Методическая статья

В естественных перепрограммирования взрослых соматических клеток в плюрипотентности сверхэкспрессией Яманака факторов

15K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50837

⸱

17 декабря 2013 г.

 ,  ,  , 
1Nanomedicine Lab, UCL School of Pharmacy, University College London, 2Nanomedicine Lab, Faculty of Medical & Human Sciences, University of Manchester

В этой статье

Краткое содержание

Это исследование демонстрирует перепрограммирование соматических клеток в сторону плюрипотентности in vivo без генерации тератом. С помощью гидродинамической инъекции плазмидной ДНК в хвостовую вену, кодирующей факторы Яманки, мы индуцировали in vivo перепрограммирование взрослых гепатоцитов в клетки с повышенной плюрипотентностью.

Аннотация

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS), которые являются результатом перепрограммирования соматических клеток в плюрипотентное состояние путем принудительной экспрессии определенных факторов, открывают новые возможности для регенеративной медицины. Такое клиническое применение iPS-клеток до сих пор было ограничено, в основном из-за низкой эффективности существующих методологий перепрограммирования и риска образования опухолей при имплантации из сгенерированных iPS-клеток.

Мы предположили, что перепрограммирование соматических клеток в сторону плюрипотентности может быть достигнуто in vivo путем переноса генов перепрограммирующих факторов. Для эффективного перепрограммирования клеток in vivo необходимо экспрессировать высокие уровни транскрипционных факторов Яманаки (OKSM) в ткани-мишени. Это может быть достигнуто за счет использования различных вирусных или невирусных генных векторов в зависимости от ткани-мишени. В этом конкретном исследовании гидродинамическая инъекция плазмидной ДНК в хвостовую вену (HTV) использовалась для доставки факторов OKSM в гепатоциты мышей. Это обеспечило доказательство перепрограммирования in vivo взрослых соматических клеток в плюрипотентное состояние с высокой эффективностью и быстрой кинетикой. Кроме того, не наблюдалось образования опухолей или тератом in situ.

Можно сделать вывод, что перепрограммирование соматических клеток in vivo может предложить потенциальный подход к быстрому, эффективному и безопасному стимулированию повышенной плюрипотентности по сравнению с протоколами, выполненными in vitro, и может быть применено к различным типам тканей в будущем.

Введение

Этические проблемы использования эмбриональных стволовых клеток были одним из ограничений в развитии исследований стволовых клеток. Тем не менее, открытие Яманаки и его коллег о том, что принудительная экспрессия четырех факторов транскрипции (а именно: Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (OKSM)) может привести к перепрограммированию in vitro соматических клеток в плюрипотентные клетки, называемые индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (iPS), открыло новые возможности. Перенос вирусныхгенов 1-5 иневирусных 6-10, белковая цитоплазматическая транслокация11,12 и трансфекция микроРНК13-16 относятся к различным методам, используемым сегодня для создания iPS-клеток. Тем не менее, такие методологии перепрограммирования страдают от различных проблем, которые ограничивают их применение в клинике, таких как: а) серьезные ограничения в эффективности перепрограммирования клеток; б) преимущественное использование вирусных векторов; в) длительные и многоступенчатые протоколы условий культивирования; и г) риск онкогенности при имплантации iPS-клеток, генерируемых in vitro 17-20.

Перенос генов определенных факторов транскрипции3-5 ретровирусами является наиболее часто используемым методом перепрограммирования соматических клеток. Тем не менее, он содержит риски, связанные с возможностью инсерционного мутагенеза, стабильной трансдукции и длительной экспрессии протоонкогенов21,22. Также были изучены невирусные векторы переноса генов, такие как плазмидная ДНК6,7,23 или доставка РНК10 с помощью липосом или электропорации. Несмотря на то, что эти векторы безопаснее по сравнению с вирусами, они обеспечивают значительно ограниченную эффективность трансдукции и перепрограммирования

.

Одна из центральных догм этой новой области заключается в том, что имплантация iPS-клеток in vivo приведет к их неконтролируемой дифференцировке и образованию опухолеподобной массы (тератомы), состоящей из различных тканей из трех различных зародышевых слоев. Таким образом, концепция перепрограммирования на плюрипотентность была в первую очередь сосредоточена на манипуляциях in vitro с первичными извлеченными соматическими клетками (чаще всего фибробластами). Однако, как описано выше, этот принцип страдает от длительных и сложных протоколов культивирования клеток, включая многократные раунды лечения (перенос генов, факторы роста, антибиотики, антиоксиданты), которые сами по себе могут увеличивать риск образования тератомы или других форм онкогенеза после имплантации клеток.

Мы предполагаем, что перепрограммирование взрослых соматических клеток in vivo путем временной сверхэкспрессии транскрипционных факторов OKSM не приводит к последующему образованию тератомы29. Метод достижения этой цели будет зависеть от достижения высокого уровня экспрессии транскрипционного фактора в целевой ткани наиболее безопасным способом. В этом исследовании мы выбрали признанную технологию переноса генов без вирусов, которая, как было показано, эффективно воздействует на печень с целью перепрограммирования клеток на плюрипотентность in vivo. Эта технология включает в себя быстрое гидродинамическое введение плазмидной ДНК30,31 в хвостовую вену большого объема (HTV). Высокие уровни экспрессии трансфицированных генов могут быть достигнуты во взрослых гепатоцитах с помощью этого метода переноса невирусных генов. Кроме того, эта технология сводит к минимуму потенциальные риски, связанные с использованием вирусных векторов (например, постоянная геномная вставка, инсерционный мутагенез).

Протокол

1. Перепрограммирование ткани печени in vivo путем HTV введения пДНК

  1. Дайте самкам мышей Balb/C в возрасте 6 недель акклиматизироваться в помещении для животных в течение недели перед проведением любой процедуры.
  2. Приготовьте 0,9% физиологический раствор в дистиллированной воде и профильтруйте через микрофильтр 0,22 мкм.
  3. Приготовьте раствор с 75 мкг pCX-OKS-2A и 75 мкг плазмидной ДНК pCX-cMyc в 1,5 мл 0,9% физиологического раствора на каждую мышь. заметка: Общий объем инъекции должен составлять от 8 до 10% от общей массы тела><. Примечание: перед инъекцией держите мышей в нагревательной камере при температуре 37 °C до тех пор, пока хвостовые вены не станут легко визуализированы и не будут казаться расширенными.
  4. Вводите анестезию изофлураном до (в нагревательной камере) и во время инъекции (с помощью анестезирующей маски).
  5. Введите раствор пДНК или физиологический раствор с помощью шприца 27 G путем инъекции HTV. Примечание: для того, чтобы трансфекция прошла успешно, общий объем должен быть введен не более чем за 5-7 секунд.
  6. Следите за тем, чтобы животные правильно восстановились после инъекции.

2. Перфузия печени и выделение первичных гептоцитов для исследований qRT-PCR

  1. В разные сроки, включая 2, 4, 8, 12 и 24 дня после инъекции HTV, индуцируйте глубокую анестезию изофлураном.
  2. Распылите 70% этанол на живот животного, сделайте разрез через кожу на вентральной средней линии хирургическими ножницами и рассеките слой мышц живота, чтобы обнажить внутренние органы.
  3. Разрежьте диафрагму, чтобы обнажить грудную полость ножницами и зажмите кавальную вену блокирующими щипцами.
  4. Сместите внутренности вправо и доли печени так, чтобы нижняя полость и воротная вена были легко доступны.
  5. Канюлеируйте нижнюю полую вену с помощью катетера 22 G и разрежьте воротную вену, чтобы избежать избыточного давления.
  6. Начните перфузию с 10 мл буфера HBSS (Ca2+ и Mg2+ free, с бикарбонатом), предварительно подогретого до 37 °C. Медленно конфузируйте буфер с помощью шприца объемом 10 мл, пока печень не отбелеет (3 мин).
  7. Продолжайте перфузию с помощью Liver Digest Medium, предварительно подогретой до 37 °C, со скоростью потока 0,6 мл/мин (в течение 15 минут) до тех пор, пока печень не станет набухшей и рыхлой. заметка: Чрезмерное пищеварение и перфузия могут повредить гепатоциты или перепрограммированные клетки.
  8. Продолжайте эксперимент при температуре 4 °C.
  9. После разрезания серповидной и коронарной связок удалите печень щипцами и промойте ее средством для промывки гепатоцитов, пропуская при этом через клеточное сетчатое фильтр размером 100 мкм для получения клеточной суспензии.
  10. Соберите клеточную суспензию в пробирки по 50 мл и отрегулируйте объем до 15 мл с помощью средства для промывки гепатоцитов.
  11. Центрифугируйте клеточную суспензию при плотности 50 г в течение 4 мин. Поддерживайте температуру на уровне 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость (которая содержит клетки Купфера и эпителия) и повторно суспендируйте клеточную гранулу (содержащую гепатоциты) в 10 мл промывочной среды для гепатоцитов. заметка: Клеточную гранулу следует ресуспендировать очень осторожно, гепатоциты – очень хрупкие клетки.
  12. Повторите процедуру центрифугирования в общей сложности три раза и повторно суспендируйте окончательную гранулу в 10 мл промывочной среды для гепатоцитов.
  13. Оцените количество клеток с помощью оптического микроскопа и гемоцитометра.
  14. Приготовьте аликвоты 2 х 106 клеток, центрифугируйте при 300 х г для восстановления всех клеток и выбросьте надосадочную жидкость.
  15. На этом этапе клеточную гранулу можно заморозить и хранить при температуре -20 °C до дальнейшей обработки или сразу использовать для экстракции РНК.

3. Исследование экспрессии генов выделенных гепатоцитов для повышения регуляции плюрипотентных генов

  1. Извлеките РНК из 2 x 106 клеток с помощью набора спин-колонок, следуя инструкциям поставщика.
  2. Используйте 1 г экстрагированной РНК для проведения двухэтапной qRT-PCR в соответствии с инструкциями поставщика.
  3. Используйте гепатоциты животных, которым вводили физиологический раствор, в качестве контроля для коррекции относительной экспрессии генов перепрограммирования, плюрипотентности и маркеров гепатоцитов.

4. Анализ проточной цитометрии повышенной плюрипотентности на уровне белка

  1. На 1 и 4 день после инъекции проводят перфузию печени и выделяют первичные гепатоциты, как указано выше.
  2. Отрегулируйте плотность клеток до 1 x 107 клеток/мл и приготовьте 100 мкл аликвот.
  3. Зафиксируйте клетки с помощью фиксирующего буфера BD Cytofix и проникните с помощью 1x буфера BD Perm/Wash.
  4. Инкубируйте клетки с помощью антимышиного OCT4-PerCP-Cy5.5 или антимышиного Nanog-PE в течение 30 минут.
  5. Включите контроль отрицательного и изотипа.
  6. Анализируйте окрашенные клетки с помощью высокопроизводительного исследовательского проточного цитометра CyAn ADP.

5. Иммуноокрашивание участков печени на маркеры плюрипотентности

  1. Через четыре дня после инъекции перфузируйте печень, как указано выше, но только с буфером HBSS, чтобы удалить кровь из ткани печени.
  2. Разрежьте кусочек ткани печени и погрузите его в 2-метилбутан (предварительно охлажденный в жидком азоте) для того, чтобы продолжить криосекцию.
  3. Замороженные ткани можно хранить при температуре -80 °C или непосредственно разрезать на участки толщиной 14 мкм с помощью криостата.
  4. Срезы тканей высушить на воздухе в течение 1 часа при комнатной температуре и предварительно зафиксировать метанолом, предварительно охлажденным при -20 °C в течение 10 мин. Высушить на воздухе в течение 15 мин, а затем дважды промыть срезы PBS (по 5 мин каждая).
  5. Срезы инкубируют в блокирующем буфере (5% козьей сыворотки-0,1% Тритона в PBS pH 7,3) при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего следует два этапа промывки промывочным буфером (1% BSA-0,1% Triton в PBS, pH 7,3).
  6. Инкубируйте срезы тканей в течение ночи при 4 °C первичными антителами против OCT4, анти-SOX2 и анти-Nanog.
  7. На следующий день промойте срезы 3 раза (по 5 мин) промывочным буфером и инкубируйте их в течение 1,5 ч при комнатной температуре с вторичным антителом.
  8. Промыть срезы печени PBS (3x по 5 мин) и установить их в DAPI и среду, содержащую антифейд.
  9. Визуализируйте слайды под эпифлуоресцентным микроскопом.

6. Окрашивание срезов ткани печени щелочной фосфатазой (ЩФ)

  1. Получите срезы ткани печени, как описано ранее.
  2. Прогрейте срезы ткани при комнатной температуре в течение 15 минут перед выполнением окрашивания.
  3. Закрепить 4% параформальдегидом в течение 2 мин. Примечание: чрезмерное время фиксации может снизить активность ЩФ.
  4. Секции высушить на воздухе в течение 30 минут, а затем инкубировать с жидким субстратом BCIP/NBT при температуре 37 °C в течение 30 минут.
  5. Промойте слайды дистиллированной водой и закрепите их водным монтажным материалом.
  6. Захватывайте случайные изображения с помощью световой микроскопии.

7. Количественная оценка уровня альбумина и ферментов печени в сыворотке крови для оценки токсичности для печени

  1. На 4, 8, 12 и 120 день после трансфекции соберите 300 мкл крови непосредственно из желудочка сердца.
  2. Держите кровь на льду во время сбора различных образцов, чтобы избежать свертывания.
  3. Когда все образцы будут готовы, инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C до образования тромбов.
  4. Центрифугируйте образцы при давлении 2 000 x g в течение 5 минут.
  5. Осторожно пипеткой ввели сыворотку (в надосадочную жидкость) в новую пробирку Eppendorf и заморозили при -80 °C до обработки образцов.
  6. Анализируйте уровень альбумина в сыворотке крови, АЛТ, АСТ, ЩФ и ГЛДГ.

8. Гематоксилин и эозин (H&E) и периодическое кислотное окрашивание срезов печени (PAS) для оценки токсичности печени

  1. В разные сроки, в том числе через 2, 4, 8, 12, 24, 50 и 120 дней после инъекции HTV, выполняйте перфузию печени с помощью буфера HBSS только так, как описано ранее.
  2. Отрежьте кусочек печеночной ткани и зафиксируйте в 4% параформальдегиде.
  3. Поместите ткань печени в парафиновые блоки, разрежьте и окрашивайте с помощью окрашивания H&E или PAS.
  4. Захватывайте случайные изображения с помощью световой микроскопии.

Результаты

Рисунок 1 демонстрирует обзор процедуры, включающей перенос плазмид, кодирующих OKSM, в печень мышей, и различные методы, использованные для наблюдения за перепрограммированием клеток in vivo. После введения плазмид методом HTV на 2-й день после инъекции наблюдалось значительное повышение экспрессии трансфицированных факторов перепрограммирования (Oct3/4, Sox2, Klf4 и cMyc) на уровне мРНК. Экспрессия этих факторов со временем после инъекции снижается, что показано на Рисунке 2a. Что касается экспрессии эндогенных маркеров плюрипотентности (Nanog, Ecat1 и Rex1), их уровни были значительно повышены по сравнению с уровнями в гепатоцитах животных, которым вводили физиологический раствор, на 2-й и 4-й дни после инъекции, и вернулись к исходным значениям начиная с 8-го дня (Рисунок 2b). В то же время дедифференцировка популяции гепатоцитов была подтверждена снижением экспрессии специфических для гепатоцитов генов (Alb, Aat и Trf), которое было статистически значимым на 4-й день и достигло исходных уровней с 8-го дня (Рисунок 2d).

Экспрессия Oct3/4 и Nanog на белковом уровне была исследована с помощью проточной цитометрии. Как показано на Рисунке 2c, на 1-й день после инъекции HTV экспрессируется только Oct3/4, тогда как для экспрессии эндогенного маркера плюрипотентности Nanog необходимо было подождать до 4-го дня.

Наличие перепрограммирования клеток in vivo было дополнительно подтверждено иммуногистохимическим анализом тканей печени с использованием антител к OCT4, SOX2 и Nanog, а также специфическим окрашиванием на активность ALP. Положительные клетки по всем маркерам и ферментативной активности воспроизводимо обнаруживаются в тканях печени животных, которым вводили OKSM, но не в контрольной группе, получавшей физиологический раствор (Рисунок 3).

Возможные токсические побочные эффекты и образование тератом при перепрограммировании клеток in vivo путем инъекции пДНК с помощью HTV изучали путем количественного определения уровней печеночных ферментов в сыворотке крови, а также окрашивания срезов тканей печени гематоксилином и эозином (H&E) и PAS-реакцией в течение 120 дней. До 2-го дня наблюдались кратковременные и незначительные признаки повреждения тканей, которые затем исчезли. В течение периода исследования не было обнаружено образования тератом, признаков дисплазии или морфологических изменений (Рисунок 4). У всех животных на протяжении всего исследования отсутствовали структурные или функциональные нарушения печени, что подтверждается уровнями альбумина и печеночных ферментов, а также окрашиванием срезов тканей на гликоген (Рисунки 4b и c).

Инъекция факторов репрограммирования in vivo, схема мыши, плазмида, анализ тканей, ПЦР, цитометрия.
Рисунок 1. Схематический обзор процедуры репрограммирования in vivo и её анализа. Протокол включает два основных этапа: (i) введение факторов репрограммирования in vivo и (ii) извлечение тканей и анализ образцов. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенное изображение.

Анализ экспрессии генов; столбчатые диаграммы с данными относительной экспрессии по дням; рисунки a-d; научные результаты.
Рисунок 2. In vivo гиперэкспрессия транскрипционных факторов Яманаки в печени взрослых мышей. Мышам линии Balb/C посредством гидродинамического переноса (HTV) вводили только 0,9% физиологический раствор, либо 75 μg pCX-OKS-2A и 75 μg pCX-cMyc в 0,9% физиологическом растворе; на 2, 4, 8, 12 и 24-й дни проводили RT-qPCR анализ гепатоцитов для определения относительной экспрессии следующих генов: (a) трансфецированных транскрипционных факторов (OKSM) и (b) эндогенных маркеров плюрипотентности; (c) анализ методом проточной цитометрии OCT3/4-положительных и Nanog-положительных клеток; (d) относительная экспрессия маркеров гепатоцитов, определенная с помощью RT-qPCR. Все уровни экспрессии генов были нормализованы относительно группы, получившей HTV-введение физиологического раствора. (* p<0.05 указывает на статистически значимое различие по сравнению с группами HTV-введения физиологического раствора, полученное с помощью дисперсионного анализа и попарного сравнения Тьюки). Рисунок адаптирован из работы Yilmazer et al.29 Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенный рисунок.

Сравнение иммунофлуоресцентной микроскопии OCT4, SOX2, NANOG в клетках, обработанных физиологическим раствором и OKSM.
Рисунок 3. In vivo перепрограммирование клеток в ткани печени взрослых мышей, определенное методом иммуногистохимии. Мышам линии Balb/C путем гидродинамического введения (HTV) вводили только 0.9% физиологический раствор, либо 75 μg pCX-OKS-2A и 75 μg pCX-cMyc в 0.9% физиологическом растворе. На 4-й день печень была извлечена, и замороженные срезы тканей окрашивали антителами к OCT4, SOX2 или Nanog для оценки иммунореактивности, либо использовали BCIP/NBT для определения активности ALP в ткани (40X). Масштабные отрезки соответствуют 100 μm. Рисунок адаптирован из работы Yilmazer et al.29 Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Гистология печени, уровни ферментов и альбумина при введении физиологического раствора в сравнении с лечением OKSM, результаты эксперимента.
Рисунок 4. Влияние перепрограммирования клеток in vivo на функциональное состояние и гистопатологию печени. Мышам линии Balb/C путем гидродинамического введения в хвост (HTV) вводили либо 75 μg pCX-OKS-2A и 75 μg pCX-cMyc в 0,9% физиологическом растворе, либо только 0,9% физиологический раствор. На 2, 4, 8, 12, 50 и 120 дни проводили забор тканей печени и сыворотки крови для последующего анализа: (a) окрашивание гематоксилином и эозином (H&E); (b) определение уровней печеночных ферментов; (c) определение уровней альбумина; (d) окрашивание PAS-реакцией. Репрезентативные изображения получены с помощью световой микроскопии (10X). Масштабные отрезки соответствуют 100 μm. Рисунок адаптирован из работы Yilmazer et al.29 Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенное изображение.

Обсуждение

Это исследование предоставляет доказательство принципа перепрограммирования клеток in vivo в сторону плюрипотентности после эффективного переноса и сверхэкспрессии факторов OKSM в печень взрослой мыши. С помощью различных методов, таких как qRT-PCR, проточная цитометрия, анализ ИГХ или сыворотки, была исследована ткань-мишень для наблюдения за перепрограммированием клеток in vivo. Очень быстро после индукции сверхэкспрессии фактора OKSM в тканях маркеры плюрипотентности повышались на уровнях мРНК и белка (в течение 48 часов). В ходе этих экспериментов было показано, что от 5 до 15% клеток, извлеченных из ткани, являются Nanog и Oct3/4 положительными. Кроме того, в течение 120 дней в печени не наблюдалось никаких структурных или функциональных аномалий. Ранее сообщалось об экспрессии трансгенов путем инъекции плазмидной ДНК HTV в тканях, отличных от печени (легких, селезенке, почках и сердце), однако уровни экспрессии генов были, по крайней мере, на 3 порядка ниже, чем в гепатоцитах30. Данные этого исследования указывают на то, что перепрограммирование соматических клеток в плюрипотентное состояние in vivo является безопасным, быстрым и эффективным. В связи с тем, что большинство существующих методик перепрограммирования клеток in vitro, которые обычно достигают образования плюрипотентных (iPS) клеток в течение 3 недель с эффективностью менее 1%32, перепрограммирование in vivo на плюрипотентность может предложить очень интересные альтернативы. Мы предполагаем, что концепция перепрограммирования in vivo на плюрипотентность может быть применена к различным типам соматических клеток с высокой эффективностью (в зависимости от используемого вектора), однако необходимо будет определить уровень функциональной плюрипотентности, достигнутый в перепрограммированных клетках in vivo. Более того, с развитием усовершенствованных протоколов и технологий, перепрограммированные клетки in vivo потенциально могут быть извлечены и использованы в целях регенеративной медицины.

Есть несколько важных шагов, которые необходимо выполнить, чтобы перепрограммировать взрослые соматические клетки in vivo с высокой эффективностью. Достижение высокого уровня экспрессии генов в целевой ткани является необходимым условием. В данном исследовании это было проиллюстрировано использованием эффективного переноса и экспрессии плазмидной ДНК в гепатоциты с помощью инъекции HTV. Наиболее важными факторами для инъекции HTV являются объем, который должен составлять 8-10% от общей массы тела животного, и скорость инъекции, которая должна быть выполнена в течение 5-7 секунд. Мышей младше 6 недель не следует использовать, так как инъекция HTV может вызвать большее повреждение тканей печени, что может повлиять на эффективность клеточного перепрограммирования. Генетический фон животных не оказывал влияния на определение эффективности перепрограммирования in vivo , поскольку ранее мы сообщали об аналогичных уровнях перепрограммирования у мышей Balb/C и TNG-A, причем последний является трансгенным штаммом, несущим репортер eGFP , вставленный в локус Nanog , и выведенный на фоне Sv12929.

Мы предполагаем, что перепрограммирование клеток in vivo в плюрипотентное состояние (которое необходимо определить) может быть применено к другим типам тканей при условии, что факторы OKSM эффективно доставляются к клеткам-мишеням, обеспечивая высокий уровень экспрессии генов. В доклинических и клинических испытаниях были изучены различные невирусные и вирусные векторы доставки генов, нацеленные на различные типы клеток и тканей33. Например, для нервной или глазной тканей аденоассоциированные вирусы были предпочтительным выбором вектора для эффективного переноса генов in vivo 34-37, в то время как в мышечных тканях инъекции голой плазмидной ДНК приводили к относительно высоким уровням экспрессии генов38,39. Поэтому метод вектора переноса генов должен быть тщательно подобран в зависимости от типа ткани, чтобы добиться эффективного и быстрого перепрограммирования клеток in vivo в сторону плюрипотентного состояния.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Советом по исследованиям в области инженерных и физических наук (EPSRC, Суиндон, Великобритания) и программами FP-7 Европейской комиссии NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) и ANTICARB (HEALTH-2008-20157). AY был поддержан стипендией для аспирантов на полный рабочий день от Министерства образования (Турция), а IL выражает частичную поддержку от Британского Совета и Фонда CAIXA (Испания). Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
pCX-OKS-2A пДНКAddgene19771Получен из Addgene в виде бактериального стаба, производство плазмид выполнено на фабрике плазмид (Германия)
pCX-cMycAddgene19772Получено из Addgene в виде бактериального стаба, производство плазмид выполнено на фабрике плазмид (Германия)
0,22 μ m фильтрMillioporeSLGP033RS
IsofluraneAbbottB505
HBSS bufferSigma-AldrichH6648Ca2+ и Mg2+ свободный, с бикарбонатом
Liver Digest MediumGibco17703-034
Hepatocyte Wash MediumGibco17704-024
100 & мю; m клеточный фильтрBD Biosciences352360
Набор Nucleospin RNA II kitMacherey-Nagel740955.25Набор для выделения РНК из клеток и тканей
iScript набор для синтеза кДНКBio-Rad170-8890
iO SYBR Green SupermixBio-Rad170-8880
Oct3/4 прямой праймерSigmaпоследовательность приведена в комментарияхTGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA
Oct3/4 обратный праймерСигмапоследовательность приведена в комментарияхCTCAATGCTAGTTCGCTCTCTTC
Sox2 прямой праймерСигмапоследовательность приведена в комментарияхGGTTACCTCTTCCCCCCCCAG
Sox2 обратный праймерСигмапоследовательность приведена в комментарияхTCACATGTGCGACAGGGGCAG
C-myc прямой праймерСигмапоследовательность приведена в комментарияхCAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC
C-myc обратный праймерSigmasequence приведен в комментарияхTTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG
Nanog forward primer Sigmasequence приведен в комментарияхCAGAAAAAACCAGTGGTTGAAGACTAG
Nanog обратный праймер Sigmasequence приведен в комментарияхGCAATGGATGCTGGGATACTC
Ecat1 forward primerSigmasequence приведено в комментарияхTGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGATAT
Ecat1 обратный праймерSigmaпоследовательность приведена в комментарияхATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT
Rex1 форвард праймерSigmaпоследовательность приведена в комментарияхACGAGTGGCAGTTTTTCTTCTTGGGA
Rex1 обратный праймерSigmaпоследовательность приведена в комментарияхTATGACTCACTTCCAGGGGGCACT
Alb форвард праймерSigmaпоследовательность приведена в комментарияхGTTCGCTACACCCAGAAAGC
Alb обратный праймерSigmaпоследовательность приведена в комментарияхCCACACAAGGCAGTCTCTGA
Aat форвард праймерSigmaпоследовательность приведена в комментарияхCAGAGGAGGCCAAGAAAGTG
Aat обратный праймерSigmaпоследовательность приведена в комментарияхATGGACAGTCTGGGGAAGTG
Trf форвард праймерSigmaпоследовательность приведена в комментарияхACCATGTTGTGGTCTCACGA
Trf обратный праймерСигмапоследовательность приведена в комментарияхACAGAAGGTCCTTGGTGGTG
B актин прямой праймерСигмапоследовательность приведена в комментарияхGACCTCTATGCCAACACAGT
B актин обратный праймерСигмапоследовательность приведена в комментарияхAGTACTTGCGCTCAGGAGGA
BD Цитофикс фиксирующий буферBD Biosciences
1x BD Perm/Wash bufferBD Biosciences560585
антимышиный OCT4-PerCP-Cy5.5BD Biosciences560585
антимышиный Nanog-PEBD Biosciences560585
2-метилбутанSigma-AldrichM32631
X100-TritonSigma-AldrichX100-500ML
Козья сывороткаSigma-AldrichG9023
BSASigmaA2153
кролик pAb анти-OCT4Abcamab19857Применение в концентрации 3 μ г/мл
кролика pAb anti-SOX2Abcamab97959Использовать в концентрации 1 мкм; г/мл
кролика pAb anti-NanogAbcamab80892Использовать в концентрации 1 мкм; г/мл
мышь mAb anti-SSEA1Abcamab16285Использовать в концентрации 20 мкм; г/мл
козий pAb антикроличий IgG помечен Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-165-003-JIRИспользуйте в концентрации 1/250
козьего pAb антимышиного IgG, меченного Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-165-003-JIRИспользуйте в концентрации 1/250
VECTASHIELD монтажный материал с DAPIVector LaboratoriesH-1200
BCIP/NBT жидкая подложкаSigmaB1911
Водный монтажный материалSigma
16% параформальдегидFisherAA433689MСтоковый раствор составляет 16%, используйте его при 4%
гематоксилине и эозинSigmaGH53/HT110216
PAS окрашиваниеSigma395B
560585

Ссылки

  1. Blelloch, R., Venere, M., Yen, J., Ramalho-Santos, M. Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells In The Absence Of Drug Selection. Cell Stem Cell. 1, 245-247 (2007).
  2. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
  3. Takahashi, K., et al. Induction Of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblasts By Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction Of Pluripotent Stem Cells From Mouse Embryonic And Adult Fibroblast Cultures By Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  5. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived From Human Somatic Cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  6. Gonzalez, F., et al. Generation Of Mouse-Induced Pluripotent Stem Cells By Transient Expression Of A Single Nonviral Polycistronic Vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 8918-8922 (2009).
  7. Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation Of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
  8. Woltjen, K., et al. Piggybac Transposition Reprograms Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  9. Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation Of Transgene-Free Induced Pluripotent Mouse Stem Cells By The Piggybac Transposon. Nat. Meth. 6, 363-369 (2009).
  10. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming To Pluripotency And Directed Differentiation Of Human Cells With Synthetic Modified Mrna. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  11. Kim, D., et al. Generation Of Human Induced Pluripotent Stem Cells By Direct Delivery Of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  12. Zhou, H., et al. Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins. Cell Stem Cell. 4, 381-384 (2009).
  13. Anokye-Danso, F., et al. Highly Efficient Mirna-Mediated Reprogramming Of Mouse And Human Somatic Cells To Pluripotency. Cell Stem Cell. 8, 376-388 (2011).
  14. Lin, S. -L., et al. Regulation Of Somatic Cell Reprogramming Through Inducible Mir-302 Expression. Nucleic Acids Res. , (2011).
  15. Miyoshi, N., et al. Reprogramming Of Mouse And Human Cells To Pluripotency Using Mature Micrornas. Cell Stem Cell. 8, 633-638 (2011).
  16. Subramanyam, D., et al. Multiple Targets Of Mir-302 And Mir-372 Promote Reprogramming Of Human Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells. Nat. Biotechnol. 29, 443-448 (2011).
  17. Dolgin, E. Flaw In Induced-Stem-Cell Model. Nature. 470, 13 (2011).
  18. Miura, K., et al. Variation In The Safety Of Induced Pluripotent Stem Cell Lines. Nat. Biotech. 27, 743-745 (2009).
  19. Pera, M. The Dark Side Of Pluripotency. Nature. 471, 46-47 (2011).
  20. Saha, K., Jaenisch, R. Technical Challenges In Using Human Induced Pluripotent Stem Cells To Model Disease. Cell Stem Cell. 5, 584-595 (2009).
  21. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation Of Germline-Competent Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
  22. Varas, F., et al. Fibroblast-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Show No Common Retroviral Vector Insertions. Stem Cells. 27, 300-306 (2009).
  23. Jia, F., et al. A Nonviral Minicircle Vector For Deriving Human Ips Cells. Nat. Meth. 7, 197-199 (2010).
  24. Gonzalez, F., Boue, S., Belmonte, J. C. I. Methods For Making Induced Pluripotent Stem Cells: Reprogramming A La. Nat. Rev. Genet. 12, 231-242 (2011).
  25. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced Pluripotency: History, Mechanisms, And Applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2011).
  26. Gore, A., et al. Somatic Coding Mutations In Human Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 471, 63-67 (2011).
  27. Hussein, S. M., et al. Copy Number Variation And Selection During Reprogramming To Pluripotency. Nature. 471, 58-62 (2011).
  28. Lister, R., et al. Hotspots Of Aberrant Epigenomic Reprogramming In Human Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 471, 68-73 (2011).
  29. Yilmazer, A., De Lázaro, I., Bussy, C., Kostarelos, K. In Vivo Cell Reprogramming Towards Pluripotency By Virus-Free Overexpression Of Defined Factors. Plos One. 8, (2013).
  30. Liu, F., Song, Y. K., Liu, D. Hydrodynamics-Based Transfection In Animals By Systemic Administration Of Plasmid Dna. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  31. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High Levels Of Foreign Gene Expression In Hepatocytes After Tail Vein Injections Of Naked Plasmid Dna. Hum. Gene. Ther. 10, 1735-1737 (1999).
  32. Yamanaka, S. Induced Pluripotent Stem Cells: Past, Present, And Future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
  33. Therapy Giacca, M. G. ene , Springer. (2010).
  34. Colella, P., Auricchio, A. Aav-Mediated Gene Supply For Treatment Of Degenerative And Neovascular Retinal Diseases. Curr. Gene Ther. 10, 371-380 (2010).
  35. Dayton, R. D., Wang, D. B., Klein, R. L. The Advent Of Aav9 Expands Applications For Brain And Spinal Cord Gene Delivery. Expert Opin. Biol. Ther. 12, 757-766 (2012).
  36. Mccown, T. J. Adeno-Associated Virus (Aav) Vectors In The Cns. Curr. Gene Ther. 11, 181-188 (2011).
  37. Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel Adeno-Associated Viral Vectors For Retinal Gene Therapy. Gene Ther. 19, 162-168 (2012).
  38. Herweijer, H., Wolff, J. A. Progress And Prospects: Naked Dna Gene Transfer And Therapy. Gene Ther. 10, 453-458 (2003).
  39. Wolff, J. A., Budker, V. The Mechanism Of Naked Dna Uptake And Expression. Adv. Genet. 54, 3-20 (2005).

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Индукция плюрипотентностигидродинамическое введение через хвостовую венувыделение первичных гепатоцитованализ методом проточной цитометриианализ экспрессии генов методом количественной ОТ-ПЦРиммуногистохимическое окрашиваниеприготовление срезов тканей печениоценка образования тератомы
В естественных перепрограммирования взрослых соматических клеток в плюрипотентности сверхэкспрессией Яманака факторов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.