Method Article

Приматов легких Decellularization и Recellularization помощью специализированного большого органа биореактор

DOI:

10.3791/50825

⸱

December 15th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Stem Cell Research and Regenerative Medicine, Tulane University School of Medicine, 2Division of Regenerative Medicine, Tulane National Primate Research Center, 3Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine, 4Department of Pharmacology, Tulane University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Децеллюляризация всего органа создает естественные биологические каркасы, которые могут быть использованы для регенеративной медицины. Представлено описание модели регенерации легких у нечеловекообразных приматов, в которой целые легкие децеллюляризуются, а затем засеваются взрослыми стволовыми клетками и эндотелиальными клетками в биореакторе, способствующем циркуляции сосудов и вентиляции жидких сред.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недостаточно доступных легких для удовлетворения текущих и будущих потребностей в трансплантации органов. Биоискусственная регенерация тканей является привлекательной альтернативой классической трансплантации органов. Эта технология использует естественный биологический внеклеточный матрикс (ВКМ) органа в качестве каркаса, на который аутологичные или стволовые/прогениторные клетки могут быть посажены и культивированы таким образом, чтобы облегчить регенерацию исходной ткани. Естественная ВКМ изолируется с помощью процесса, называемого децеллюляризацией. Децеллюляризация достигается путем обработки тканей рядом детергентов, солей и ферментов для достижения эффективного удаления клеточного материала, оставляя ВКМ нетронутой. Исследования, проведенные с использованием децеллюляризации и последующей рецеллюляризации легких грызунов, продемонстрировали незначительный успех в создании легочной ткани, способной к газообмену in vivo. Несмотря на то, что модели грызунов являются необходимым доказательством концепции, они не могут быть напрямую переведены на использование человеком. Нечеловекообразные приматы (NHP) предлагают более подходящую модель для исследования использования биоискусственного производства органов для возможного клинического использования.

Представлены протоколы для достижения полной децеллюляризации легких, полученных от макак-резус-резуса NHP. Полученные бесклеточные легкие могут быть засеяны различными клетками, включая мезенхимальные стволовые клетки и эндотелиальные клетки. В рукописи также описывается разработка биореакторной системы, в которой легкие макак, засеянные клетками, могут культивироваться в условиях механического растяжения и напряжения, обеспечиваемых вентиляцией под отрицательным давлением, а также пульсирующей перфузией через сосудистую систему; Известно, что эти силы направляют дифференцировку по легочной и эндотелиальной линиям соответственно. Приведены репрезентативные результаты децеллюляризации и посева клеток.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биоинженерия тканей и органов является привлекательным дополнением к области регенеративной медицины. Создание «выращенных в лаборатории» органов, пригодных для трансплантации пациентам с целью замены функциональности больных органов, крайне желательно для удовлетворения текущего и будущего спроса на потребности в трансплантации. Принципы тканевой инженерии сосредоточены на посеве желаемых типов клеток или их предшественников в каркас, который поддерживает форму сконструированной ткани, обеспечивая при этом соответствующие факторы роста и условия культивирования, необходимые для имитации процессов развития или регенерации. В то время как синтетические каркасы использо....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Децеллюляризация легкого макак всего органа

  1. Приготовление растворов
    1. Автоклав 10-15 л деионизированной воды (dH2O) в бутылки по 1-2 л.
    2. Приготовьте «Раствор Тритона» (0,1% Тритон Х-100 в dH2O), смешав 1 мл Triton X-100 с 999 мл dH2O при помешивании на магнитной мешалке. Отфильтруйте раствор через фильтрующий аппарат 0,22 мкм. Хранить при комнатной температуре.
    3. Приготовьте «раствор SDC» (2% SDC в dH2O), медленно добавляя 20 г дезоксихолата натрия (SDC) к ~900 мл dH2O при перемешивании. После того, как SDC растворится, перелейте раствор в градуированный цилинд....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Результаты, показанные ниже, представляют собой отдельные эксперименты, в которых дыхательные пути или сосудистые компартменты были засеяны мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга макак-резуса или микрососудистыми эндотелиальными клетками легких, полученными из легких, соответственно, которые были выделены и охарактеризованы как описано ранее16-18.

На протяжении всего процесса децеллюляризации легкие макак демонстрировали прогрессирующее отбеливание, достигающее кульминац.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ткани могут быть эффективно и результативно децеллюляризованы с помощью ряда методов с использованием физических, химических и ферментативных агентов12,20. Трудности производства 3D-биологических матриц из больших органов включают в себя потребность в больших объемах решений для децеллюляризации, дорогостоящем коммерческом оборудовании (т.е . биореакторах) и головокружительном количестве методологических возмущений, необходимых для получения конечного продукта, полученного из ткани. Наш метод обеспечи.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотят поблагодарить редакторов Tissue Engineering за то, что они позволили использовать изображения из предыдущей публикации в этом отчете.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Нитропруссид натрияSigma-Aldrich71778-25G Гепарин натриевая
сольFisherBP2425
Triton X-100FisherBP151-100
Дезоксихолат натрияFisherBP349-100
Хлорид натрияFisher7647-14-5
ДНКаза поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigma-AldrichDN25Подготовить бульон, аликвотировать и заморозить
сульфат магнияFisher10034-99-8
Хлорид кальцияFisherC614-500
PBS (без Ca/Mg)Gibco, Life Technologies10010-031
Антибиотик-антимикотикGibco Life Technologies15240062
Среда
Alpha MEMGibco Life Technologies12561-072
Medium 199Gibco Life Technologies11150067
Сыворотка для плода крупного рогатого скота премиум-классаAtlanta BiologicalsS11150
L-глютамин 100xGibco Life Technologies25030-081
Добавка для роста эндотелиальных клеток (ECGS)ScienCell1052
Антибиотик-антимикотикGibco Life Technologies15240062
Обратные клапаны для посева клеток и биореакторной культуры
Cole-ParmerEW-98553-20
Y-образные соединителиCole-ParmerED-30614-08
3-ходовые запорные краныHarvard Apparatus721664
MasterFlex L/S 14 трубкиCole-Parmer96420-14
MasterFlex L/S 16 трубкаCole-Parmer96420-16
Наружная вилка Luer 1/8 вCole-ParmerEW-45505-04
Внутренняя резьба Luer 1/8 вCole-ParmerSI-45502-04
Наружная вилка Luer блокировочная пробкаCole-ParmerEW-45505-56
Инъекционные портыMedi-Dose EPSIV2004
Латексная трубкаSt. Louis Medical SuppyHN10910
Хомут для шлангаCole-ParmerEW-06832-02
2 л Банка с широким горлышкомFisher05-719-276
60 мл ШприцыFisherNC9035364
для культивирования клеток

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  2. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nonhuman Primate LungLung DecellularizationBioreactor SystemExtracellular MatrixStem Cell SeedingEndothelial Cell CultureMechanical StretchPulsatile PerfusionTissue EngineeringOrgan Regeneration

Related Articles