Кусочек Культура Метод После Развитие Зуб микробов в эксплантата культуры

Краткое содержание

Здесь мы подробно метод культуры зубных микробов в нижней челюсти ломтиками использованием тканей вертолет. Этот метод позволяет уникальный доступ к зуба в процессе разработки, обеспечивая прекрасную возможность для манипуляций и рода трассировки, не доступен, используя более традиционные методы культивирования.

Аннотация

Эксплантата культура позволяет манипулирование разработке органы в определенные моменты времени и, следовательно, является важным методом для биолога развития. Для многих органов трудно получить доступ к развивающимся ткани, чтобы позволить мониторинг во время экс естественных условиях культуры. Метод ломтик культура позволяет получить доступ к ткани, так что морфогенетические движения можно проследить и конкретные клеточные популяции могут быть направлены для манипуляции или клонов трассировки.

В этой статье мы опишем метод среза культуры, который был очень успешным для культуры зубных микробов в диапазоне видов. Метод обеспечивает удобный доступ к зубу микробов, которые развиваются с такой же скоростью, наблюдаемой в естественных условиях, в окружении других челюстных тканей. Это позволяет взаимодействия между тканей зуба и окружающих тканей, подлежащих мониторингу. Хотя эта статья концентрируется на микробов зубов, и тот же протокол может применяться следовать развитие рядадругих органов, таких как слюнные железы, хрящей Меккелев, носовых желез, языка, и ухо.

Введение

Для ряда экспериментов важно, чтобы иметь возможность культуры ткани экс естественных условиях, чтобы следить за развитием. Культура разработке ткани обеспечивает доступ через определенные периоды развития и позволяет манипуляции генов путем добавления факторов в культуральной среде, или на загружалась бисера, и с помощью трансфекции и электропорации ^1. Для многих экспериментов важно иметь возможность визуализировать ткани, как он растет, например, следовать судьбу меченых клеток клона как ткань подвергается морфогенез. Это может быть особенно проблематичным для тканей, которые развиваются в глубине эмбриона, которые не являются очевидными, когда блок ткани из эмбриона культивируют. Зубы являются хорошими примерами того, как они развиваются в рамках процесса носа нижней челюсти, верхней и фронтальной. Когда вся челюсть культивируют поверхностные структуры зуба можно просматривать, но изменения в морфологии могут быть проанализированы только после срезов фиксированной ткани 2. Мы адаптировали живой технику культуры ломтик позволяет нам следить за развитием зубов зародышей и обеспечивает доступ к различным частям зуба в процессе разработки. Методика культур ломтики зубного зачатка на границе газ-жидкость, используя модифицированный метод Trowell ^3. Эти срез культуры были очень полезны в непосредственно следующий морфогенез зуба, и позволяет клонов отслеживание отдельных компонентов, таких как эмали узлом и зубной сосочек и фолликул ^1,4-7. Методика не ограничивается мышиных эмбрионов и успешно использовались для культивирования живых ломтиками свиньи и змеи зубной ткани ^8,9. В дополнение к преимуществу, которое позволяет визуализировать развития зубов, способ ломтик также имеет то преимущество, что тонкие ломтики ткани имеют увеличенный доступ к питательных веществ из среды и воздуха из инкубатора. Это приводит к улучшению роста зубов микробов, которые соответствуют развитию в естественных условиях, и шоу INVASион эндотелиальных клеток в сосочка ^7. В отличие от этого, зубные зачатки в целых челюсти культур прогрессируют медленнее, чем в естественных условиях и центром культуры часто некротических в долгосрочных культур. В среза культуры, зуб развивается в течение кусочком челюсти, и его взаимодействие с окружающим развивающихся костей и других тканей можно контролировать. В нашем методе ткань нарезанный сразу после вскрытия без необходимости вставлять в опорной среде ^10,11 и без потребности в какой-либо системе, чтобы приложить ткань к плаху. Поэтому способ неинвазивным и быстрым, что позволяет многим челюсти быть секционного за один сеанс.

Протокол

1. Создавать

1. Увеличение резкости рассечение инструментов (используя точильный камень смазанный минеральным маслом) и стерилизовать перед использованием для органной культуре с использованием 70% этанола спрей и сухой тепловой стерилизации. Увеличение резкости рассечение иглы с помощью электролиза в 2 М гидроксида натрия с использованием питания 12 V.
2. Подготовка культуральную среду, используемую для рассечения и культуры эмбриональных органов, состоящий из модифицированной Дульбекко среде F12 Расширенный Дульбекко (DMEM F12) с добавлением 1% глютамаксом и 1% пенициллина-стрептомицина.

2. Эмбрион Рассечение

1. Cull приурочен повязана беременных женщин, используя график один метод, утвержденный Министерством внутренних дел или другого руководящего органа. Отсечь кожу вокруг нижней части живота, и разрезать живот с помощью ножниц. Найдите два рога матки, которые соединяют вместе на нижней линии.
2. Рассеките из матки и место в трубе, наполненной среды на льду. Wheн на льду, ткани можно оставить на несколько часов.
3. Удалить матку и места в чашке Петри в среде под микроскопом. По возможности вскрытия эмбрионов должна быть выполнена в вытяжном шкафу с ламинарным потоком для минимизации загрязнения.
4. Рассеките из эмбрионов из матки и освободить их от внезародышевых тканей.
5. Обезглавьте эмбрионов с использованием вольфрамовой иглы и передавать головы в свежем блюдо среды.
6. Изолируйте челюсти от головы путем размещения иглы в полость рта и разрезать по направлению к задней части головы (фиг.1А и 1В). Изолированные челюсти может быть временно хранятся в среде на льду в ожидании измельчения.
7. Для целых челюсти ломтиками стадии E11.5-E15.5 идеально подходят для зубного зачатка культуры. После E15.5 развития кость в челюсти слишком трудно для измельчения. Зубные ломтики еще может быть сделано, но кость (зубная и формирования альвеолярной кости) должны сначала быть удаленырассечение до измельчения ^9. Осторожно снимите кости с использованием вольфрама иглы и пинцета.

3. Эмбрион нарезки

1. Подготовка нижней челюсти срезы тканей с использованием стандартного таблица ткани вертолет (рис. 1в). Используйте свежие лезвие после примерно 200 челюстями, и убедитесь, что он находится на одном уровне с монтажной диска, когда он падает.
2. Очистите монтажную диск и лезвие с 70% этанола перед использованием. Необходимо соблюдать осторожность при использовании аппарата, как лезвие очень острое.
3. Установите прерыватель на режущей расстоянии между 200-400 мкм в зависимости от возраста образца, и в зависимости от того, требуется ли весь зародыш зуба. Установите лезвие силу на максимуме.
4. Передача челюсть в пластиковых монтажных диска с помощью пипетки или щипцы. Организовать нижнюю челюсть на создании диска наверняка ориентация все еще ясно. Разработке язык может быть использован в качестве полезного ориентира для определения ориентации. Для моляры использования афrontal / поперечная ориентация (см. плоскость измельчения на рисунке 1b), в то время как для резцов использовать сагиттальный срез через челюсти, чтобы отразить различную ориентацию этих зубов, как они растут (см. плоскость измельчения на рисунке 2А).
5. Удалить излишки среды со всего ткани с помощью фильтровальной бумаги для того, чтобы немного высохнуть нижнюю челюсть на монтажной диска.
6. Сразу после сушки, поместите диск на круговой нержавеющей стали таблице вертолета. Включите машину, и нажать старт. В таблице автоматически перемещается слева направо и в то же время измельчения рычаг, несущий нож поднимается и упал со скоростью до 200 ударов / мин.
7. Выключите машину после того, как ткань была полностью нарезанный. Убедитесь, что лезвие рычаг находится в поднятом положении и извлеките диск. Не ставьте пальцы под лопасти руку или оставить машину без присмотра при рубке.
8. Возьмите монтажный диск и сразу добавить среднего то ломтики на диске для того, чтобы предотвратить чрезмерное высыхание. Осторожно сместить нарезанный ткани из нижней части диска с помощью вольфрамовой иглы, а затем пипеткой в небольшую чашку Петри среды (рис. 2а).
9. Отделите ломтики с помощью иглы, а затем выберите ломтики тканей, содержащие ткани интереса под стереомикроскопом (Цифры 1D, 1E и 2В). Поместите выбранные ломтики свежими чашек для культивирования со средой.

4. Кусочек Культура

1. Подготовка центральные-хорошо органной культуре блюда, готовые к культуре путем добавления приблизительно 2 мл автоклавного воды к наружной скважины, чтобы предотвратить обезвоживание, и путем установки металлическую сетку через центр чашки (фиг.3А и 3В).
2. Подготовка металлических сеток за счет сокращения полосы примерно в 4 см х 1,5 см из листов нержавеющей стальной сетки. Используйте дырокол, чтобы сделать отверстие в центре и согнитестороны по созданию шахматном конец. Сетка должна соответствовать плоским через центральную скважину, лежащих параллельно нижней части блюда (фиг.3А и 3В). Автоклав решетки стерилизовать перед использованием.
3. Отрежьте кусок прозрачного полиэтилентерефталата (ПЭТ) мембраны (размер пор 0,4 мкм) достаточно большой, чтобы закрыть отверстие в сетке. Поместите сократить мембраны в блюдо с выбранным среза.
4. Поместите кусочек сверху мембраны, а затем осторожно поднимите мембрану из среды, с ломтиком уплощенной в центре.
5. Поместите фильтр на решетке над круглым отверстием в центре, а также добавить около 1 мл культуральной среды в скважину, до уровня мембраны.
6. Для манипуляции добавить белки или низкомолекулярные ингибиторы к среде (например, ^8).
7. Сфотографируйте кусочек для записи морфологии в день 0 культуры.
8. Поместите посуду в увлажненной атмосфере 5% CO _{2 при 37 ° С в инкубаторе.}
9. Сфотографируйте культуры при интервалов в среднем 7 дней. Изменение культуральной среде каждый 48-72 час. Для просмотра фотографии ломтики с источником света снизу (фиг. 2C-E).

5. Lineage Трассировка

Если линия трассировки требуется, липофильные красители, такие как DiI или DIO может быть введен в зубного зачатка до шага 4, ломтик культуры.

1. Потяните стеклянный капилляр иглы с помощью иглы съемник.
2. Перерыв кончик иглы с помощью щипцов и поместите наконечник вниз в раствор красителя. Оставьте в течение нескольких минут, пока краситель заполняет наконечник под действием капиллярных сил.
3. Поместите заполненную иглу в держатель и закрепите с помощью трубки с аспиратором инжектора или рта.
4. Расположите кончик иглы в культуральной среде касаясь площадь среза должное быть помечены. Применение давление воздуха для вытеснения небольшое количество красителя из игольного ANд на ткани.
5. Удалить иглу и проверьте маркировку под флуоресценции.
6. Успешно меченные срезы могут быть переданы на фильтрах и культивировали, как описано в пункте 4.

Результаты

Для того, чтобы следовать за движением первого моляра зубной фолликул, 250 мкм фронтальные срезы были взяты через нижнюю челюсть использованием способа, описанного выше. Зубной фолликул слой мезенхимы, которая окружает внешнюю эмаль эпителий (OEE) развивающегося зуба, а ранее было показано, принимать участие в формировании ткани периодонта ^6. Мандибулы рассекали на E14.5, стадии крышкой развития зуба. В срезе контур зубного эпителия было ясно, и конденсации стоматологическая мезенхимы могут быть определены ка...

Обсуждение

Этот метод культуры зуба имеет то преимущество, что доступ к зубного зачатка отлично, позволяя точное происхождение отслеживание и размещение бисера в эпителии или мезенхимы. Определенные регионы развивающегося зубного зачатка, следовательно, может быть конкретно направлены. Во культуры изменение морфологии зубного зачатка может следовать, и эффект манипуляций быстро оценить.

Способ, однако, подходит только для маленьких микробов зуба до значительного образования твердых тканей, таких как де...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Этанол	VWR	101077Y	100% этанол разбавляли в дистиллированном H2O до 70%.
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
Пенициллин-стрептомицин	Sigma	P0781
DiI (Молекулярные зонды)	Vybrant	V-22885	Раствор
	Invitrogen		Клеточный трекер CM-DiI, C-7000
DiO ( Молекулярные зонды)	Vybrant	V22886
Geminator 500	Thomas	Thomas No. 3885A20	Сухотемпературная стерилизация
McIlwain измельчитель тканей	Ted Pella, Inc.	10180	Стандартная настольная
чашка для культивирования органов (Center-Well Organ Culture Dish)	Сокол	353037
мембраны (вставки для клеточных культур, 0,4 μ m размер пор)	BD Falcon	353090	ПЭТ гусеничная мембрана, 6-луночный формат
Металлические сетки (Нержавеющая сталь - AISI 304 - Mesh)	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 Инкубатор	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	Одноканальный picospritzer III
Стеклянный капилляр с нитью накала 1 мм	WPI	TW100F-4
Вольфрамовая проволока 0,1 мм	Гудфеллоу	W005138
Вольфрамовая проволока 0,38 мм	Гудфеллоу	W005155
Аспираторные трубки	Сигма	А5177	Используется для аспирации рта трассеров линии