваться в течение 5-10 минут в темноте. Примечание: Зеленый цвет должен развиваться в определенных скважинах, коррелирующих с количеством нейтрофилов, присутствующих в каждой скважине.
  30. Читайте на длине волны 405 нм с помощью микроплечница читателя.
  31. Рассчитайте количество нейтрофилов, которые мигрировали через эпителиальный слой, используя стандарты, при которых существует линейная положительная корреляция между известными числами нейтрофилов, подготовленных в качестве стандартов, и количеством активности пероксидасы, измеряемой оптической плотностью в 405 нм (см. рисунки 2 и 3 для репрезентативных данных). Примечание: Этот метод количественной оценки нейтрофила использует большое количество пероксидазы деятельности выставлены нейтрофилов из-за экспрессии миелопероксидазы. Можно рассматривать альтернативные подходы к количественной оценке нейтрофилов, такие как методы, включающие предрассовую нейтрофилы с радиоактивностью или соединениями флуоресценции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Несколько исследований показали, что патогенные эпителиальные слои облегчают нейтрофиловую трансэпителиаловуюмиграцию 3,8,19,24-28,31,32. Это происходит через патоген-специфической индукции эпителиальных клеток полученных нейтрофилов хемотаксического градиента3,23. Например, патогенные P. aeruginosa взаимодействующих с апической поверхности легких эпителиальных клеток вызывает значительное количество нейтрофилов мигрировать черезэпителиальный слой 18,22,25,26,33,34. Эта клиническ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Миграция нейтрофилов через слизистые эпителиальные поверхности является общей чертой в патологии заболеваний после заражения бактериальными патогенами3. Методология, описанная в настоящем, предлагает быстрый, простой подход к экспериментальной изоляции этого дискретного события с помощью человеческой клетки, полученной в пробирке системы анализа, что модели особенность воспалительного процесса, вызванного бактериальными инфекциями. Эта система была первоначально разработана с использованием поляризова...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана финансово NIH (1 R01 AI095338-01A1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клетки NCl-H292ATCCCRL-1848
RPMI-1640 среднийATCC30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1ATCC#47085
Escherichia coli MC1000ATCC#39531
D-PBS (1x) жидкийInvitrogen14190-144без кальция и магния
Тепло инактивированная фетальная бычья сывороткаИнвитроген10082-14710% добавлен в питательную среду
Пенициллин-стрептомицинИнвитроген15140-122100х: 10 000 единиц пенициллина и 10 000 микро; г стрептомицина на мл.
Трипсин-ЭДТА (0,05%)Инвитроген25300-06250 мл аликвоты хранятся в замороженном виде при температуре -20 °С. Аликвота в использовании может храниться при 4°Ордм; C краткосрочный.   
Сбалансированный солевой раствор Хэнка - HBSS(-)Invitrogen14175-079Стерильный, без кальция и магния
Trypan Blue SolutionInvitrogen15250-061.Акция = 0,4%
Коллаген, Крысиный хвостИнвитрогенA10483-01Также может быть выделен в лаборатории непосредственно из хвостов крыс с использованием стандартных протоколов
Лимонная кислотаSigma-AldrichC1909-500GКомпонент 1 М цитратного буфера и раствор кислотного цитрата декстрозы (ACD)
Цитрат натрияSigma-AldrichS4641-500GКомпонент 1 М цитратный буфер
Декстроза безводнаяSigma-AldrichD8066-250GКомпонент раствора кислого цитрата декстрозы (ACD)
Хлорид аммонияSigma-Aldrich213330-500GКомпонент буфера для лизиса эритроцитов (RBC)
Бикарбонат натрияSigma-AldrichS6014-500GКомпонент буфера для лизиса эритроцитов (RBC)
EDTASigma-AldrichED-100GКомпонент буфера для лизиса эритроцитов (RBC)
Порошок HBSS(+)Sigma-AldrichH1387-10LКлючевой компонент HBSS+
HEPESSigma-AldrichH3375-500GКомпонент HBSS+
SigmacoteSigma-AldrichSL2-25MLСледуйте инструкциям производителя для покрытия стеклянных наконечников для пипеток
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
2,2'-Azino-bis(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) диаммониевая соль (ABTS)Sigma-AldrichA9941-50TABКлючевой компонент субстратного раствора ABTS
30% Раствор перекиси водородаSigma-AldrichH1009-100MLКомпонент субстратного раствора ABTS
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP или fMLF)Sigma-AldrichF-3506A Стоковый раствор 10 мМ в ДМСО следует приготовить и хранить аликвоты при температуре -20 °C.
Желатин типа BFisher ScientificM-12026
Pseudomonas isolation agar Fisher ScientificDF0927-17-1Подписаться на информацию производителя s инструкция по изготовлению пластин
PIA Ficoll-Paque PLUS Fisher Scientific45-001-749Опционально, может улучшить чистоту нейтрофилов
24-луночная миграционная пластинаCorning Incorporated#3524
24-луночная промывочная пластинаFalcon35-1147Может быть повторно использована, если замочена в 70% этаноле и тщательно промыта перед повторным использованием
96-луночной пластиныFisher Scientific#12565501
Transwell Permeable Supports Corning Incorporated#3415Поликарбонат; Диаметр: 6,5 мм; Площадь произрастания: 0,33 см<суп>2; Тип блюда: 24-луночная тарелка; Размер пор: 3.0 & микро; m
чашка ПетриFalcon35-1013Каждая чашка Петри вмещает 24 перевернутых 0,33 см2 Transwells.   
500 мл 0,2 мкм; м фильтр/колбаFisher Scientific09-740-25AДля стерилизации раствора кислого цитрата декстрозы (ACD)
5-3/4 в стекле Пастеровская пипеткаFisher Scientific13-678-20AПокрытие наконечниками с Sigmacote перед использованием
ГемостатFisher Scientific13-812-14Изогнутый, зубчатый
инвертоскоп Инвертоскоп Инвертированный микроскопZeiss#342222
Versa-Max Молекулярные устройства для чтения микропланшетов#432789

Ссылки

  1. Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
  2. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).
  3. McCormick, B. A. Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator. FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).
  4. Mumy, K. L., McCormick, B. A. The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
  6. Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. The paradox of the neutrophil's role in tissue injury. J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).
  7. Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).
  8. Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).
  9. Kohler, H., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).
  10. Gane, J., Stockley, R. Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD. Thorax. 67, 553-561 (2012).
  11. Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol. Med. 17, 293-307 (2011).
  12. Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).
  13. Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. Mechanisms of neutrophil transendothelial migration. Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).
  14. Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).
  15. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).
  16. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium. Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).
  17. Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
  18. Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3. J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).
  19. McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).
  20. McCormick, B. A., et al. Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils. J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).
  21. Mrsny, R. J., et al. Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).
  22. Tamang, D. L., et al. Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers. J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).
  23. McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J. Immunol. 160, 455-466 (1998).
  24. Boll, E. J., et al. Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway. Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).
  25. Hurley, B. P., et al. The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells. Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).
  26. Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).
  27. McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium. Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).
  28. Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils. Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).
  29. Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection. Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).
  30. Pazos, M., et al. Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3. J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).
  31. Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
  32. Bhowmick, R., et al. Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation. J. Immunol. , (2013).
  33. Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).
  34. Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration. Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).
  35. Frank, D. W. Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions. Front. Microbiol. 3, 20 (2012).
  36. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).
  37. Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium. Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).
  38. Kierbel, A., et al. Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane. J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).
  39. Lee, C. A., et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).
  40. Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein. Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).
  41. Brazil, J. C., et al. Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface. J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).
  42. Lawrence, D. W., et al. Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia. J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).
  43. Hodges, K., Hecht, G. Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response. J. Physiol. 590, 433-440 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Миграцияиндуцированная патогеноминфицирование монослоя эпителиясистема фильтров Transwellвыделение нейтрофиловPseudomonas Aeruginosa PAO1активность миелопероксидазыпроцедура покрытия коллагеномбуфер Хэнкса плюс
In vitro Coculture Assay для оценки патогена индуцированной нейтрофил трансэпителиальной миграции
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.