Методическая статья
За последние 15 лет векторы, полученные от собачьего аденовируса типа 2 (CAV2), доказали свою эффективность для трансдукции клеток in vitro и in vivo и широко используются для вакцинации и генной терапии. В этой статье мы опишем процедуру создания, получения и очистки векторов CAV2, приводящих к образованию вирусных суспензий с высоким титром.
Векторы аденовируса (Ad) широко используются для краткосрочного или долгосрочного переноса генов, как для генной терапии, так и для применения в вакцинах. Из-за часто встречающегося ранее существовавшего иммунитета против классического аденовируса человека 5-го типа, собачий аденовирус 2-го типа (CAV2) был предложен в качестве альтернативного вектора для переноса генов человека. Хорошо охарактеризованная биология CAV2 вместе с его простотой генетических манипуляций дают значительные преимущества, в частности, для переноса генов в центральную нервную систему или для индуцирования широкого спектра защитных иммунных реакций, от гуморального до клеточного иммунитета. В настоящее время CAV2 представляет собой один из наиболее привлекательных нечеловеческих аденовирусов для использования в качестве вакцинного вектора. Этот протокол описывает простой метод построения, получения и титрования рекомбинантных векторов CAV2. После клонирования экспрессионной кассеты интересующего гена в челночную плазмиду рекомбинантная геномная плазмида получается путем гомологичной рекомбинации в штамме бактерий E. coli BJ5183. Полученная геномная плазмида затем трансфицируется в клетки почек собак, экспрессирующие комплементарные гены CAV2-E1 (DK-E1). Вирусная амплификация позволяет получить большой вирусный запас, который очищается ультрацентрифугированием с помощью градиентов хлорида цезия и обеспрескивается диализом. Полученная вирусная суспензия обычно имеет титр более10-10 инфекционных частиц на мл и может быть непосредственно введена in vivo.
За последние десятилетия векторы, полученные из аденовирусов (Ads), доказали свою эффективность для генной терапии и вакцинации, а также в онколитической виротерапии 1. Ads — это безоболочечные икосаэдрические вирусы семейства Adenoviridae, которые были выделены от млекопитающих, птиц, рептилий, амфибий и рыб. С момента своего открытия в 1953 году ADS интенсивно изучались в качестве моделей для изучения взаимодействий вирусов и клеток, а в последнее время — в качестве векторных систем доставки генов. Действительно, векторы на основе ADS имеют множество преимуществ, таких как широкий спектр хозяев и хорошо охарактеризованная биология, а т....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
1. Построение нерепликативной плазмиды генома CAV2
Примечание: все плазмиды, описанные в этом протоколе, были описаны ранее7 и доступны по запросу.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Создание рекомбинантных векторов CAV2 основывается на базовых, но важных методах молекулярной биологии. Перед производством вирусных векторов необходимо сконструировать рекомбинантный геном CAV2, содержащий экспрессионную кассету для трансгена. Эта конструкция создается в два этапа: сначала ген, представляющий интерес (GOI), клонируют в шаттл-плазмиду в виде экспрессионной кассеты (т. е. с промотором и сигналом полиаденилирования). Этот функциональный элемент фланкирован двумя геномными последовательностями CAV2.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Описанный здесь простой метод, адаптированный на основе хорошо документированной технологии Ad5, позволяет эффективно получать нерепликативные векторы CAV2 с типичной способностью клонирования ~4,2.н. Что касается временных соображений, то рекомбинантный геном CAV2 обычно генерируется за две недели, в то время как для амплификации, очистки и титрования вирусных суспензий требуется еще 5 недель.
Несмотря на то, что производство первой партии векторов, полученных из CAV2, может показаться трудое.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторам нечего раскрывать.
Эта работа была финансово поддержана грантами от INSERM, CNRS, Fondation pour la Recherche Médicale и Agence Nationale pour la Recherche (ANR- 10-Blanc-1322) D.G-D; Седьмая рамочная программа Европейской комиссии для Британской Колумбии; Магистерская программа была поддержана стипендией для постдокторантуры от FRM (программа "Equipe FRM 2009"); К.Б. был поддержан стипендией для постдокторантуры от UE в соответствии с соглашением о гранте No 245266 (Orbivac).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ферменты рестрикции | New England Biolabs | Различные | |
| наборы для трансфекции Jet Prime | Polyplus | 114-01 | |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 10567014 | |
| E. coli бактерии BJ5183 | Agilent | 200154 | |
| обессоливающая колонна PD-10 | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| EmeraldAmp полимераза | Takara | RR320A | |
| Набор для плазмид NucleoSpin | Macherey-Nagel | 740558.250 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| 14 мл пробирки, Ultra Clear | Beckman | 344060 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение