Одноклеточный Микроинъекция для анализа сотовой связи

Summary

Здесь мы опишем, как выполнить одноклеточного микроинъекции Lucifer Yellow для визуализации сотовой связи через гэп-переходов в живых клетках, а также обеспечить некоторые полезные советы. Мы ожидаем, что эта статья поможет всем оценить степень сотовой связью за счет функциональных щелевых контактов. Все, что описано здесь, может быть, в принципе, адаптированы к другим флуоресцентных красителей с молекулярной массой менее 1000 дальтон.

Abstract

Щелевые соединения — это межклеточные каналы, которые обеспечивают связь соседних клеток. Эта коммуникация зависит от вклада гемиканала каждой соседней клетки в формирование щелевого соединения. В клетках млекопитающих гемиканал образован шестью коннексинами, мономерами с четырьмя трансмембранными доменами и окончанием C и N в цитоплазме. Щелевые соединения обеспечивают обмен ионами, вторыми мессенджерами и малыми метаболитами. Кроме того, они играют важную роль во многих формах клеточной коммуникации в рамках физиологических процессов, таких как синаптическая передача, сокращение сердца, рост и дифференцировка клеток. Мы подробно описываем, как выполнить микроинъекцию желтого люцифера в одну клетку для визуализации клеточной коммуникации через щелевые соединения в живых клетках. Ожидается, что в функциональных щелевых соединениях краситель будет диффундировать от загруженного элемента к соединенным элементам. Это очень полезный метод для изучения щелевых переходов, поскольку вы можете оценить диффузию флуоресценции в режиме реального времени. Мы обсудим, как подготовить клетки и микропипетку, как использовать микроманипулятор и ввести низкомолекулярный флуоресцентный краситель в эпителиальную клеточную линию.

Introduction

Щелевые соединения являются межклеточные каналы , которые позволяют междуэтажной среди соседних ячеек ^1. Эта связь соединяет два или более соседних ячеек, где каждый из них вносит свой вклад с коннексон или hemichannel, чтобы сформировать межклеточный канал. В клетках млекопитающих коннексон образован шестью коннексинами, мономеров с четырьмя трансмембранными доменами и С и N терминала в цитоплазме ^2. Щелевые контакты не только позволяют поток ионов, вторичных мессенджеров и малых метаболитов, а также способствуют многие формы сотовой связи во многих физиологических процессах, таких как синаптической передачи, сердечных сокращений, роста и дифференцировки ^{3, 4, 5, 6 клеток, 7, 8.} Кроме того щелевые соединения были связаны смногие заболевания , включая рак ^{9, 10, 11} , мышечной атрофии, некоторых генетических заболеваний и демиелинизирующих заболеваний ^12.

Этот тип межклеточного перекрестных помех может быть оценена несколькими способами ^{13, 14, 15, 16.} В этой статье мы покажем, как выполнить одноклеточного микроинъекции Lucifer Yellow для визуализации сотовой связи через гэп-переходов в живых клетках. Мы обсудим, как подготовить клетки и микропипетки, использование микроманипулятора и инъекцию Люцифера желтого красителя в вилочковой эпителиальной клеточной линии. Как правило, эта экспериментальная процедура может быть проанализирована с помощью среднего связанных клеток к клетке, нагруженной красителем. Кроме того, этот способ может быть использован с другими флуоресцентными красителями, с молекулярной массой ниже зазораперекрестки отсечение, который составляет примерно 1000 Дальтон.

Protocol

1. Получение клеток

1. Поддерживать культуру вилочковой эпителиальной клеточной линии (IT76M1) или клетки должны быть испытаны в инкубаторе (37 ° C / 5% CO _2).
2. Вымойте клеток с PBS 1x (повторить этот пункт 3x).
3. Добавить трипсина в клетки в течение 5 мин.
4. Добавить среду (в два раза от объема добавленного трипсина в пункте 1.3) с добавлением 10% FBS (эмбриональной бычьей сыворотки) в клетки с помощью трипсина и центрифугу (800 мкг в течение 5 мин).
5. Граф клеток в гемоцитометра.
6. Регулировка плотности клеток в зависимости от типа клеток, клетки должны быть в тесном контакте друг с другом, чтобы разрешить соединение. Примечание: В нашем случае мы использовали 3 × 10 ⁵ клеток на 35 мм чашку Петри.

2. Подготовка Микропипетки

1. Потяните микропипетки, как указано из стеклянного капилляра микропипетки (диаметром 1,5 мм) до конечной 0,2 мкм в диаметре, с тем, чтобы достичь конечного сопротивления приблизительно 30 МОме "> ^{17, 18.}
   Примечание: В качестве альтернативы, инъекционные пипетки можно приобрести. Сопротивление зависит от размера ячейки, например более высокое сопротивление микроэлектрода было бы необходимо для ацинарных клетках поджелудочной железы, например (100-150 МОм) ^19. Общей проблемой, которая может возникнуть является осаждение Lucifer желтый раствор, который затем может затруднять микропипетки и может потребовать предварительной фильтрации или центрифугирования. Перед инъекцией, микропипетки следует анализировать под микроскопом , чтобы обнаружить , если имеется препятствие или любой тип разрушения ^13. Микропипетки может быть проверена путем введения LY с наконечником микропипетки внутри солевого раствора.

3. Тестирование Микропипетки

1. Готовят раствор желтого цвета Lucifer (5%) в 150 ммоль / л LĪČI и загружают микропипетки с помощью шприца или путем засыпки (положить в нее LY раствор).
2. Поместите микротрубкиТТЕ над 35-мм чашки Петри с клетками IT76M1 на рабочей станции микроинъекции и погрузить кончик стеклянной микропипетки в клеточную среду. Фокус на микропипетки и выполнить тест на красителе, протекающий путем применения пульс.

4. Одноклеточный Lucifer Yellow Микроинъекция

1. Фокус микроскопа прямо над слоем клеток с использованием высокой MAGNI фи катион (40X), затем медленно опустите пипетки к клеткам с помощью микроманипулятора.
2. Прокол клетки-мишени, когда кончик достаточно близко, чтобы коснуться клеточной мембраны, и нанесите небольшое гиперполяризационные импульс, чтобы ввести LY в клетку. Приложенное напряжение будет зависеть от суммарного заряда красителя, который будет введен. В качестве альтернативы, некоторые другие красители, могут быть использованы с этой техникой, как показано в таблице 1.
   Примечание: В принципе любой гидрофильным красителем с MW менее 1KDa можно было бы использовать. Тем не менее, скорость передачи может варьироваться в зависимости от веса и гидрофильности. Кроме того, Unspecific перенос красителя, используемого должны быть оценены.
3. Захват изображений клеток 3 мин после инъекции красителя или сделать небольшой ролик со временем покадровой микроскопии (30 кадров в секунду).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогичный подход можно увидеть в Хитоми и др (2015) ^20. Для того, чтобы избежать общения с помощью межклеточных мостиков (неполным митоза), со-инъекции родамина декстрана (от 2 до 10 кДа), которая не проходит через щелевые контакты , но проходит через межклеточные мосты и некоторые виды нанотрубок рекомендуется , как показано на рисунке 2 ,

Results

Тимуса эпителиальные клетки линии IT-76MI были использованы для оценки сцепления красителя щелевых контактов , как эти клетки были описаны , чтобы выразить функциональные щелевые соединения , образованные коннексина 43 ^21. На рисунке 1 показана инъекцию Lucifer Yellow при нанесении в одной ячейке ниже кончика пипетки. Через несколько минут, соединенные клетки становятся флуоресцентный (звездочками) указывает на диффузию флуоресцентного красителя через щелевые конт...

Discussion

Для того чтобы проверить наличие функциональной межклеточного щелевых контактов, использование изотопных индикаторов, которые мембрана непроницаема, хотя проницаемой межклеточные каналы необходимы ^16. Флуоресцеин, первый флуоресцентный краситель для наблюдения от клетки к клетке соединительной ^22, проницаема между не соединительных мембран ³ и поэтому был замещен Lucifer желтый краситель ^15. В настоящее время, чтобы найти луч...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Люцифер желтый	Sigma	L0259
Хлорид лития	Sigma	L4408
PBS таблетки	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Сыворотка плода крупного рогатого скота	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
стол с виброизоляцией	Newport	VH3036W-OPT	Для защиты экспериментов от вибрации и предотвращения повреждения клеток необходим виброизолированный стол
Микроманипулятор	Narishige	MMO-203	Это оборудование позволяет точно регулировать микропипетку, которая необходима для микроинъекции клеток.
Генератор тока	Дигитимер	DS2	Для создания потока красителя через микропипетку подавался ток ниже одного наноампера с помощью генератора тока с электродом внутри микропипетки или усилителя, который имеет схему компенсации емкости (старый электрометр) или функции впрыска тока новых усилителей с патч-клемтом, а также провод заземления, погруженный в пластинчатую чашку. В качестве альтернативы краситель может быть введен пневматическим микроинжектором, следуя заводским рекомендациям.