Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Производство и очистка нерепликативной собак аденовируса типа 2 Производные векторов

7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50833

⸱

3 декабря 2013 г.

 ,  ,  , 
1INSERM UMR 1043, CNRS UMR 5282, Université Toulouse 3, 2UMR Viroligie, INRA ENVA ANSES

В этой статье

Краткое содержание

За последние 15 лет векторы, полученные от собачьего аденовируса типа 2 (CAV2), доказали свою эффективность для трансдукции клеток in vitro и in vivo и широко используются для вакцинации и генной терапии. В этой статье мы опишем процедуру создания, получения и очистки векторов CAV2, приводящих к образованию вирусных суспензий с высоким титром.

Аннотация

Векторы аденовируса (Ad) широко используются для краткосрочного или долгосрочного переноса генов, как для генной терапии, так и для применения в вакцинах. Из-за часто встречающегося ранее существовавшего иммунитета против классического аденовируса человека 5-го типа, собачий аденовирус 2-го типа (CAV2) был предложен в качестве альтернативного вектора для переноса генов человека. Хорошо охарактеризованная биология CAV2 вместе с его простотой генетических манипуляций дают значительные преимущества, в частности, для переноса генов в центральную нервную систему или для индуцирования широкого спектра защитных иммунных реакций, от гуморального до клеточного иммунитета. В настоящее время CAV2 представляет собой один из наиболее привлекательных нечеловеческих аденовирусов для использования в качестве вакцинного вектора. Этот протокол описывает простой метод построения, получения и титрования рекомбинантных векторов CAV2. После клонирования экспрессионной кассеты интересующего гена в челночную плазмиду рекомбинантная геномная плазмида получается путем гомологичной рекомбинации в штамме бактерий E. coli BJ5183. Полученная геномная плазмида затем трансфицируется в клетки почек собак, экспрессирующие комплементарные гены CAV2-E1 (DK-E1). Вирусная амплификация позволяет получить большой вирусный запас, который очищается ультрацентрифугированием с помощью градиентов хлорида цезия и обеспрескивается диализом. Полученная вирусная суспензия обычно имеет титр более10-10 инфекционных частиц на мл и может быть непосредственно введена in vivo.

Введение

За последние десятилетия векторы, полученные из аденовирусов (Ads), доказали свою эффективность для генной терапии и вакцинации, а также в онколитической виротерапии 1. Ads — это безоболочечные икосаэдрические вирусы семейства Adenoviridae, которые были выделены от млекопитающих, птиц, рептилий, амфибий и рыб. С момента своего открытия в 1953 году ADS интенсивно изучались в качестве моделей для изучения взаимодействий вирусов и клеток, а в последнее время — в качестве векторных систем доставки генов. Действительно, векторы на основе ADS имеют множество преимуществ, таких как широкий спектр хозяев и хорошо охарактеризованная биология, а также легкость, с которой они могут быть генетически модифицированы и усилены для крупномасштабного производства.

Чтобы преодолеть клинические трудности, связанные с ранее существовавшим иммунитетом в человеческих популяциях по отношению к векторам, полученным из человеческого Ads 3, мы и другие начали выводить векторы из нечеловеческих Ads 4. Кроме того, нечеловеческие аденовирусные векторы, по-видимому, более приспособлены к массовой вакцинации в ветеринарии, чем классически используемый аденовирус типа 5 (Ad5), поскольку они должны в большей степени соответствовать требованиям безопасности при оценке риска национальными регулирующими органами. В конце 1990-х годов мы описали первый рекомбинантный CAV2 как нечеловеческую альтернативу векторам, полученным из Ad5 5. С тех пор многочисленные исследования подтвердили потенциал векторов CAV2 для терапевтического или антигенного переноса генов (для обзоров 6,7). Как и другие ADS, векторы, полученные от CAV2, стабильны и могут производиться при высоких титрах, что облегчает их использование in vivo. Они также безопасны, так как не являются интегративными, хотя и обеспечивают длительную экспрессию трансгена in vivo (>1 год) 8. Примечательно и лучше, чем человеческие серотипы Ads, было показано, что векторы CAV2 обладают высокой нейротропностью, с очень эффективным ретроградным транспортом в аксонах 9,10. Это внутреннее свойство привело к идее использования рекомбинантных векторов CAV2 для трансдукции нейронов определенных областей мозга, которые труднодоступны для лентивирусных векторов, до сих пор широко используемых для переноса генов в центральную нервную систему.

Здесь мы описываем простой и классический протокол для создания, производства и очистки нерепликативных векторов CAV2, полученных из штамма Manhattan. Рекомбинантные геномы CAV2 конструируются путем клонирования желаемого гена интереса (GOI) в кассете, расположенной ниже по течению от раннего промотора цитомегаловируса (ЦМВ), что обеспечивает повсеместную экспрессию. Векторы CAV2 обладают клонирующей способностью ~4,2.н., что позволяет экспрессировать большие кДНК. На втором этапе эта экспрессионная кассета вставляется путем гомологичной рекомбинации вместо области E1 генома CAV2, что приводит к образованию нерепликативного вируса (dlE1), как первоначально описано в работе Chartier et al. 12 Наконец, вирусные частицы получают при трансфекции геномной плазмиды в линию клеток собачьих почек, экспрессирующую CAV2-E1 (DK-E1), и последовательно амплифицируют перед концентрированием и очисткой вирусных запасов. В описанном здесь методе используется двухступенчатое ультрацентрифугирование в градиентах хлорида цезия (CsCl), что позволяет обогащать инфекционные частицы с высоким конечным титром (обычно более10-10 инфекционных частиц на мл). Затем вирусная суспензия обессоливается с помощью хроматографии с помощью одноразовых колонок Sephadex G-25, чтобы в конечном итоге она стала достаточно чистой для непосредственного использования in vivo.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Построение нерепликативной плазмиды генома CAV2

Примечание: все плазмиды, описанные в этом протоколе, были описаны ранее7 и доступны по запросу.

  1. Клонируйте ГОИ в плазмиду pShuttle, используя соответствующие ферменты рестрикции, чтобы получить pShuttle-GOI (Рисунок 1A).
  2. Расщепите 2 мкг pShuttle-GOI от AscI/PacI. В процессе расщепления фрагмент Shuttle-GOI (~2,9.н. + последовательность GOI ORF) высвобождается из плазмидного остова (2,8.н.).
  3. Очистите фрагмент Shuttle-GOI после электрофореза в агарозном геле, используя гель NucleoSpin и набор для очистки PCR.
  4. Параллельно расщепляют 1 г геномной плазмиды pCAV2 с помощью SwaI. Плазмида pCAV2 содержит уникальный сайт SwaI, расположенный в области E1 (рис. 1B). Нагрейте этот фермент рестрикции при температуре 65 °C в течение 20 минут.
  5. Трансформируйте компетентные бактерии E. coli BJ5183 с 500 нг очищенного фрагмента Shuttle-GOI и 100 нг линеаризованной плазмиды pCAV2 для гомологичной рекомбинации (Figure 1B). Распределите по пластинам LB-Amp. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C не менее 20 часов.
  6. Проведите ПЦР-анализ непосредственно на колониях бактерий с использованием мастер-смеси EmeraldAmp с прямыми (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3') и обратными (5'-GCGGTTTATCACAGTTAAATTGC-3') праймерами в следующих условиях цикла: 10 мин при 95 °C (для одного цикла), 95 °C для 1 мин; 58 °C для 1 мин; 72 °C для 1 мин/kbp (для 39 циклов), и, наконец, 5 минут при 72 °C. Продукт последовательности 1 kbp + GOI ORF амплифицируется из положительных клонов pCAV-GOI, в то время как с отрицательными клонами продукт ПЦР не может быть обнаружен
    7. .
  7. Инокулируйте не менее двух положительных колоний на ночь каждая в среду объемом 5 мл LB-ампер при температуре 37 °C в шейкере (220 об/мин).
  8. Извлекайте плазмидные ДНК с помощью набора плазмид Nucleospin. Трансформируйте компетентные бактерии E. coli DH5α с помощью аликвоты каждого препарата ДНК. Распределите бактериальную суспензию на планшетах LB-Amp и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
  9. Инокулируйте две колонии каждого положительного клона в течение ночи в среду объемом 3 мл LB-ампер при 37 °C в шейкере (220 об/мин). Извлеките плазмидную ДНК с помощью набора плазмид Nucleospin.
  10. Расщепляйте полученную ДНК и родительскую плазмиду pCAV2 (в качестве контроля) с NdeI. Шаблон ограничения родительского pCAV2 составляет 14,8 kbp, 9 kbp, 7,9 kbp и 1,6 kbp. Кассета экспрессии GOI вставляется во фрагмент размером 7,9.о. и содержит, по меньшей мере, один сайт NdeI, т.е. один в кассете и потенциальные сайты, присутствующие в GOI.
  11. Выберите положительные конструкции и перейдите к шагу 2 как минимум с 2 независимыми клонами.

2. Трансфекция рекомбинантной плазмиды генома CAV2 в клетки DK-E1

Примечание: нерепликативные векторы, полученные из CAV2, являются генетически модифицированными организмами, классифицируемыми как уровень биобезопасности 2 (BSL-2), в то время как их использование на животных моделях классифицируется как BSL-1. Пожалуйста, используйте надлежащие меры по локализации и обращению с отходами, включая средства индивидуальной защиты, и работайте под колпаками BSL-2

.
  1. За сутки до трансфекции высейте клетки DK-E1 на 6-луночный планшет. Выращивайте клетки при 37 °C и 5%CO2 в модифицированной орлиной среде Dulbecco (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, содержащей 7% инактивированной при нагревании эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 1 мМ пирувата натрия и 100 ЕД/мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина. Для трансфекции клетки должны быть слиты на 70-80%.
  2. Расщепите 2 мкг плазмиды pCAV-GOI с помощью AscI, чтобы высвободить невирусную последовательность плазмиды. Проверьте полученную схему рестрикции на 0,8% электрофорезом в агарозном геле. В результате расщепления должен быть получен фрагмент размером ~31.н., содержащий рекомбинантный геном, и фрагмент размером 2.н., соответствующий плазмидному остову.
  3. Смешайте расщепленную ДНК с 200 μл Jet Prime Buffer путем вортексирования в течение 10 секунд. Добавьте 4 μл Jet Prime и перемешайте путем вортекса в течение 10 секунд. Кратковременно отжмите для удаления капель и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.
  4. Добавьте трансфекционную смесь по каплям на клетки. Осторожно встряхните пластины, чтобы равномерно распределить смесь, и выдерживайте при температуре 37 °C.

3. Распространение рекомбинантного CAV2

  1. Через неделю после трансфекции соберите клетки и питательную среду в полипропиленовую пробирку объемом 15 мл. Разрушьте клетки с помощью трех циклов замораживания-размораживания (-80 °C/37 °C) и очистите лизат центрифугированием в течение 10 минут при 1 800 x g.
  2. Соберите надосадочную жидкость и храните при температуре -20 °С для последующего размножения вируса.
  3. Инфицировать 80-90% сливающийся монослой клеток DK-E1, выращенных в одной лунке 6-луночного планшета, 0,5 мл вируссодержащей надосадочной жидкости. Инкубировать при 37 °C в течение 1 часа при слабом перемешивании. Удалите инокулюм и замените его 1,5 мл полного DMEM, содержащего 5% термоинактивированного FCS.
  4. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 3-4 дней. Клетки следует ежедневно контролировать на предмет проявления цитопатического эффекта (CPE, рисунки 2A-B). Если четкий CPE не виден, соберите клетки через 4 дня после посева и повторите шаги 3.1-3.4.
  5. Когда прозрачный CPE поражает большинство клеток, обычно после 2-4 раундов вирусной амплификации, соберите клетки с питательной средой и заморозьте-разморозьте 3 раза, как описано выше. Инфицировать 80-90% конфлюентных клеток DK-E1, выращенных в трех чашках для культуры тканей диаметром 10 см, используя каждый раз 0,5 мл вируссодержащей надосадочной жидкости.
  6. Через 3-4 дня (когда CPE завершена) соберите клетки из этих 10-сантиметровых чашек, снова нарушьте их тремя циклами замораживания-оттаивания, очистите лизат центрифугированием в течение 10 минут при 1800 x g, соберите надосадочную жидкость и храните при -20 °C для крупномасштабной амплификации CAV2.

4. Крупномасштабная очистка CAV2

  1. Инфицировать 80-90% сливающихся монослоев клеток DK-E1, выращенных в сорока чашках для культуры тканей диаметром 10 см. На каждое блюдо используют 0,1 мл вируссодержащей надосадочной жидкости, разведенной в 1 мл полного ДМЭМ без ФТС. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 3–4 часов при слабом перемешивании. Добавьте 5 мл полного DMEM с добавлением 5% FCS.
  2. Выдерживать в течение 3 дней. Соберите зараженные клетки из сорока 10-сантиметровых чашек в полипропиленовые пробирки объемом 50 мл. Пеллетные ячейки при давлении 1200 x g в течение 10 мин при 4 °C и ресуспендируют их в 15 мл среды DMEM.
  3. Разрушайте клетки с помощью трех циклов замораживания-оттаивания (-80 °C/37 °C). Удалите клеточный мусор центрифугированием при температуре 1 800 x g в течение 10 минут и храните надосадочную жидкость при температуре -20 °C перед очисткой вирусных частиц.
  4. Приготовьте прерывистый градиент CsCl в пробирке Ultra-Clear объемом 14 мл. Сначала налейте на дно пробирки 2 мл раствора CsCl (1,40 г/мл в фосфатно-солевом буфере). Затем медленно добавьте 2 мл раствора CsCl (1,25 г/мл в фосфатно-солевом буфере) поверх первого раствора.
  5. Аккуратно загрузите вирусный надосадочный слой поверх градиента CsCl. Наполните тюбик минеральным маслом на расстоянии до 2-3 мм сверху. Центрифуга в течение 1,5 часа при 130 000 x g и 18 °C в качающемся роторе SW40.
  6. После центрифугирования на границе раздела между 2 слоями раствора CsCl хорошо видны две белые полосы (рис. 2C). С помощью иглы 21 G и шприца соберите путем бокового прокола нижнюю полосу, содержащую зрелые частицы CAV2. Старайтесь по возможности избегать скопления верхней полосы, которая соответствует пустым вирусным частицам.
  7. Приготовьте непрерывный градиент CsCl в прозрачной пробирке объемом 14 мл, смешав собранные вирусные частицы с раствором CsCl (1,34 г/мл в фосфатно-солевом буфере). Наполните тюбик минеральным маслом на расстоянии до 2-3 мм сверху. Центрифуга в течение 18 часов при 130 000 x g и 18 °C в качающемся роторе SW40.
  8. После центрифугирования соберите белую полосу, содержащую CAV2, путем бокового прокола с помощью шприца, как описано выше. Опять же, старайтесь избегать сбора оставшейся верхней полосы. Это должно быть легче в этом непрерывном градиенте, который лучше разделяет две полосы. Общий объем собранной суспензии не должен превышать 2 мл.
  9. Уравновесьте колонку Sephadex G-25 PD-10 с 30 мл PBS.
  10. Загрузите вирусную суспензию и выбросьте проточный.
  11. Разбавьте фракциями 500 мкл PBS. Соберите фракции 5-7, которые обычно содержат обессоленные частицы CAV2. Вируссодержащие фракции можно легко идентифицировать, поскольку они опалесцируют. Добавьте 150 мкл глицерина в 1,5 мл суспензии CAV2 и храните в аликвотах при -80 °С.

5. Титрование CAV2 путем разбавления конечной точки

  1. Разморозьте аликвоту очищенного вируса на льду и выполните 10-кратное серийное разведение (в диапазоне 10-2-10-12) в бессывороточном DMEM.
  2. Добавьте по 50 мкл каждого вирусного разведения в 5 лунок 96-луночного планшета. Добавьте 1,5 х 10по 4 ячейки DK-E1 в каждую лунку. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C и 5%CO2 в течение 5 дней.
  3. На 5-й день после инфицирования контролируйте появление ЦПД с помощью микроскопического наблюдения (Рисунки 2А-В). Инфекционные титры определяют как медианные инфекционные дозы тканевой культуры (ТЦД50) с использованием статистического метода Рида и Мюнха13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Создание рекомбинантных векторов CAV2 основывается на базовых, но важных методах молекулярной биологии. Перед производством вирусных векторов необходимо сконструировать рекомбинантный геном CAV2, содержащий экспрессионную кассету для трансгена. Эта конструкция создается в два этапа: сначала ген, представляющий интерес (GOI), клонируют в шаттл-плазмиду в виде экспрессионной кассеты (т. е. с промотором и сигналом полиаденилирования). Этот функциональный элемент фланкирован двумя геномными последовательностями CAV2...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный здесь простой метод, адаптированный на основе хорошо документированной технологии Ad5, позволяет эффективно получать нерепликативные векторы CAV2 с типичной способностью клонирования ~4,2.н. Что касается временных соображений, то рекомбинантный геном CAV2 обычно генерируется за две недели, в то время как для амплификации, очистки и титрования вирусных суспензий требуется еще 5 недель.

Несмотря на то, что производство первой партии векторов, полученных из CAV2, может показаться трудое...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была финансово поддержана грантами от INSERM, CNRS, Fondation pour la Recherche Médicale и Agence Nationale pour la Recherche (ANR- 10-Blanc-1322) D.G-D; Седьмая рамочная программа Европейской комиссии для Британской Колумбии; Магистерская программа была поддержана стипендией для постдокторантуры от FRM (программа "Equipe FRM 2009"); К.Б. был поддержан стипендией для постдокторантуры от UE в соответствии с соглашением о гранте No 245266 (Orbivac).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ферменты рестрикцииNew England BiolabsРазличные
наборы для трансфекции Jet PrimePolyplus114-01
DMEMGibco (Life Technologies)10567014
E. coli бактерии BJ5183Agilent200154
обессоливающая колонна PD-10GE Healthcare17-0851-01
EmeraldAmp полимеразаTakaraRR320A
Набор для плазмид NucleoSpinMacherey-Nagel740558.250
NucleoSpin Gel and PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.50
14 мл пробирки, Ultra ClearBeckman344060

Ссылки

  1. Kaufmann, J. K., Nettelbeck, D. M. Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond. Trends Mol. Med. 18, 365-376 (2012).
  2. Curr, Topics Microbiol. Immunol. 343, 195-224 (2010).
  3. Zak, D. E., et al. Merck Ad5/HIV induces broad innate immune activation that predicts CD8(+) T-cell responses but is attenuated by preexisting Ad5 immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3503-3512 (2012).
  4. Paillard, F. Advantages of non-human adenoviruses versus human adenoviruses. Hum. Gene Ther. 8, 2007-2009 (1997).
  5. Ackermann, A., Guelzow, T., Staeheli, P., Schneider, U., Heimrich, B. Visualizing viral dissemination in the mouse nervous system, using a green fluorescent protein-expressing Borna disease virus vector. J. Virol. 84, 5438-5442 (2010).
  6. Bru, T., Salinas, S., Kremer, E. J. An update on canine adenovirus type 2 and its vectors. Viruses. 2, 2134-2153 (2010).
  7. Bouet-Cararo, C., et al. Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunisation of sheep. Vaccine. 29, 1304-1310 (2011).
  8. Soudais, C., Skander, N., Kremer, E. J. Long-term in vivo transduction of neurons throughout the rat CNS using novel helper-dependent CAV-2 vectors. FASEB J. 18, 391-393 (2004).
  9. Deinhardt, K., et al. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52, 293-305 (2006).
  10. Soudais, C., Laplace-Builhe, C., Kissa, K., Kremer, E. J. Preferential transduction of neurons by canine adenovirus vectors and their efficient retrograde transport in vivo. FASEB J. 15, 2283-2285 (2001).
  11. Peltekian, E., Garcia, L., Danos, O. Neurotropism and retrograde axonal transport of a canine adenoviral vector: a tool for targeting key structures undergoing neurodegenerative processes. Mol. Ther. 5, 25-32 (2002).
  12. Chartier, C., et al. Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli. J. Virol. 70, 4805-4810 (1996).
  13. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
  14. Segura, M. M., Puig, M., Monfar, M., Chillon, M. Chromatography purification of canine adenoviral vectors. Human Gene Ther. Methods. 23, 182-197 (2012).
  15. Segura, M. M., et al. A real-time PCR assay for quantification of canine adenoviral vectors. Journal of virological. 163, 129-136 (2010).
  16. Fernandes, P., et al. Bioprocess development for canine adenovirus type 2 vectors. Gene Ther. , (2012).
  17. Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K., Kienitz, M. C., Pott, L. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol. Biol. 515, 107-123 (2009).
  18. Huang, B., Kochanek, S. Adenovirus-mediated silencing of huntingtin expression by shRNA. Hum. Gene Ther. 16, 618-626 (2005).
  19. Tordo, N., et al. Canine adenovirus based rabies vaccines. Dev. Biol. 131, 467-476 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Производство вирусных векторовочистка хлоридом цезияопределение вирусного титрагомологичная рекомбинацияциклы замораживания-оттаиванияиммунофлуоресцентная конфокальная микроскопияамплификация вирусаприготовление вирусного стокаприменение в генной терапии
Производство и очистка нерепликативной собак аденовируса типа 2 Производные векторов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.