Методическая статья

Производство и очистка нерепликативной собак аденовируса типа 2 Производные векторов

DOI:

10.3791/50833

⸱

3 декабря 2013 г.

 ,  ,  , 
1INSERM UMR 1043, CNRS UMR 5282, Université Toulouse 3, 2UMR Viroligie, INRA ENVA ANSES

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последние 15 лет векторы, полученные от собачьего аденовируса типа 2 (CAV2), доказали свою эффективность для трансдукции клеток in vitro и in vivo и широко используются для вакцинации и генной терапии. В этой статье мы опишем процедуру создания, получения и очистки векторов CAV2, приводящих к образованию вирусных суспензий с высоким титром.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Векторы аденовируса (Ad) широко используются для краткосрочного или долгосрочного переноса генов, как для генной терапии, так и для применения в вакцинах. Из-за часто встречающегося ранее существовавшего иммунитета против классического аденовируса человека 5-го типа, собачий аденовирус 2-го типа (CAV2) был предложен в качестве альтернативного вектора для переноса генов человека. Хорошо охарактеризованная биология CAV2 вместе с его простотой генетических манипуляций дают значительные преимущества, в частности, для переноса генов в центральную нервную систему или для индуцирования широкого спектра защитных иммунных реакций, от гуморального до клеточного иммунитета. В настоящее время CAV2 представляет собой один из наиболее привлекательных нечеловеческих аденовирусов для использования в качестве вакцинного вектора. Этот протокол описывает простой метод построения, получения и титрования рекомбинантных векторов CAV2. После клонирования экспрессионной кассеты интересующего гена в челночную плазмиду рекомбинантная геномная плазмида получается путем гомологичной рекомбинации в штамме бактерий E. coli BJ5183. Полученная геномная плазмида затем трансфицируется в клетки почек собак, экспрессирующие комплементарные гены CAV2-E1 (DK-E1). Вирусная амплификация позволяет получить большой вирусный запас, который очищается ультрацентрифугированием с помощью градиентов хлорида цезия и обеспрескивается диализом. Полученная вирусная суспензия обычно имеет титр более10-10 инфекционных частиц на мл и может быть непосредственно введена in vivo.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последние десятилетия векторы, полученные из аденовирусов (Ads), доказали свою эффективность для генной терапии и вакцинации, а также в онколитической виротерапии 1. Ads — это безоболочечные икосаэдрические вирусы семейства Adenoviridae, которые были выделены от млекопитающих, птиц, рептилий, амфибий и рыб. С момента своего открытия в 1953 году ADS интенсивно изучались в качестве моделей для изучения взаимодействий вирусов и клеток, а в последнее время — в качестве векторных систем доставки генов. Действительно, векторы на основе ADS имеют множество преимуществ, таких как широкий спектр хозяев и хорошо охарактеризованная биология, а также легкость, с которой они могут быть генетически модифицированы и усилены для крупномасштабного производства.

Чтобы преодолеть клинические трудности, связанные с ранее существовавшим иммунитетом в человеческих популяциях по отношению к векторам, полученным из человеческого Ads 3, мы и другие начали выводить векторы из нечеловеческих Ads 4. Кроме того, нечеловеческие аденовирусные векторы, по-видимому, более приспособлены к массовой вакцинации в ветеринарии, чем классически используемый аденовирус типа 5 (Ad5), поскольку они должны в большей степени соответствовать требованиям безопасности при оценке риска национальными регулирующими органами. В конце 1990-х годов мы описали первый рекомбинантный CAV2 как нечеловеческую альтернативу векторам, полученным из Ad5 5. С тех пор многочисленные исследования подтвердили потенциал векторов CAV2 для терапевтического или антигенного переноса генов (для обзоров 6,7). Как и другие ADS, векторы, полученные от CAV2, стабильны и могут производиться при высоких титрах, что облегчает их использование in vivo. Они также безопасны, так как не являются интегративными, хотя и обеспечивают длительную экспрессию трансгена in vivo (>1 год) 8. Примечательно и лучше, чем человеческие серотипы Ads, было показано, что векторы CAV2 обладают высокой нейротропностью, с очень эффективным ретроградным транспортом в аксонах 9,10. Это внутреннее свойство привело к идее использования рекомбинантных векторов CAV2 для трансдукции нейронов определенных областей мозга, которые труднодоступны для лентивирусных векторов, до сих пор широко используемых для переноса генов в центральную нервную систему.

Здесь мы описываем простой и классический протокол для создания, производства и очистки нерепликативных векторов CAV2, полученных из штамма Manhattan. Рекомбинантные геномы CAV2 конструируются путем клонирования желаемого гена интереса (GOI) в кассете, расположенной ниже по течению от раннего промотора цитомегаловируса (ЦМВ), что обеспечивает повсеместную экспрессию. Векторы CAV2 обладают клонирующей способностью ~4,2.н., что позволяет экспрессировать большие кДНК. На втором этапе эта экспрессионная кассета вставляется путем гомологичной рекомбинации вместо области E1 генома CAV2, что приводит к образованию нерепликативного вируса (dlE1), как первоначально описано в работе Chartier et al. 12 Наконец, вирусные частицы получают при трансфекции геномной плазмиды в линию клеток собачьих почек, экспрессирующую CAV2-E1 (DK-E1), и последовательно амплифицируют перед концентрированием и очисткой вирусных запасов. В описанном здесь методе используется двухступенчатое ультрацентрифугирование в градиентах хлорида цезия (CsCl), что позволяет обогащать инфекционные частицы с высоким конечным титром (обычно более10-10 инфекционных частиц на мл). Затем вирусная суспензия обессоливается с помощью хроматографии с помощью одноразовых колонок Sephadex G-25, чтобы в конечном итоге она стала достаточно чистой для непосредственного использования in vivo.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Построение нерепликативной плазмиды генома CAV2

Примечание: все плазмиды, описанные в этом протоколе, были описаны ранее7 и доступны по запросу.

  1. Клонируйте ГОИ в плазмиду pShuttle, используя соответствующие ферменты рестрикции, чтобы получить pShuttle-GOI (Рисунок 1A).
  2. Расщепите 2 мкг pShuttle-GOI от AscI/PacI. В процессе расщепления фрагмент Shuttle-GOI (~2,9.н. + последовательность GOI ORF) высвобождается из плазмидного остова (2,8.н.).
  3. Очистите фрагмент Shuttle-GOI после электрофореза в агарозном геле, используя гель NucleoSpin и набор для очистки PCR.
  4. Параллельно расщепляют 1 г геномной плазмиды pCAV2 с помощью SwaI. Плазмида pCAV2 содержит уникальный сайт SwaI, расположенный в области E1 (рис. 1B). Нагрейте этот фермент рестрикции при температуре 65 °C в течение 20 минут.
  5. Трансформируйте компетентные бактерии E. coli BJ5183 с 500 нг очищенного фрагмента Shuttle-GOI и 100 нг линеаризованной плазмиды pCAV2 для гомологичной рекомбинации (Figure 1B). Распределите по пластинам LB-Amp. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C не менее 20 часов.
  6. Проведите ПЦР-анализ непосредственно на колониях бактерий с использованием мастер-смеси EmeraldAmp с прямыми (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3') и обратными (5'-GCGGTTTATCACAGTTAAATTGC-3') праймерами в следующих условиях цикла: 10 мин при 95 °C (для одного цикла), 95 °C для 1 мин; 58 °C для 1 мин; 72 °C для 1 мин/kbp (для 39 циклов), и, наконец, 5 минут при 72 °C. Продукт последовательности 1 kbp + GOI ORF амплифицируется из положительных клонов pCAV-GOI, в то время как с отрицательными клонами продукт ПЦР не может быть обнаружен
    7. .
  7. Инокулируйте не менее двух положительных колоний на ночь каждая в среду объемом 5 мл LB-ампер при температуре 37 °C в шейкере (220 об/мин).
  8. Извлекайте плазмидные ДНК с помощью набора плазмид Nucleospin. Трансформируйте компетентные бактерии E. coli DH5α с помощью аликвоты каждого препарата ДНК. Распределите бактериальную суспензию на планшетах LB-Amp и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
  9. Инокулируйте две колонии каждого положительного клона в течение ночи в среду объемом 3 мл LB-ампер при 37 °C в шейкере (220 об/мин). Извлеките плазмидную ДНК с помощью набора плазмид Nucleospin.
  10. Расщепляйте полученную ДНК и родительскую плазмиду pCAV2 (в качестве контроля) с NdeI. Шаблон ограничения родительского pCAV2 составляет 14,8 kbp, 9 kbp, 7,9 kbp и 1,6 kbp. Кассета экспрессии GOI вставляется во фрагмент размером 7,9.о. и содержит, по меньшей мере, один сайт NdeI, т.е. один в кассете и потенциальные сайты, присутствующие в GOI.
  11. Выберите положительные конструкции и перейдите к шагу 2 как минимум с 2 независимыми клонами.

2. Трансфекция рекомбинантной плазмиды генома CAV2 в клетки DK-E1

Примечание: нерепликативные векторы, полученные из CAV2, являются генетически модифицированными организмами, классифицируемыми как уровень биобезопасности 2 (BSL-2), в то время как их использование на животных моделях классифицируется как BSL-1. Пожалуйста, используйте надлежащие меры по локализации и обращению с отходами, включая средства индивидуальной защиты, и работайте под колпаками BSL-2

.
  1. За сутки до трансфекции высейте клетки DK-E1 на 6-луночный планшет. Выращивайте клетки при 37 °C и 5%CO2 в модифицированной орлиной среде Dulbecco (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, содержащей 7% инактивированной при нагревании эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 1 мМ пирувата натрия и 100 ЕД/мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина. Для трансфекции клетки должны быть слиты на 70-80%.
  2. Расщепите 2 мкг плазмиды pCAV-GOI с помощью AscI, чтобы высвободить невирусную последовательность плазмиды. Проверьте полученную схему рестрикции на 0,8% электрофорезом в агарозном геле. В результате расщепления должен быть получен фрагмент размером ~31.н., содержащий рекомбинантный геном, и фрагмент размером 2.н., соответствующий плазмидному остову.
  3. Смешайте расщепленную ДНК с 200 μл Jet Prime Buffer путем вортексирования в течение 10 секунд. Добавьте 4 μл Jet Prime и перемешайте путем вортекса в течение 10 секунд. Кратковременно отжмите для удаления капель и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.
  4. Добавьте трансфекционную смесь по каплям на клетки. Осторожно встряхните пластины, чтобы равномерно распределить смесь, и выдерживайте при температуре 37 °C.

3. Распространение рекомбинантного CAV2

  1. Через неделю после трансфекции соберите клетки и питательную среду в полипропиленовую пробирку объемом 15 мл. Разрушьте клетки с помощью трех циклов замораживания-размораживания (-80 °C/37 °C) и очистите лизат центрифугированием в течение 10 минут при 1 800 x g.
  2. Соберите надосадочную жидкость и храните при температуре -20 °С для последующего размножения вируса.
  3. Инфицировать 80-90% сливающийся монослой клеток DK-E1, выращенных в одной лунке 6-луночного планшета, 0,5 мл вируссодержащей надосадочной жидкости. Инкубировать при 37 °C в течение 1 часа при слабом перемешивании. Удалите инокулюм и замените его 1,5 мл полного DMEM, содержащего 5% термоинактивированного FCS.
  4. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 3-4 дней. Клетки следует ежедневно контролировать на предмет проявления цитопатического эффекта (CPE, рисунки 2A-B). Если четкий CPE не виден, соберите клетки через 4 дня после посева и повторите шаги 3.1-3.4.
  5. Когда прозрачный CPE поражает большинство клеток, обычно после 2-4 раундов вирусной амплификации, соберите клетки с питательной средой и заморозьте-разморозьте 3 раза, как описано выше. Инфицировать 80-90% конфлюентных клеток DK-E1, выращенных в трех чашках для культуры тканей диаметром 10 см, используя каждый раз 0,5 мл вируссодержащей надосадочной жидкости.
  6. Через 3-4 дня (когда CPE завершена) соберите клетки из этих 10-сантиметровых чашек, снова нарушьте их тремя циклами замораживания-оттаивания, очистите лизат центрифугированием в течение 10 минут при 1800 x g, соберите надосадочную жидкость и храните при -20 °C для крупномасштабной амплификации CAV2.

4. Крупномасштабная очистка CAV2

  1. Инфицировать 80-90% сливающихся монослоев клеток DK-E1, выращенных в сорока чашках для культуры тканей диаметром 10 см. На каждое блюдо используют 0,1 мл вируссодержащей надосадочной жидкости, разведенной в 1 мл полного ДМЭМ без ФТС. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 3–4 часов при слабом перемешивании. Добавьте 5 мл полного DMEM с добавлением 5% FCS.
  2. Выдерживать в течение 3 дней. Соберите зараженные клетки из сорока 10-сантиметровых чашек в полипропиленовые пробирки объемом 50 мл. Пеллетные ячейки при давлении 1200 x g в течение 10 мин при 4 °C и ресуспендируют их в 15 мл среды DMEM.
  3. Разрушайте клетки с помощью трех циклов замораживания-оттаивания (-80 °C/37 °C). Удалите клеточный мусор центрифугированием при температуре 1 800 x g в течение 10 минут и храните надосадочную жидкость при температуре -20 °C перед очисткой вирусных частиц.
  4. Приготовьте прерывистый градиент CsCl в пробирке Ultra-Clear объемом 14 мл. Сначала налейте на дно пробирки 2 мл раствора CsCl (1,40 г/мл в фосфатно-солевом буфере). Затем медленно добавьте 2 мл раствора CsCl (1,25 г/мл в фосфатно-солевом буфере) поверх первого раствора.
  5. Аккуратно загрузите вирусный надосадочный слой поверх градиента CsCl. Наполните тюбик минеральным маслом на расстоянии до 2-3 мм сверху. Центрифуга в течение 1,5 часа при 130 000 x g и 18 °C в качающемся роторе SW40.
  6. После центрифугирования на границе раздела между 2 слоями раствора CsCl хорошо видны две белые полосы (рис. 2C). С помощью иглы 21 G и шприца соберите путем бокового прокола нижнюю полосу, содержащую зрелые частицы CAV2. Старайтесь по возможности избегать скопления верхней полосы, которая соответствует пустым вирусным частицам.
  7. Приготовьте непрерывный градиент CsCl в прозрачной пробирке объемом 14 мл, смешав собранные вирусные частицы с раствором CsCl (1,34 г/мл в фосфатно-солевом буфере). Наполните тюбик минеральным маслом на расстоянии до 2-3 мм сверху. Центрифуга в течение 18 часов при 130 000 x g и 18 °C в качающемся роторе SW40.
  8. После центрифугирования соберите белую полосу, содержащую CAV2, путем бокового прокола с помощью шприца, как описано выше. Опять же, старайтесь избегать сбора оставшейся верхней полосы. Это должно быть легче в этом непрерывном градиенте, который лучше разделяет две полосы. Общий объем собранной суспензии не должен превышать 2 мл.
  9. Уравновесьте колонку Sephadex G-25 PD-10 с 30 мл PBS.
  10. Загрузите вирусную суспензию и выбросьте проточный.
  11. Разбавьте фракциями 500 мкл PBS. Соберите фракции 5-7, которые обычно содержат обессоленные частицы CAV2. Вируссодержащие фракции можно легко идентифицировать, поскольку они опалесцируют. Добавьте 150 мкл глицерина в 1,5 мл суспензии CAV2 и храните в аликвотах при -80 °С.

5. Титрование CAV2 путем разбавления конечной точки

  1. Разморозьте аликвоту очищенного вируса на льду и выполните 10-кратное серийное разведение (в диапазоне 10-2-10-12) в бессывороточном DMEM.
  2. Добавьте по 50 мкл каждого вирусного разведения в 5 лунок 96-луночного планшета. Добавьте 1,5 х 10по 4 ячейки DK-E1 в каждую лунку. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C и 5%CO2 в течение 5 дней.
  3. На 5-й день после инфицирования контролируйте появление ЦПД с помощью микроскопического наблюдения (Рисунки 2А-В). Инфекционные титры определяют как медианные инфекционные дозы тканевой культуры (ТЦД50) с использованием статистического метода Рида и Мюнха13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Создание рекомбинантных векторов CAV2 основывается на базовых, но важных методах молекулярной биологии. Перед производством вирусных векторов необходимо сконструировать рекомбинантный геном CAV2, содержащий экспрессионную кассету для трансгена. Эта конструкция создается в два этапа: сначала ген, представляющий интерес (GOI), клонируют в шаттл-плазмиду в виде экспрессионной кассеты (т. е. с промотором и сигналом полиаденилирования). Этот функциональный элемент фланкирован двумя геномными последовательностями CAV2...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь простой метод, адаптированный на основе хорошо документированной технологии Ad5, позволяет эффективно получать нерепликативные векторы CAV2 с типичной способностью клонирования ~4,2.н. Что касается временных соображений, то рекомбинантный геном CAV2 обычно генерируется за две недели, в то время как для амплификации, очистки и титрования вирусных суспензий требуется еще 5 недель.

Несмотря на то, что производство первой партии векторов, полученных из CAV2, может показаться трудое...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была финансово поддержана грантами от INSERM, CNRS, Fondation pour la Recherche Médicale и Agence Nationale pour la Recherche (ANR- 10-Blanc-1322) D.G-D; Седьмая рамочная программа Европейской комиссии для Британской Колумбии; Магистерская программа была поддержана стипендией для постдокторантуры от FRM (программа "Equipe FRM 2009"); К.Б. был поддержан стипендией для постдокторантуры от UE в соответствии с соглашением о гранте No 245266 (Orbivac).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ферменты рестрикцииNew England BiolabsРазличные
наборы для трансфекции Jet PrimePolyplus114-01
DMEMGibco (Life Technologies)10567014
E. coli бактерии BJ5183Agilent200154
обессоливающая колонна PD-10GE Healthcare17-0851-01
EmeraldAmp полимеразаTakaraRR320A
Набор для плазмид NucleoSpinMacherey-Nagel740558.250
NucleoSpin Gel and PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.50
14 мл пробирки, Ultra ClearBeckman344060

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufmann, J. K., Nettelbeck, D. M. Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond. Trends Mol. Med. 18, 365-376 (2012).
  2. Curr, Topics Microbiol. Immunol. 343, 195-224 (2010).
  3. Zak, D. E., et al. Merck Ad5/HIV induces broad innate immune activation that predicts CD8(+) T-cell responses but is attenuated by preexisting Ad5 immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3503-3512 (2012).
  4. Paillard, F. Advantages of non-human adenoviruses versus human adenoviruses. Hum. Gene Ther. 8, 2007-2009 (1997).
  5. Ackermann, A., Guelzow, T., Staeheli, P., Schneider, U., Heimrich, B. Visualizing viral dissemination in the mouse nervous system, using a green fluorescent protein-expressing Borna disease virus vector. J. Virol. 84, 5438-5442 (2010).
  6. Bru, T., Salinas, S., Kremer, E. J. An update on canine adenovirus type 2 and its vectors. Viruses. 2, 2134-2153 (2010).
  7. Bouet-Cararo, C., et al. Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunisation of sheep. Vaccine. 29, 1304-1310 (2011).
  8. Soudais, C., Skander, N., Kremer, E. J. Long-term in vivo transduction of neurons throughout the rat CNS using novel helper-dependent CAV-2 vectors. FASEB J. 18, 391-393 (2004).
  9. Deinhardt, K., et al. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52, 293-305 (2006).
  10. Soudais, C., Laplace-Builhe, C., Kissa, K., Kremer, E. J. Preferential transduction of neurons by canine adenovirus vectors and their efficient retrograde transport in vivo. FASEB J. 15, 2283-2285 (2001).
  11. Peltekian, E., Garcia, L., Danos, O. Neurotropism and retrograde axonal transport of a canine adenoviral vector: a tool for targeting key structures undergoing neurodegenerative processes. Mol. Ther. 5, 25-32 (2002).
  12. Chartier, C., et al. Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli. J. Virol. 70, 4805-4810 (1996).
  13. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
  14. Segura, M. M., Puig, M., Monfar, M., Chillon, M. Chromatography purification of canine adenoviral vectors. Human Gene Ther. Methods. 23, 182-197 (2012).
  15. Segura, M. M., et al. A real-time PCR assay for quantification of canine adenoviral vectors. Journal of virological. 163, 129-136 (2010).
  16. Fernandes, P., et al. Bioprocess development for canine adenovirus type 2 vectors. Gene Ther. , (2012).
  17. Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K., Kienitz, M. C., Pott, L. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol. Biol. 515, 107-123 (2009).
  18. Huang, B., Kochanek, S. Adenovirus-mediated silencing of huntingtin expression by shRNA. Hum. Gene Ther. 16, 618-626 (2005).
  19. Tordo, N., et al. Canine adenovirus based rabies vaccines. Dev. Biol. 131, 467-476 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи