Методическая статья

Экспериментальная модель для изучения Туберкулез-малярией Коинфекция на естественной передачи Микобактерии туберкулеза И Plasmodium berghei

21.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50829

⸱

17 февраля 2014 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, Parasitology Unit, University Hospital Heidelberg, 2Priority Area Infections, Research Center Borstel

В этой статье

Краткое содержание

Туберкулезом и малярией являются двумя из наиболее распространенных инфекций у человека и основных причин заболеваемости и смертности в бедных групп населения в тропиках. Мы создали экспериментальную модель системы для изучения исход малярии туберкулеза ко-инфекции у мышей после заражения с обеих возбудителей через их естественной пути передачи инфекции.

Аннотация

Коинфекция естественно возникают из-за географического перекрытия различных типов патогенных организмов. Параллельные инфекции, скорее всего, модулировать соответствующий иммунный ответ на каждый отдельный возбудителя и может таким образом влиять патогенез и исход заболевания. Пациенты с коинфекцией может также ответить по-разному, чтобы антиинфекционных вмешательств. Коинфекция между туберкулезом как вызванные микобактериями и малярийного паразита Plasmodium, оба из которых являются coendemic во многих частях Африки к югу от Сахары, не был изучен в деталях. Чтобы приблизиться сложным, но научно и клинически весьма актуальны вопрос, как малярия-туберкулез Коинфекция, модуль хозяин иммунитет и ход каждой болезни, мы установили экспериментальную модель мыши, что позволяет нам рассекать вызвало иммунные ответы на обоих патогенов в коинфекцией хозяина . Следует отметить, что для того, чтобы наиболее точно мимических естественно приобретенных инфекций человека, мы выполняем экспериментальныеинфекции мышей с обеих возбудителей по их естественных путей воздействия инфекции, т.е. аэрозоля и укус комара, соответственно.

Введение

Человеческие популяции редко подвергаются воздействию только одного патогена. В частности, в регионах с высоким уровнем заболеваемости инфекциями, такими как к югу от Сахары, сопутствующие инфекции представляют выгодное, но очень недооцененным проблемой общественного здравоохранения. Туберкулезом и малярией являются наиболее распространенными бактериальных и паразитарных инфекций в организме человека, соответственно и продолжают быть основными причинами заболеваемости и смертности в бедных групп населения в тропиках. Несмотря на широкое географическое перекрытия между туберкулезом и малярией и большого числа лиц, подвергающихся риску ко-инфекции, очень мало известно о взаимодействиях между различными и часто противодействующих иммунных регуляторов и эффекторов одновременно, вызываемых против малярийных паразитов и бактерий туберкулеза у пациентов с коинфекцией.

Грызунов модели смешанных инфекций позволит характеризующие дифференциальные иммунные реакции против различных патогенов в одном хозяине, что проливает свет на взаимном влиячия модулирующего патологии и клинический исход отдельного заболевания, что также поможет определить новые рекомендации для терапии и профилактики. Мы создали экспериментальную модель мыши, которая позволяет нам исследовать последствия, вызванные одновременным заражения микобактериями туберкулеза (МТБ) и грызунов Plasmodium видов в пределах одного хоста 1. Важно отметить, что для эмуляции естественно приобретенные инфицирования людей как можно ближе, наша модель реализует природные маршруты инфекции, используемые обеими патогенов. Туберкулез передается воздушно-капельным инфекции, которые, следовательно, в первую очередь проявляется в легких. Возбудитель, Mtb передается людям с активной болезнью через капельным путем, когда они изгнать инфекционных капель аэрозоля во время кашля или чихания. Таким образом, аэрозоль инфекция является методом выбора для имитации естественной инфекции. Генерация частиц в воздухе, которые содержат MTB может быть достигнуто за счет использованияиз системы вдыхание. Вся эта камера экспозиции корпус позволяет подвергая экспериментальных животных в МТБ-содержащие инфекционные аэрозольные капли (рис. 1), которые всасываются в альвеолах легких, где инфекция, инициированных 2.

Малярия, с другой стороны является трансмиссивных заболеваний, вызванных простейшими, apicomplexan паразита Plasmodium, который, естественно, передается через укус женщины Anopheline комара. Во время еды крови, инфекционные спорозоиты оседают под кожу хозяина, а затем достигают печени через кровь. В гепатоцитов они развиваются и быстро размножаются в печени стадии шизонтов. В конце концов, зрелые Шизонты разрыву и освободить тысячи патогенных мерозоитов первого поколения в кровоток, где они инициируют прогрессивную цикл вторжения эритроцитов, репликации разрыва эритроцитов и reinvasion 3. Жизненный цикл продол PlasmodiumЕЭС как некоторые мерозоитов развиваются в половых паразитов стадиях, мужской и женский гаметоциты, которые могут быть приняты до комарами во время еды крови. В комара, Plasmodium Спорозоиты развиваться в ооцист, проживающих в комара кишки и в конечном счете мигрируют в слюнные железы для последующей передачи в другую принимающей 3,4.

В то время как в экспериментальных моделях на животных поставка Mtb через аэрозоля и, таким образом, наиболее соответствующему маршруту является очень распространенным явлением, многие экспериментальные грызунов Plasmodium инфекции исследования, включающие исследований по малярии туберкулеза ко-инфекции 5-7 были проведены путем заражения мышей с пораженных эритроцитов, что приводит к малярийной инфекции крови стадии а без учета клинически немого фазе печени стадии. Тем не менее, этап печени является обязательным шагом при заражении и отношение к борьбе с плазмодия иммунитета 8-11. Мы считаем, поэтому важно включать в печени рНазы передачи малярии и поддержания в исследованиях как малярия и малярии туберкулеза ко-инфекции, соответственно. Кроме того, было показано, что, естественно, передаваемые спорозоиты более заразным, чем те, передается через иглы инфекций 12, которые побудили нам установить малярийной инфекции на укус комара вместо инъекционных изолированный слюнной железы, полученных спорозоитов. Единственный способ получить инфекционных комаров для естественной передачи малярийных паразитов является поддержание весь жизненный цикл паразита как в позвоночного хозяина (здесь мыши) и комаров-переносчиков. Таким образом, доступ к инсектарий для обеспечения паразита неизбежно, чтобы выполнить естественное передачу укусом.

Наш протокол описано здесь был разработан, чтобы исследовать, как сочетанная Plasmodium спорозоитов воздействие на хроническим туберкулезом 1. Для этого мышей аэрозоль инфицированы M. туберкулеза и 40 дней спустя, когда М. туберкулезная инфекция достигла хроническую фазу, мыши подвергаются малярии инфекционных комаров. Исход как малярия и туберкулез в коинфекцией животных может сопровождаться мониторинга паразитемии крови и бактериальной нагрузки в ткани, соответственно. В нашем протоколе, мы будем подробно описывать, как заразить мышей с обеих возбудителей через их естественный путь передачи ВИЧ и как подтвердить успешную передачу патогенов. В наших руках, обычно достигается уровень инфекции для обоих экспериментальных инфекций составляет 100%. Эти протоколы могут быть применены для изучения как инфекции отдельно или, как у нас, для моделирования и изучения коинфекцию между двумя из самых сложных инфекционных заболеваний человека. Эта модель применима и к другим Mycobacterium и грызунов Plasmodium видов, находящихся за описанным в этом протоколе.

Протокол

Меры по обеспечению безопасности и себе Этика

Исследования, представленные в настоящем документе связаны с работой с человеческим патогеном Mtb и грызунов малярийного паразита Plasmodium berghei (П. berghei). Эксперименты с Mtb (штамм H37Rv) и P. berghei должны проводиться при соответствующих условиях биобезопасности. Уровень биобезопасности (BSL) 2 лаборатории необходимы для грызунов малярийных паразитов, таких как P. berghei и BSL 3 для Mtb и, следовательно, для всех исследований Коинфекция описано здесь. ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, зараженные Mtb не распространять инфекцию на другие мышей в непосредственной близости (наш собственный наблюдение). Поэтому Спрэд к экспериментатору может быть исключена, однако соответствующую защитную одежду должен носить в BSL 3 лаборатории во все времена. Согласно нашим правилам, экспериментаторы носить хирургические скрабы, сетки для волос, одноразовые респираторы, и две пары перчаток, из которых наружный отбрасывается В любое времяRMS изымаются из шкафа. Новые ставятся на, прежде чем снова войти в кабинет. Два контейнера, один с 2% Buraton (Примечание: другие дезинфицирующие средства, утвержденные для инактивации MTB могут быть использованы в утвержденной концентрации) для жидкого материала и инфекционных отходов и один для поверхностного обеззараживания, готовятся до эксперимента и помещен внутри шкафа. Кроме того, пластиковые пакеты будут использованы для твердых отходов неинфекционной. По данным немецких правил, все работы, связанные с обработки и переработки MTB культур или ткани, полученных из Mtb инфицированных мышей должна осуществляться в класс 2 биобезопасности кабинета в BSL3 лаборатории. При обработке микобактерии, меры должны быть приняты, чтобы избежать образования аэрозолей во все времена.

Женский мышей C57BL / 6 (Charles River) в возрасте от 6-8 недель были использованы для всех экспериментах Коинфекция и поддерживается при определенных условиях барьер в BSL 3 объекта. Уход за животными и эксперименты были реrformed в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по этике для животных экспериментов Министерства сельского хозяйства, охраны окружающей среды, и в сельских районах земли Шлезвиг-Гольштейн

Для получения малярийных комаров этапы, мыши NMRI были приобретены у Charles River Laboratory, Sulzfeld, Германия и держать под конкретного патогена условий в виварии университета Гейдельберга (IBF). Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с европейскими нормами и утверждаются органами государственной власти земли Баден-Вюртемберг (Regierungspräsidium Карлсруэ).

1. Аэрозоль Заражение мышей с Mtb помощью аэрозольной камере Glas-Col

Лучший способ стандартизировать аэрозольного заражения экспериментальных животных с Mtb является использование микобактерии из замороженных запасов с известными титрами КОЕ. Для подготовки исходных культур, культура Mtb в Миддлбрук 7H9 бульона с добавлением OADC (олеиноваякислота, альбумин, декстроза, каталазы) обогащение среднего и 0,05% Tween 80, источник углерода для микобактерий и измерить, чтобы избежать образования комков бактерий в то же время. Культуры должны иметь OD ≤ 1 в момент сбора урожая. При более высокой OD, бактериальные слипания увеличивается и жизнеспособность уменьшается. Храните 1 мл аликвоты при -80 ° С. Определить количество жизнеспособных колониеобразующих единиц (КОЕ) в замороженных запасов путем посева серию 10-кратных разведений трех независимых флаконах по 7H11 пластин агара с добавлением 0,5% глицерина, 1 г / л аспарагин и OADC и перечислить колонии после 4 недель инкубации при 37 ° С. Выполнение аэрозольной инфекции как описано ниже.

  1. Оттепель Mtb запасы известной КОЕ титра и тщательно перемешать приостановлении пять раз, чтобы разогнать бактериальные скопления, используя 1 мл шприц, снабженный 27 G иглы. Избегайте производство аэрозолей.
  2. В зависимости от желаемой дозы инфекции, передавать необходимый объем микобактериальной складе в50 мл пробирку, содержащую стерильный PBS. Конечный объем составляет 6 мл. Примечание: Изменяя количество микроорганизма в этой суспензии, доля бактерий, несущих капель аэрозоля изменяется. Мы обычно стремимся на поглощение 100 жизнеспособных бактерий в легких (инфекции низкие дозы). По нашему опыту, это требует около 1-2 х 10 6 MTB / мл в общем объеме 6 мл из которых 5,5 мл являются распыленной (см. ниже). Рекомендуется сделать серию экспериментальных задач аэрозольных с различными концентрациями бактерий, чтобы найти идеальные условия для вашего инфекции. В то время как высокая доза инфекции с до 5000 микобактерий может быть сделано, чтобы ускорить инфекционный процесс, всего лишь 5 бактерий могут быть успешно использованы для инфицирования мышей аэрозолем. Скорость инфекция обычно 100%.
  3. Удалить достаточный объем (подготовленный сверх конечного объема необходимого) для посева для определения посевной титр; мы обычно удалить 500 мкл в табличке с техническими трижды.
  4. Поместите животных вотсеки корзины сетки (одна мышь в корзине) в круге, обрамленном аэрозольной камере и закройте крышку аэрозольной камере. ПРИМЕЧАНИЕ: Другие модели оснащены корзиной пирог-образный, состоящий из пяти отдельных отсеков, каждый из которых может вместить 20 мышей.
  5. Прикрепите Вентури распылитель блок с тремя из нержавеющей стали шарнирами.
  6. Снимите микобактериальную суспензии из 50 мл трубки с 10 мл шприца, снабженного с тупой иглой 18 G и нести шприц для аэрозольной камере в закрытом ящике для транспортировки.
  7. Снимите колпачок распылителя блока и осторожно вводить микобактерий суспензии в распылитель. Избегайте образования аэрозолей. Откажитесь от шприца в контейнер для острых предметов, содержащей 2% Buraton. Закройте распылитель с винтовой крышкой.
  8. Включить главный выключатель питания и УФ-лампы. Дисплей на панели управления появится "Glas-Col Apparatus Co".
  9. Поверните переключатель программ на. На дисплее появитсяпоказать "Является ли небулайзер готовы?" "загружена корзины?" Пресс введите, когда будете готовы ". Нажмите кнопку ENTER.
  10. На дисплее отображается "Enter Подогрейте время 900", это означает, что время предварительного нагрева для сжигания (который обеззараживает отработанный воздух) составляет 900 сек. Нажмите кнопку ENTER.
  11. На дисплее появится "Enter распыления раз, 1800"; это означает, что время распыляющий установлен в 1800 сек по умолчанию. Для того, чтобы продлить время распыл ющий, введите "2400" и нажмите клавишу ВВОД. ПРИМЕЧАНИЕ: Во время цикла распыляющего, воздух под давлением распыляет подвеску, тем самым формируя небольшие аэрозольные капли, содержащие микобактерии. С основным воздушным потоком, эти капли (приблизительно 2-5 мкм) осуществляется в аэрозольной камере.
  12. На дисплее появится "Enter времени CD 1800", а это значит, что цикл распада занимает 1800 сек. Установите на "2400" и нажмите клавишу ВВОД. ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого цикла, облако, которое было построено Uр в аэрозольной камере во время цикла распыляющего может распадаться. Мелкие капельки вдыхается экспериментальных животных.
  13. На дисплее появится "Enter декабря Время 900", а это значит, что цикл УФ-свет обеззараживания займет 900 сек. Нажмите кнопку ENTER. Аппарат начнет велосипеде через подогрева, распыления, облака распада и УФ обеззараживания.
    ВНИМАНИЕ: Расходомер вакуум следует указать 60 кубических футах / час (проверить при запуске подогрева цикла; настроить вакуум регулирующий клапан при необходимости) и сжатый расходомер воздуха 10 кубических футов / ч (проверить, когда распыления начинается цикл; отрегулировать клапана регулятора соответственно ).
  14. Когда цикл завершен, то клавиатура будет показывать "процесса Полный - Удалить образец". Выключите программы, УФ и главный выключатель питания.
  15. Убедитесь, что микобактериальная подвеска была распылять полностью и если нет, то записать оставшийся объем, тщательно удаляя подвеска с соответствующим шприца, снабженноготупой иглой 18 G. Оставшийся объем не должен быть более 1 мл.
  16. Снимите распылитель из суставов и поместите его в кастрюлю, содержащей 2% Buraton в течение как минимум 2 часов, как правило, дезинфекция делается O / N. Впоследствии, передавать распылитель на свежий кастрюлю и тщательно промыть водой. Оставьте распылитель до воздушно-сухого.
  17. Откройте аэрозольной камере и вернуться животных в их клетки. Сумка корзины в автоклаве сумок и автоклав. Протирать поверхности внутренней части аэрозольной камере с 2% Buraton. Примечание: По соображениям безопасности, питание очистки воздуха необходимо использовать респиратор во время этой процедуры.
  18. Использование остальные 500 мкл суспензии микобактерий (см. шаг 1.3) плита 10-кратных разведений технической трех экземплярах (3 х 100 мкл) на чашках с агаром 7H11.

2. Убедитесь, поглощение Желаемые КОЕ в легких

На следующий день после аэрозольной инфекции экспериментальных животных определить бактериальную лообъявление в легких контрольных животных, предназначенных для проверки поглощение желаемого КОЕ. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно назначают дополнительный группу 3-5 мышей для день 1 определения КОЕ.

Для контроля за ходом Mtb инфекции с течением времени, бремя микобактериальная ткань может быть рассмотрен последовательных растворов целых гомогенатах органов для определения КОЕ. Легких является основной сайт для проявления болезни при туберкулезе однако селезенки, печени и лимфатических узлов, как правило, анализируется соответственно. Разведения быть покрытием зависеть от ожидаемой нагрузки микобактериальной в органах, которые зависят от исходного посевного материала (по сравнению с низкой дозой высокой дозе), что приводит к различных бактериальных нагрузок в ткани, а также на органе и в момент времени проанализировать. По низкой инфекции дозы, бактериальная нагрузка Mtb H37Rv в легких, как правило, достигает плато между днем 25-30.

  1. Наведите эвтаназии животных (эвтаназия: CO 2 удушья илиТерминал анестезия) на салфетку на вскрытии борту в кабинете биологической безопасности класс II и дезинфицировать мышей с 70% этанола. ПРИМЕЧАНИЕ: 70% спирт предназначен только для поверхностной очистки и не убьет MTB.
  2. Сделать небольшой надрез в середине живота и отвода кожу мыши над головой.
  3. Откройте живота и грудной клетки с хирургическими ножницами и удалить грудной стенки так, что легкие доступны.
  4. Удаление легких и передавать в 15 мл пробирку с гомогенизации буфера (стерильную воду / 1% объем / объем Tween 80/1% вес / объем альбумин).
  5. Использование поршень в 5 шприц деформации мл легких через 100 мкм сита в небольшой чашке Петри.
  6. Флеш сита несколько раз с использованием 1 мл пипетки оснащен наконечником барьера и распространять гомогената легких среди 8 пластин агара (около 250 мкл / пластина;. Убедиться, что они имеют хорошо высушенную поверхность).
  7. Тщательно пластины образцы использования одноразовых разбрасыватели, которые затем удаляются в 2%Buraton.
  8. Оставьте агаром высохнуть внутри шкафа. Уплотнение каждый пластину с парафином, завернуть в алюминиевую фольгу и инкубируют в вертикальном положении при 37 ° С в течение по меньшей мере 4 недель.

3. Строительство Побег доказательство Mosquito Клетки

Штаммы грызунов Plasmodium не являются вредными для человека. Однако, так как МТБ-инфицированных мышей являются получателями паразита и работы делается под BSL 3 условия, меры предосторожности необходимы, чтобы предотвратить комаров от побега свои клетки. В зависимости от планируемого режима инфекции, автоклавируемый и многоразовые металлические каркасные клетки или самодельные одноразовые клетки могут быть использованы. Последние из них рекомендуется, если по прикуса инфекции экспериментальных животных требуется, чтобы быть осуществлена ​​определенного количества комаров на мышь. Если самодельные клетки необходимы, подготовить клетки к точным спецификациям, как здоровье комаров и безопасности лаборатории зависит от их суя очередь строительства (рис. 2).

  1. Возьмите коробку, например, полпинты мороженого коробки или бумага чашкой кофе (рис. 2).
  2. Вырезать небольшое отверстие в боковой части коробки и накройте двойным слоем латекса с разрезом разрезать каждый кусок, чтобы создать безопасную вход для комаров. ПРИМЕЧАНИЕ: Открытие имеет общий размер 2 см х 2 см, трубка (аспиратор устройство), который мы используем, чтобы принести в и / или на вынос комаров представляет собой модифицированную 15 мл Сокол трубки прикреплен к вакуумному насосу и, следовательно, служит аспиратор с диаметром 1,5 см.
  3. Лента кусочек фильтровальной бумаги на внутренней нижней части коробки, чтобы впитать капли.
  4. Закройте мороженое чашки с сеткой (два слоя из нейлона сетки, размер 1 мм х 1 мм) и закрепите на коробке с лентой и резинкой.
  5. Инфекции экспериментов, в которых требуются определенные количества комаров на мышь, подготовить клетки с 10-15 инфицированных комаров, каждый из которых содержит идеально AVподушевым 10000 дикого типа слюнных желез P. berghei Спорозоиты.
  6. В идеале, голодать комаров в течение 24 часов до выполнения еду крови.

4. Малярия Заражение мышей на укус комара

Паразит грызунов малярией, используемая здесь, П. berghei однако любой другой грызун Plasmodium штамм интерес может быть использован. Для получения инфекционных комаров для передачи спорозоита весь жизненный цикл паразита поддерживается как в позвоночного хозяина (мыши) и комаров-переносчиков. Обслуживание Паразит осуществляется в инсектарий. Для физических экспериментах передачи, минимальное количество спорозоитов на слюнной железы не должно быть меньше, чем 10000. Подробные протоколы по обеспечению паразита мы ссылаемся на методы в области научных исследований малярии на Молл и др.., 2013.

  1. Анестезировать простых мышей или животных preinfected в течение 40 дней с Mtb с кетамина (100 мг / кг)и Ксилазин (7 мг / кг) раствор путем внутрибрюшинной инъекции (200 мкл / мышь). ПРИМЕЧАНИЕ: время между Mtb и Plasmodium инфекции может быть скорректирована в зависимости от основного вопроса исследования. Кроме того, порядок вызовов патогена может быть отменено, то есть мыши могут быть подвержены инфекционным укуса комара до Mtb инфекции.
  2. Наведите анестезированы мышей на взаимозачета комаров клетки (один мыши за москитной клетку для определенной комара в соотношении мыши) и позволяют комары кормить через мембрану в течение 10-15 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие крови в организме комара кишки предполагает кормление и, таким образом, передачу спорозоита.
  3. Трансфер мышей обратно в их клетках и контролировать постоянно, пока они не просыпаются от наркоза. ПРИМЕЧАНИЕ: Место мышей на бумажное полотенце, а не на постельные принадлежности (опасность удушья) и согреться (место в тесном сотрудничестве и охватывают органы бумажным полотенцем).
  4. Статистика комаров, распыляя на них с 70% этанола или других дезинфицирующих средств через NettING из клетки. Автоклав клетки и отбрасывать, если были использованы одноразовые.

5. Мониторинг паразитемия

  1. Прокол вены хвоста в самом конце с помощью иглы и собирать одну каплю крови на каждом конце слайда.
  2. Используйте другой слайд, чтобы вытащить одну каплю крови более половины длины слайда. Флип над распределителем использовать другой край для второго мазка. Оставьте слайды высохнуть на воздухе.
  3. Гимза
    1. Поместите слайды в держателях слайд и исправить мазки крови при кратковременном погружении в абсолютном метаноле. ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку использование стеклянной посуды должны храниться как минимум в BSL 3 мы используем полипропиленовые кювет для всех решений.
    2. Погрузите мазки в Giemsa (1:10 в деионизированной воде). Через 10 мин, окуните слайды в и из окрашивания кювет, заполненных деионизированной воды несколько раз, чтобы смыть лишнюю пятно.
    3. Наконец, воздух сухой скользит в вертикальном положении.
  4. АЛЬТЕРНАТИВА пятен: Райт & #180; ы пятно
    1. Растворить пятно Райта в концентрации 1 мг / мл в метаноле.
    2. Фильтруют через складчатый фильтр перед использованием.
    3. Погрузите мазки крови в красящим раствором и выдержать в течение 4 мин (Примечание: метанол фиксация мазков не надо, как красящий раствор является метанол основе).
    4. Промыть слайдов путем промывки в деионизированной воде, как описано выше и оставить слайды высохнуть на воздухе.
    5. После того, как пятно Гимза / Райта завершена, мягко перенести все реагенты, используемые в Buraton содержащих захоронения горшка.
  5. Анализ мазка крови
    1. Анализ окрашенных мазков крови с помощью световой микроскопии при увеличении в 100 раз с масляной иммерсией.
    2. Всего незараженных и зараженных эритроцитов в области мазке крови, где эритроциты расположены в монослое.
    3. Для достижения четко определенной паразитемии, рассчитывать по крайней мере, 10 различных полей зрения отображения эритроцитов монослой.
    4. Calculели относительную паразитемии (в%) путем деления количества пораженных эритроцитов по количеству эритроцитов и умножением на 100.

Результаты

Заражение мышей с Mtb и P. berghei через естественным путем, т.е. аэрозоля и укус комара, соответственно, приводит к Постоянное и воспроизводимое инфекции всех животных (табл. 1) 1. Мы можем контролировать успешное инфекции и ход как малярия и туберкулез по определения начальной возникновение (prepatency) и количество паразитов в крови (П. berghei паразитемия) и бремя Mtb в различных органах, соответственно. Пример успешной передачи малярийного паразита инфекционными укуса комара показано в таблице 1 и на рисунке 3. Кормление 10 спорозоитов-инфицированных комаров на каждой мыши привело к скорости инфекции 100% как подтверждено присутствием в крови стадии паразитов 4-5 дней (табл. 1 и 3А). Важно отметить, что мы находим подобные цифры паразита в крови отдельных мышей того же экспериментального грппа, указывая, что передача спорозоита по комаров результатов укуса в Постоянное и воспроизводимое инфекции. Сравнивая prepatency в наивных контрольных мышей с, что в Mtb коинфекцией животных, мы видим, что prepatency слегка задерживается в мышей, которые были preinfected с Mtb (табл. 1, рис 3B) 1. Как мы уже сообщали ранее 1, мы можем определить влияние Mtb ко-инфекции на течение малярии по ежедневной паразитемией мониторинга в Гимза окрашенных мазках крови, как показано на рисунке 3В.

Заражение мышей с Mtb за счет использования системы вдыхание приводит к успешной осаждения бактерий в легких с относительно низкой изменчивости между индивидуальным мышей (рис. 4А). Мы можем следовать микобактериальные нагрузки в легких и других органов, представляющих интерес с течением времени путем определения КОЕ. Примером для микобактерий нагрузки в легкихMtb инфицированных мышей C57BL / 6 в отсутствие или в присутствии P. berghei показан на рисунке 4В.

Таблица 1. Prepatency после передачи спорозоита по укус комара. Все мыши начали крови стадии инфекции после естественной передачи P. berghei спорозоитами на укус комара. Взято из 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 с разрешения.

Экспериментальная группа мышь (C57BL / 6) Бросьте вызов на 10 инфекционных комариных укусов Количество крови ступени положительного животных / Количество животных в группе Среднее prepatency [г]
наивно П. berghei 7/7 4,4
Mtb инфицированных П. berghei 7/7 5,5 г>

figure-results-1
Рисунок 1. Общая схема экспериментальной методики. C57BL / 6 мышей подвергаются Mtb-содержащих аэрозольных капель в Glas-Col аэрозольной камере. На следующий день после аэрозольной инфекции, поглощение Mtb проверяется КОЕ анализа легких. 40 дней после Mtb вызов (когда туберкулез переходит в хроническую форму в зараженных мышей), животные подвергаются воздействию P. berghei инфицированных комаров. Для подтверждения успешной передачи спорозоита и следить за ходом Plasmodium инфекции, паразитемия контролируется ежедневно в Гимза окрашенных мазках крови, начиная через 3 дня после укуса комара.

/ Files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Эскиз москитной клетке. Инфекционные комары будут помещены внутрь коробки, такие как пол-пинты мороженого коробке. Небольшое отверстие разрезают на стороне коробки и покрыты двойным слоем латекса с разрезом сократить в каждой части, чтобы создать безопасную вход для москитов. Кусок фильтровальной бумаги выявляется на внутренней нижней части коробки, чтобы впитать капли. Мороженое чашки закрыты сеткой (Nylon меш), который крепится к коробке на ленты и эластичной лентой.

figure-results-2
Рисунок 3. Кровь паразитемия.) Пример `ы Райт окрашенного мазка крови показывая пораженных эритроцитов (Масштаб бар, 20 & #181;. М) Б) паразитемия в крови мышей контролировали путем анализа ежедневных Гимза-окрашенных мазках крови. Коинфекцией мыши имеют пониженную паразитемии по сравнению с Plasmodium отдельных инфицированных мышей (N = 10); результаты приведены как среднее ± SD; *** р <0,001. Перепечатано из 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 с разрешения.

figure-results-3
Рисунок 4. Обнаружение Mtb в легких. C57BL / 6 мышей аэрозоля сталкиваются с проблемой 100 КОЕ Mtb и 40 дней спустя, одновременно инфицированных P. berghei на укус комара.) На следующий день после аэрозольной инфекции поглощение нужного количества Mtb была уточнена покрытие целых гемогенатов легких для определения КОЕ. B) Бактериил нагрузки на момент ко-инфекции были определены в легких лизатов 3 мышей путем анализа КОЕ (MTB d40/d0). 12 дней после инфекции ТБ, лизаты легких высевали для КОЕ анализа, чтобы определить воздействие Plasmodium ко-инфекции по контролю Mtb. Примечание, что числа Mtb в легких увеличилась за ко-инфекции с Р. berghei NK65. Ось Х маркировка: время после Mtb -infection/time после сочетанной. Взято из 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 с разрешения.

Обсуждение

Мы описали, как мыши могут быть продуктивно инфицированных Mtb и P. berghei через их естественных путей воздействия инфекции. Мы применяем разработали протоколы инфекции изучать экспериментальный туберкулез 13 или малярией 12 и недавно принятый им изучить коинфекцию между Mtb и Plasmodium в мышиной модели 1.

Наиболее важные шаги для успешных инфекций передача патогенных в нужных количествах. Микобактериальные запасы не должны быть старше 2 лет, потому что они потеряют жизнеспособность в течение долгого времени, и первоначально решимости титр запасов не будет, скорее всего, больше не быть точным. В результате инфекции дозы будет намного ниже, чем ожидалось. Таким образом, КОЕ титры маточных культур должны быть определены каждые несколько месяцев. Не менее важным является стандартизированный выращивание и поколение запасов MTB в первую очередь. Условия культивирования, такие каксреда, добавки, время и объем должен быть стандартизирован для того, чтобы иметь возможность сравнивать данные из экспериментов, использующих различные запасы MTB. Микобактерии, как правило, в течение комок культуры, поэтому важно сохранить условий культивирования стандартизированы, урожай бактерии в то же фазе роста и ресуспендируют часто в течение аликвоты. В противном случае может возникнуть значительные различия в КОЕ титров и инфекции исходом.

Поколение однородно инфицированных комаров партий является еще одним важным шагом. Так как различные комары питаются каждой отдельной мыши, важно, что все москитов, используемых для одного эксперимента инфекции происходят из той же партии, и это только те партии, где более 90% от комаров, инфицированные используются.

Нынешняя модель может быть использована для рассекать иммунные реакции и иммунные модуляции в коинфекцией хозяина, сравнивая его с иммунных ответов в отдельных зараженных хостов. Мы можем применить ваполучить серьезные солидные методологии, такие как гистологии, иммуногистохимии, цитометрии анализа популяций иммунных клеток, или ПЦР и ИФА для цитокинов и обнаружения хемокинов в ткани или другими биологическими жидкостями, представляющих интерес. Следует отметить, что такие модели мыши имеют определенные ограничения. В то время как большинство людей, инфицированных Mtb разработать латентной инфекции без признаков клинических симптомов, мышей развивается хроническое заболевание с прогрессирующим патологии легких. Тем не менее, мышей C57BL / 6 относительно устойчивы к Mtb инфекции и не развивают классические гранулемы как это наблюдалось у больных туберкулезом человека. В результате иммунопатологические реакции у мышей ли отражать ни скрытую ни активный туберкулез болезни человека соответственно. Несмотря на расхождения между скрытой и хронических заболеваний у человека и мыши, мыши широко используются для выявления и изучения факторов хозяина, которые контролируют MTB инфекции и являются ценными и незаменимыми инструментами для расследованияиммунные реакции в инфекционных заболеваний. Важно отметить, что восприимчивость к инфекции Mtb значительно варьируется между часто используемых инбредных линий мышей и более чувствительными штаммами, таких как DBA или C3h могут быть включены в ко-и одно-инфекции исследований. Кроме того, помимо видов патогенных описанных здесь, могут быть использованы любые другие виды Mycobacterium интереса (например клинических изолятов). Кроме того, в то время как ни одна модель малярии не повторяет все аспекты человеческой болезни различных моделях мыши действительно напоминают различные аспекты естественно приобретенной инфекции малярии человека. Например, P. berghei АНКА и П. yoelii YM/17XL широко изучены модели человеческого (П. тропической индуцированной) тяжелой малярии, с P. berghei ANKA время рассматривается как прекрасным примером для человеческой мозговой malari с 14,15. П. berghei NK65 является отличным примером для hyperparasitaemia и острой малярийной анемии, а в последнее времяописано в качестве экспериментальной модели для малярии связаны острой респираторного дистресс-синдрома (МА-ОРДС 16). Используя описанную модель Коинфекция, мы могли недавно показали, что одновременное П. berghei NK65 инфекции усугубляет хроническую туберкулезом 1.

Наряду с использованием различных паразитов грызунов малярией, порядок и сроки инфекции событий могут быть адаптированы в зависимости от основного вопроса исследования. В области, сопутствующие инфекции Plasmodium может присутствовать в момент Mtb инфекции или приобретенных впоследствии. В обоих сценариях иммунные ответы на Mtb и Plasmodium могут быть затронуты по-разному. Таким образом, мыши могут быть инфицированы Plasmodium спорозоитов до или после Mtb инфекции. Кроме того, мыши могут быть оспорены в разное время в темах MTB инфекции для оценки влияния Plasmodium-индуцированной иммунной реакции на острые против хроническихтуберкулез. Важно отметить, что при выборе малярийного паразита для изучения малярии туберкулеза коинфекцию, следует иметь в виду, что некоторые штаммы Plasmodium грызунов вызывают острое заболевание в некоторых линий мышей и поддаться инфекции в течение всего лишь нескольких дней или недель, пока Mtb вызывает хронические и длительные инфекции в иммунокомпетентных мышей. Таким образом, выбор времени сочетанной имеет решающее значение, чтобы избежать преждевременной смерти экспериментальных животных.

Модуляция иммунитета хозяина по одновременной инфекции с несколькими видами патогенов еще малопонятным. Наша экспериментальная модель Коинфекция представляет собой мощный инструмент для расследования Mycobacterium - Plasmodium взаимодействия с иммунной системой в коинфекцией хозяина и будет способствовать нашему пониманию, как сопутствующие инфекции могут повлиять на патогенез, исход заболевания, вакцинация, иммунодиагностики и терапии.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Мириам Ester для размножения комаров. Эта работа была поддержана в доме финансирования из исследовательского центра Borstel и присоединился финансирование со стороны инфекции Лейбниц Center.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BuratonSchü Активные ингредиенты: альдегиды (формальдегид, глутаральдегид, оксальдегид, этилгексанал)
Middlebrook 7H9 SigmaM0178Для бульонных культур Mtb
Middlebrook 7H11 BD Biosciences283810Агаровая среда для культуры
Mtb Middlebrook OADC среда для обогащенияBD Biosciences212240Добавить к 7H9 и 7H11 для окрашивания культуры Mtb
Dish НаучныеуслугиE62542-12
24-слайдовый держатель с ручкойНаучные услугиE62543-06
Giemsas Azur-Eosin-Methylene синий растворMerck Millipore
Wright´ s морилкаSigmaW0625
Ингаляционная система воздействияGlas-Col
Небулайзер-VenturiGlas-Col
Стаканчики для мороженогоHä agen-dazsИспользуется в качестве клеток для комаров
Металлические каркасные клетки для комаровBioQuip Продукция1450A
109204

Ссылки

  1. Mueller, A. -K., et al. Natural Transmission of Plasmodium berghei Exacerbates Chronic Tuberculosis in an Experimental Co-Infection Model. PLoS ONE. 7, e48110(2012).
  2. Korbel, D. S., Schneider, B. E., Schaible, U. E. Innate immunity in tuberculosis: myths and truth. Microbes Infect. 10, 995-1004 (2008).
  3. Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annu. Rev. Microbiol. 63, 195-221 (2009).
  4. Cirimotich, C. M., Dong, Y., Garver, L. S., Sim, S., Dimopoulos, G. Mosquito immune defenses against Plasmodium infection. Dev. Compar. Immuno. 34, 387-395 (2010).
  5. Page, K. R., et al. Mycobacterium-induced potentiation of type 1 immune responses and protection against malaria are host specific. Infect. Immun. 73, 8369-8380 (2005).
  6. Hawkes, M., et al. Malaria exacerbates experimental mycobacterial infection in vitro and in vivo. Microbes Infect. 12, 864-874 (2010).
  7. Scott, C. P., Kumar, N., Bishai, W. R., Manabe, Y. C. Short report: modulation of Mycobacterium tuberculosis infection by Plasmodium in the murine model. Am. J. Trop. Med. Hyg. 70, 144-148 (2004).
  8. Hoffman, S. L., Doolan, D. L. Malaria vaccines-targeting infected hepatocytes. Nat. Med. 6, 1218-1219 (2000).
  9. Mueller, A. K., et al. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am. J. Pathol. 171, 107-115 (2007).
  10. Mueller, A. K., Labaied, M., Kappe, S. H., Matuschewski, K. Genetically modified Plasmodium parasites as a protective experimental malaria vaccine. Nature. 433, 164-167 (2005).
  11. Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216, 160-162 (1967).
  12. Vaughan, J. A., Scheller, L. F., Wirtz, R. A., Azad, A. F. Infectivity of Plasmodium berghei sporozoites delivered by intravenous inoculation versus mosquito bite: implications for sporozoite vaccine trials. Infect. Immun. 67, 4285-4289 (1999).
  13. Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes. J. Vis. Exp. , e228(2007).
  14. Franke-Fayard, B., et al. A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
  15. Lin, J. W., et al. Loss-of-function analyses defines vital and redundant functions of the Plasmodium rhomboid protease family. Mol. Microbiol. 88, 318-338 (2013).
  16. Bancroft, J. D. G., M, Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingstone. New York. (2007).
  17. Schneider, B. E., et al. A role for IL-18 in protective immunity against Mycobacterium tuberculosis. Eur. J. Immunol. 40, 396-405 (2010).
  18. Craig, A. G., et al. The role of animal models for research on severe malaria. PLoS Pathog. 8, e1002401(2012).
  19. de Souza, J. B., Hafalla, J. C., Riley, E. M., Couper, K. N. Cerebral malaria: why experimental murine models are required to understand the pathogenesis of disease. Parasitology. 137, 755-772 (2010).
  20. Van den Steen, P. E., et al. Immunopathology and dexamethasone therapy in a new model for malaria-associated acute respiratory distress syndrome. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 181, 957-968 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи