Методическая статья

Анализируя Динамика белков с использованием водорода валютный масс-спектрометрии

DOI:

10.3791/50839

⸱

29 ноября 2013 г.

 , 
1Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg (ZMBH), University of Heidelberg

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конформации белка и динамика являются ключевыми для понимания взаимосвязи между структурой и функции белка. Обмен водорода в сочетании с масс-спектрометрии высокого разрешения является универсальным методом для изучения конформационной динамики белков, а также характеризующие белок-лиганд и белок-белковых взаимодействий, в том числе контактных интерфейсов и аллостерических эффектов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все клеточные процессы зависят от функциональности белков. Хотя функциональность данного белка является прямым следствием его уникальной аминокислотной последовательности, он реализуется только по сворачивания полипептидной цепи в единую определенную трехмерную договоренности или чаще в ансамбль взаимопревращени конформации. Исследуя связь между конформации белка и его функции Поэтому для полного понимания того, как белки в состоянии выполнить их большое разнообразие задач. Одной из возможностей для изучения конформационных изменений белка претерпевает в то время как прогрессирует через его функционального цикла представляет собой водород-1Н / 2 Н-обменного в сочетании с масс-спектрометрии высокого разрешения (HX-MS). HX-МС является универсальным и надежный метод, который добавляет новое измерение к структурной информации, полученной, например, кристаллографии. Он используется для изучения белок складывания и раскладывания, связывание небольшой мольecule лиганды, белок-белковые взаимодействия, конформационные изменения, связанные с ферментативного катализа и allostery. Кроме того, HX-MS часто используется, когда количество белка очень ограничено или кристаллизации белка не представляется возможным. Здесь мы предлагаем общий протокол для изучения динамики белков с HX-МС и описать в качестве примера, как показывают интерфейс взаимодействия двух белков в комплексе.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количество кристаллических структур белков и белковых комплексов резко увеличилось в последние годы. Они представляют бесценные снимки структурной организации этих белков и обеспечить основу для структуры и функции анализа. Тем не менее, динамика белков и конформационных изменений, которые необходимы для их функций, которые редко показал с помощью рентгеновской кристаллографии. Крио-Электронная микроскопия, с другой стороны, имеет возможность захвата белка и белковых комплексов в различных конформаций, но в целом не может решить конформационные изменения до среднего уровня структуры 1. Конформационная динамика белков в растворе на атомном деталей может быт....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка буферов и Белки Образцы

  1. Подготовка H 2 O буфер. Использование Hsp90 стандартный буфер (40 мМ HEPES / KOH, рН 7,5, 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2, 10% глицерина) в H 2 O буфер.
    Примечание: Если образец подвергают диализу перед анализом, использовать буфер диализа как Н 2 О буфера. Очень важно, чтобы уплотнительное буфера D 2 отличается от вывода буфера H 2 только в изотопа водорода. Летучие буферы, такие как NH 4 CO 3 или NH 4-ацетат или буферные компоненты не подходят!
  2. Подготовка D 2 O буфер путем лиофилизаци....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hsp90 представляет собой молекулярный сопровождающий в дрожжах и член шаперонной семьи Hsp90. Идя через сложную АТФазы цикла она помогает поздние этапы складывания многих клиентов белка. Эффективное складывающиеся требуется передачу клиентов от Hsp70 и взаимодействие со-шаперонной Sti1/Hop. Sti1 непосредственно связывается с Hsp90 и облегчает клиенту связывание путем ингибирования АТФазы Hsp90 в. Взаимодействие Hsp90 с Sti1 недавно изучали с помощью HX-MS 23. Здесь мы представляем репрезентативные результаты .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Связывание партнера взаимодействия с белком неизбежно приводит к изменениям в доступности растворителя на сайте связывания. Кроме того, многие белки подвергаются динамические конформационные изменения при связывании, которые влияют на другие регионы, чем действующей связывающей интерфейса. HX-МС является надежным методом для мониторинга этих изменений и даже способны выявить конформационные изменения в белках во временных масштабах, что другие методы не могут покрыть.

Чтобы успешно выполнить.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим М. Boysen замечания по рукописи. Этот проект был профинансирован Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB638 и MA 1278/4-1 в MPM и кластера передового опыта: CellNetworks EXC 81/1). MPM является следователь кластера передового опыта: CellNetworks.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
maXis QTOFBruker
nanoAcquity UPLCWaters Corp.
Shimadzu 10AD-VPShimadzu
EPC6W с микроэлектрическим приводомValco#EPC6W
Клапан впрыска (ручной)Rheodyne#7725
Poros AL20 media AppliedBiosystems#1-6029-06
Poros R2Applied Biosystems#1-1118-02
PepsinSigma#P6887использовать свежий пепсин
Microbore (1 мм)IDEX#C-128
Microbore (2 мм)IDEX#C-130B
Acquity UPLC BEH C8 ColumnWaters Corp.#186002876
ТермомиксерEppendorf#5355000.011
Трубки (различные диаметры)IDEX
ФитингиIDEX#PK-110 с PK-100
6-портовый клапан

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saibil, H. R. Conformational changes studied by cryo-electron microscopy. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 711-714 (2000).
  2. Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
  3. Hoofnag....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи