Методическая статья

Использование Caenorhabditis elegans в качестве модельной системы для изучения белкового гомеостаза в многоклеточном организме

DOI:

10.3791/50840

⸱

18 декабря 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University of the Negev

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы изучить взаимосвязь между белковым гомеостазом, стрессом и старением, мы отслеживали изменения в сворачивании белка, отслеживая белковую дисфункцию, локализацию белка в клетке и стабильность белка на организменном, клеточном и белковом уровнях, используя генетически податливого многоклеточного Caenorhabditis elegans в качестве модельной системы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сворачивание и сборка белков необходимы для функции белка, долгосрочного здоровья клетки и долголетия организма. Исторически сложилось так, что функция и регуляция сворачивания белка изучались in vitro, в изолированных клетках тканевой культуры и в одноклеточных организмах. Недавние исследования выявили связь между белковым гомеостазом (протеостазом), метаболизмом, развитием, старением и температурным восприятием. Эти результаты привели к разработке новых инструментов для мониторинга сворачивания белка в модельном многоклеточном организме Caenorhabditis elegans. В нашей лаборатории мы сочетаем поведенческие анализы, визуализацию и биохимические подходы с использованием чувствительных к температуре или встречающихся в природе метастабильных белков в качестве датчиков среды сворачивания для мониторинга неправильного сворачивания белка. Поведенческие анализы, которые связаны с неправильным сворачиванием определенного белка, обеспечивают простое и мощное считывание белка, позволяя быстро проводить скрининг генов и условий, которые модулируют сворачивание. Аналогичным образом, такое неправильное сворачивание может быть связано с неправильной локализацией белка в клетке. Таким образом, мониторинг локализации белка может выявить изменения в способности клеток к сворачиванию, происходящие в различных тканях, на разных стадиях развития и в условиях изменяющихся условий. Наконец, используя биохимические инструменты ex vivo, мы можем напрямую контролировать стабильность и конформацию белка. Таким образом, комбинируя поведенческие анализы, визуализацию и биохимические методы, мы можем отслеживать неправильное сворачивание белка с разрешением организма, клетки и белка соответственно.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взаимодействие различных этапов биосинтеза белка, таких как транскрипция, обработка и трансляция мРНК, а также сворачивание белка, транслокация и сборка/разборка, определяет нагрузку метастабильных белков, функция которых зависит от механизмов контроля качества клеточных белков1. Таким образом, отсутствие или неисправность механизмов контроля качества белка может привести к функциональному снижению различных типов клеточных механизмов и к возникновению болезней, связанных с неправильным сворачиванием белка2-7. Когда способность механизмов сворачивания и выведения белков уравновешивается нагрузкой метастабильных белков, достигается белковый гомеостаз (протеостаз), состояние, которое в конечном итоге предотвращает накопление неправильно свернутых белков и агрегациювнутри клеток. Считается, что накопление неправильно свернутых белков является сигналом, который активирует стресс-индуцируемые факторы транскрипции, такие как фактор теплового шока (HSF-1), и приводит к активации цитопротекторных стрессовых реакций6,8.

Наше понимание функций сетей протеостаза у многоклеточных в основном основано на исследованиях восстановления in vitro и наблюдениях, сделанных с клетками тканевых культур и одноклеточными организмами9. Например, исследования молекулярных шаперонов, предотвращающих и устраняющих повреждение белков, были сосредоточены на биохимических и клеточных биологических исследованиях механизмов шаперон-опосредованного сворачивания, дезагрегации и транслокации белков10-13. Для сравнения, имеется лишь ограниченная информация о интегрированной функции различных компонентов протеостаза в различных клетках и тканях многоклеточных в «нормальных» условиях роста и в ответна стресс. Открытие того, что у C. elegans контроль качества клеточного белка также может регулироваться клеткой неавтономно, что отражено в экспериментах, показывающих, что мутации в двух нейронах, воспринимающих температуру, могут блокировать активацию реакции теплового шока и снижать термотолерантность, продемонстрировало необходимость изучения регуляции протеостаза в многоклеточном организме14-17. Однако отсутствует целостная картина того, как сети протеостаза, такие как различные семейства молекулярных шаперонов, функционируют в тканях интактных многоклеточных и насколько динамичны эти сети во время развития и старения. Для достижения этой цели необходимы надежные датчики для мониторинга поддержания протеома у живых животных, позволяющие определять протеостатическую способность различных клеток многоклеточного организма в процессе развития и старения.

Чтобы данный белок функционировал как сенсор клеточного протеостаза, он должен реагировать на изменения в среде сворачивания клеток, минимально вмешиваясь в сворачивание неродственных белков в клетке. Для изучения поддержания и восстановления клеточного протеостаза в живом организме можно использовать два взаимодополняющих подхода, которые зависят от складных сенсоров. Первый основан на разработанных фолдинг-сенсорах, основанных на экспериментально идентифицированных метастабильных белках, которые, как известно, зависят от механизмов протеостаза, таких как люциферазасветлячков 18-20 или GFP, помеченная дегроном21-24. При втором подходе эндогенные метастабильные белки, такие как термочувствительные (ts) или зависящие от возраста агрегационные белки, которые реагируют на инкрементальные изменения в клеточной среде, отслеживаются25-27. Разработанные складные сенсоры не выполняют существенной биологической функции, но имеют преимущество в том, что их можно обнаружить с помощью мощных отчетных анализов, таких как белки, помеченные GFP, и они могут быть использованы со многими различными клеточными иживотными моделями. Однако, поскольку введение одного чужеродного белка может влиять на среду сворачивания27, такие полипептиды могут перегружать механизм клеточного протеостаза. В качестве альтернативы, спроектированные складные сенсоры, которые не являются родными для клетки, о которой они сообщают, могут не подвергаться влиянию изменений в протеостазной способности клетки. Например, для одного репортерного субстрата протеасом, меченного GFP, требуется ингибировать ~90% протеасомы, прежде чем фенотип может быть обнаружен23. Напротив, эндогенные метастабильные белки, которые полагаются на механизмы протеостаза клетки, имеют преимущество, заключающееся в том, что они находятся в пределах диапазона клеточной чувствительности. Тем не менее, потеря функции, связанная с неправильным сворачиванием таких белков, также может повлиять на клеточную функцию и жизнеспособность организма. Здесь мы сосредоточимся на использовании эндогенных складных сенсоров C. elegans.

C. elegans - это хорошо зарекомендовавшая себя модель многоклеточных для изучения как развития, так и старения, которая использует множество консервативных биологических путей и может быть использована для отслеживания сворачивания белка в клетке, используя комбинацию клеточной биологии, биохимических и генетических подходов. В качестве зондов протеостатической способности мы использовали метастабильные белки, отслеживая изменения их фенотипа, локализации и стабильности. Кроме того, разнообразие белковых функций может быть изучено с помощью простого поведенческого анализа. Аналогичным образом, существенная неправильная локализация белков происходит, когда клеточные сети контроля качества белка не могут приспособиться к клеточным потребностям. Белки могут быть легко визуализированы в клетках живых животных с помощью флуоресцентно помеченных белков или с помощью иммуноокрашивания. Наконец, используя методы ex vivo, можно контролировать экспрессию и стабильность белка. Это позволяет быстро и просто проводить скрининг поведенческих и физиологических изменений в сочетании с глубоким анализом локализации и стабильности белка, что позволяет проводить мониторинг модификаторов протеостаза. Комбинируя эти различные методы, можно получить широкое представление о среде сворачивания белка в клетке. Действительно, эта стратегия была успешно использована для мониторинга нарушений протеостаза у C. elegans, дрожжей, культуры тканей и бактерий15,25-35.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование поведенческих анализов для мониторинга сворачивания белка в живом организме

1. Синхронизация животных для поведенческих анализов

  1. Следуйте стандартным методам содержания C. elegans36, включая приготовление сред и планшетов, приготовление пищи и условия роста животных. Тщательно контролируйте условия выращивания, включая температуру (15-25 °C), размер популяции и доступность пищи. Выбросьте все пластины, на которых видно бактериальное или грибковое заражение.
  2. Отоберите 15-30 эмбрионов, перенесите их в новые пластины и выращивайте при нужной температуре (15-25 °C) на протяжении всего эксперимента. В качестве альтернативы положите на тарелку 10-20 взрослых особей, дайте им отложить яйца в течение 30-60 минут, а затем снимите их с тарелки. Как прямой отбор эмбрионов, так и посев взрослых особей дадут некоторую изменчивость в возрасте (±6 часа). Чтобы уменьшить эту изменчивость, либо подбирайте эмбрионы на определенной стадии, например, в стадии запятой, либо устанавливайте 10-20 взрослых особей, которые только начинают откладывать яйца (2-й день взрослой жизни). По возможности избегайте синхронизации путем отбеливания, учитывая, что это лечение является стрессовым и может повлиять на протеостаз.
  3. Выберите синхронизированных животных, переложите на пробирную пластину для подсчета очков, а затем выбросьте.

2. Анализ движения

Выберите синхронизированных животных и переложите на чистую тарелку при желаемой температуре для подсчета очков движения (15-25 °C). Для каждой биологической реплики оцените >20 животных и повторите анализ не менее 3 раз для каждого экспериментального условия. Используйте критерий ранговой суммы Уилкоксона Манна-Уитни для сравнения двух независимых экспериментальных условий.

  1. Чтобы определить легкие нарушения опорно-двигательного аппарата, поставьте 5-7 животных вместе в центр чистой бактериальной лужайки и дайте животным двигаться на тарелке в течение 2 минут. Этот временной интервал был определен на основе времени, которое потребовалось 90% животных дикого типа, чтобы очистить круг длиной 1 см.
  2. Подсчитайте количество животных, которые не преодолели круг длиной 1 см (например, которые остались в радиусе 1 см от точки, в которой они были установлены) в течение 2 минут как нескоординированные.
  3. Чтобы выявить серьезные нарушения опорно-двигательного аппарата, посадите животных на чистую бактериальную лужайку.
  4. Сфотографируйте несколько животных в нулевой момент времени (t=0) и еще раз через 5 минут (t=5). Оцените животных, которые не двигались ни на одну длину тела через 5 мин, как парализованных.

3. Термостойкость

  1. Выберите >20 синхронизированных животных и переложите в 24-луночный планшет, содержащий буфер для теплового шока (HS) объемом 450 мкл (Таблица 1). Для каждой биологической реплики оцените >20 животных и повторите анализ не менее 4 раз для каждого экспериментального условия.
  2. Переложите 24-луночную пластину в нагретую ванну. Температура и продолжительность HS сильно зависят от условий произрастания, в частности, от температуры выращивания.
  3. Дополните буфер HS 9 мкл оранжевого SYTOX.
  4. Оценивайте выживаемость животных путем мониторинга поглощения красителя с помощью флуоресцентного стереоскопа с фильтром TXR. Животные, которые приняли краску, мертвы. Используйте критерий ранговой суммы Уилкоксона Манна-Уитни для сравнения двух независимых экспериментальных условий.

Использование иммуноокрашивания и меченых белков для мониторинга сворачивания белка в определенных клетках

4. Мониторинг локализации белков с помощью иммуноокрашивания

  1. На требуемом этапе перенесите не менее 30 животных в пробирку Эппендорфа, содержащую буферМ9 36.
  2. Вымойте животных несколько раз с помощью буфера M9, выполнив короткую стадию центрифугирования на низкой скорости (3 000 об/мин/900 x г, 2 минуты) и восстановите ее.
  3. Поместите трубки на лед на несколько минут, чтобы они остыли.
  4. Удалите лишнюю жидкость и инкубируйте с 500 мкл ледяного 4% раствора параформальдегида (Таблица 2). Время инкубации должно быть откалибровано для каждого исследуемого белка и должно составлять около 5-30 минут при комнатной температуре. Также можно проводить длительную инкубацию при 4 °C, но это может нарушить проникновение образца.
  5. Вымойте неподвижных животных 3 раза с помощью буфера PBS-Tween (pH 7,2) методом центрифугирования (3 000 об/мин, 1-2 мин). На этом этапе животные могут храниться при температуре 4 °C в течение нескольких недель.
  6. Соберите животных центрифугированием (3 000 об/мин, 1-2 мин).
  7. В вытяжке удалите большую часть надосадочной жидкости и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл раствора β-меркаптоэтанола (β-ME) (табл. 2).
  8. Инкубировать при температуре 37 °C в течение ночи, осторожно покачивая на нутаторе.
  9. В капюшоне вымойте животных 3 раза с помощью буфера PBS-Tween (pH 7,2).
  10. Ресуспендируйте животных в 50-100 мкл PBS-Tween (pH 7,2). На этом этапе животные могут храниться при температуре 4 °C в течение нескольких недель.
  11. Соберите животных центрифугированием (3 000 об/мин, 1-2 минуты) и удалите большую часть буфера PBS-Tween.
  12. Добавьте по 100-150 мкл раствора коллагеназы в каждую пробирку и инкубируйте при 37 °С при сильном перемешивании (с помощью термомиксера или встряхивающего инкубатора).
  13. Часто осматривайте животных под стереомикроскопом, начиная с 5 минут инкубации. Когда 20% животных сломаны, остановите реакцию, поместив трубку на лед. Этот шаг очень чувствителен! Продолжительность лечения зависит от условий фиксации и может сильно варьироваться в зависимости от штамма. Длительная инкубация может привести к полной деградации животных. Условия должны быть откалиброваны для каждой используемой партии ферментов и тщательно контролироваться деградацией.
  14. Дважды вымойте животных в PBS-Tween (pH 7,2), а затем соберите животных центрифугированием (3000 об/мин, 1-2 минуты) и удалите большую часть буфера PBS-Tween.
  15. Добавьте 1 мл раствора AbA (Таблица 2) и выдерживайте с легким покачиванием в течение 1 часа при комнатной температуре. На этом этапе животные могут храниться при температуре 4 °C в течение нескольких недель.
  16. Соберите животных центрифугированием (3 000 об/мин, 1-2 минуты) и повторно суспендируйте в 200 μл AbA.
  17. Добавьте первичное антитело, разведенное до соотношения 1:100-1:1000 в растворе AbA, и инкубируйте с легким покачиванием. Температура и продолжительность инкубации могут варьироваться в зависимости от антител и должны быть откалиброваны для каждого исследуемого белка. Начинаем с ночной инкубации при комнатной температуре.
  18. Вымойте животных центрифугированием (3 000 об/мин, 1-2 мин).
  19. Добавьте буфер AbA (1 мл) и выдерживайте с бережным перемешиванием в течение 15-60 минут при комнатной температуре. На этом этапе животные могут храниться при температуре 4 °C в течение нескольких недель.
  20. Дополнительно: образец также может быть окрашен флуоресцентными красителями. Для этого добавьте краситель (например, DAPI (2 мг/мл) или фаллоидин (1:100)) в 200 мкл AbA и выдерживайте с легким покачиванием в течение 1 часа. Этот этап может быть выполнен во время одного из этапов промывания вторичного антитела.
  21. Вымойте животных 3 раза, повторяя шаги 4.18-4.19.
  22. Добавьте 100 мкл AbA с соответствующим флуоресцентно меченным вторичным антителом, разведенным в соотношении 1:100.
  23. Держите образцы в закрытом виде (или в темной пробирке) и выдерживайте с укачиванием в течение нескольких часов при комнатной температуре.
  24. Промойте животных 3 раза путем инкубации в буфере AbA (1 мл) с бережным перемешиванием в течение 15-60 минут при комнатной температуре с последующим центрифугированием (3 000 об/мин, 1-2 минуты). На этом этапе животные могут храниться при температуре 4 °C в течение нескольких недель.
  25. Чтобы установить животных на предметные стекла, удалите всю жидкость и повторно суспендируйте в 10 мкл того же буфера.
  26. Отрежьте конец наконечника пипетки, чтобы животные не запачкались, и перенесите 1-2 мкл образца на предметное стекло.
  27. Добавьте монтажный носитель в соотношении 1:1.
  28. Аккуратно накройте горку покровным стеклом и запечатайте лаком для ногтей. Если предметное стекло не контролируется немедленно, предметное стекло может храниться при температуре -20 °C в течение длительного периода времени.

5. Мониторинг локализации меченых белков

  1. На необходимом этапе соберите не менее 15 животных в каплю 10 мл буфера М9 на предметном стекле.
  2. С помощью «червячной кирки» переместите животных в каплю 10 мл раствора параформальдегида (4%) (табл. 2) и подождите, пока все животные перестанут двигаться (примерно 5 мин).
  3. С помощью «червячной кирки» переместите животных в каплю 2 мл буфера M9 и монтажную среду (1:1) (Таблица 2).
  4. Аккуратно накройте животных покровным стеклом и запечатайте лаком для ногтей.

Использование анализов ex vivo для мониторинга сворачивания и стабильности белка

6. Частичное переваривание

  1. Вымыть животных из 15 пластин (60 мм) с использованием 1-2 мл буфера М9 в микрофуге-пробирке. Обратите внимание, что животные не должны находиться в тесноте, а достаточное количество пищи должно быть доступно на протяжении всего эксперимента.
  2. Вымойте животных несколько раз с помощью буфера M9, центрифугируя (3 000 об/мин, 2 минуты) и повторно суспензируя животных.
  3. После финального отжима суспендируйте животных в буфере M9 объемом 100 μл.
  4. Мгновенная заморозка в жидкости N2. Образцы можно хранить при температуре -80 °C.
  5. С помощью охлажденного пестика и моторизованной дрели (также можно использовать ручную дрель для культуры тканей) измельчите образец. Держите образец на льду и не допускайте перегрева.
  6. Часто осматривайте животных под стереомикроскопом, чтобы определить, завершена ли шлифовка. Если остались неповрежденные животные, повторите процедуру.
  7. Оцените объем с помощью пипетирования экстракта червей.
  8. Добавьте в соотношении 1:1 (2x) раствор для лизиса червей (Таблица 3). Не используйте ингибиторы протеазы любого рода.
  9. Выдерживать на льду в течение 15 минут.
  10. Удалите мусор центрифугированием (1 000 x g в течение 2 минут) в предварительно охлажденной центрифуге (4 °C).
  11. Перенесите надосадочную жидкость в чистую микрофьюжную пробирку. Образцы можно использовать непосредственно или хранить при температуре -80 °C.
  12. Приготовьте раствор химотрипсина (табл. 3) и выдержите на льду до использования.
  13. Определите общую концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда.
    14. При
  14. необходимости разбавьте образец таким образом, чтобы общая концентрация белка составила 3-3,5 мг/мл.
  15. Добавьте раствор химотрипсина к общему лизату белка (1:1,200).
  16. Чтобы определить время инкубации, инкубируйте образец с химотрипсином в течение 60 мин. Удалите 20 мкл аликвот из образца в разные моменты времени (например, 0, 5, 20, 40 и 60 мин), немедленно смешайте с буфером для образца SDS и кипятите в течение 5 мин при 96 °C. * В качестве альтернативы инкубируйте образец с различными концентрациями химотрипсина и остановите реакцию через определенное время, добавив буфер для образца SDS и кипятите в течение 5 мин при 96 °C.
  17. Запустите образцы на геле SDS-PAGE.
  18. Проведите вестерн-блоттинг с использованием соответствующих антител для определения относительной стабильности белка.
  19. Определите оптимальные условия (концентрацию химотрипсина и время переваривания), которые показывают значительные изменения между образцами, и используйте эти условия для будущих экспериментов.
  20. Определите интенсивность различных продуктов распада (фрагментов с более низкой молекулярной массой) с помощью денситометрического программного обеспечения, такого как модуль NIH image gel.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нарушенная среда сворачивания может привести к неправильному сворачиванию и агрегации белка. Неправильное сворачивание белка связано с изменением конформации и приводит к потере функции белка. Мы используем дополнительные подходы для мониторинга сворачивания и функции белка у интактных животных, конкретных клеток и белковых экстрактов. Разумный выбор сворачивающего сенсора, основанный на сильных поведенческих и клеточных фенотипах, которые связаны с известной дестабилизирующей мутацией, может быть использован для монитор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Зонды способности клеточного протеостаза должны быть высокочувствительны к изменениям в среде сворачивания и легко контролироваться таким образом, чтобы обеспечить оценку возможностей контроля качества сворачивания белка в режиме реального времени. Используя метастабильные белки в качестве зондов протеостазной способности, мы отслеживали изменения фенотипа, субклеточной локализации белка и конформации белка. Представленные здесь протоколы сосредоточены на фенотипах, связанных с мышечными белками, включая моторику, органи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все штаммы нематод, использованные в этой работе, были предоставлены Генетическим центром Caenorhabditis, который финансируется Национальным центром исследовательских ресурсов NIH (NCRR). Моноклональные антитела, разработанные Х.Ф. Эпштейном, были получены из Банка гибридом, разработанного под эгидой NICHD и поддерживаемого Департаментом биологии Университета Айовы. Н. Шемеш был поддержан премией Фэй и Берта Харбора. А.Б.-З. была поддержана стипендией Алона Израильского совета по высшему образованию, грантом Марии Кюри на международную реинтеграцию, а также грантами Двунационального научного фонда и Израильского научного фонда (грант No 91/11).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антитела стэнгинг и фиакшнпараформальдегидаMerc8187151000
Tween-20 Bio-Rad1706531
коллагеназаSigmaC5138-100MG
DABCOMerc8034560100
Triton X-100Alfa Aesar A16046
β -MESigma8057400250
BSAdi Cam000-40-100
  Частичный дайджест ХимотрипсинSigmaC4129-250MG
терморезистентныйSYTOX OrangeInvitrogenS11368
ХолестеринAmaresco0433-250G
ОБОРУДОВАНИЕ
M165 FC флуоресцентный стереоскопLeicaTXR фильтр
EXi синий флуоресцентная микроскопическая камераQImagingEXI-BLU-R-F-M-14-C
ConfoCor 3/510 META конфокальный микроскопZeiss
Пеллетные пестикиSigmaZ359947-100EA
Пеллетный пестик Аккумуляторный моторKontesK749540-0000
MicroCL 17 Микроцентрифуга серииThermo75002455охлаждаеная, , 230 В 50/60 Гц, включает в себя 24x ротор 1,5/2,0 мл с крышкой ClickSeal Biocontainment

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
  2. Arias, E., Cuervo, A. M. Chaperone-mediated autophagy in protein quality control. Curr. Opin. Cell. Biol. 23, 184-189 (2011).
  3. Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 11, 777-788 (2010).
  4. Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
  5. Finley, D. Recognition and processing of ubiquitin-protein conjugates by the proteasome. Annu. Rev. Biochem. 78, 477-513 (2009).
  6. Gidalevitz, T., Prahlad, V., Morimoto, R. I. The stress of protein misfolding: from single cells to multicellular organisms. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
  7. Haynes, C. M., Ron, D. The mitochondrial UPR - protecting organelle protein homeostasis. J. Cell. Sci. 123, 3849-3855 (2010).
  8. Akerfelt, M., Morimoto, R. I., Sistonen, L. Heat shock factors: integrators of cell stress, development and lifespan. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.. 11, 545-555 (2010).
  9. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Integrating the stress response: lessons for neurodegenerative diseases from C. elegans. Trends Cell. Biol. 19, 52-61 (2009).
  10. Li, J., Soroka, J., Buchner, J. The Hsp90 chaperone machinery: conformational dynamics and regulation by co-chaperones. Biochim. Biophys. Acta. 1823, 624-635 (2012).
  11. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  12. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J. Struct. Biol. 179, 152-160 (2012).
  13. Mayer, M. P. Gymnastics of molecular chaperones. Mol. Cell. 39, 321-331 (2010).
  14. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144, 79-91 (2011).
  15. Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes Dev. 21, 3006-3016 (2007).
  16. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the cellular heat shock response in Caenorhabditis elegans by thermosensory neurons. Science. 320, 811-814 (2008).
  17. Bar-Lavan, Y., Kosolapov, L., Frumkin, A., Ben-Zvi, A. Regulation of cellular protein quality control networks in a multicellular organism. FEBS J. 279, 526-531 (2012).
  18. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat. Methods. 8, 879-884 (2011).
  19. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31, 4221-4235 (2012).
  20. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Hsp70 targets Hsp100 chaperones to substrates for protein disaggregation and prion fragmentation. J. Cell. Biol. 198, 387-404 (2012).
  21. Kim, Y. I., Burton, R. E., Burton, B. M., Sauer, R. T., Baker, T. A. Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpXP degradation machine. Mol. Cell. 5, 639-648 (2000).
  22. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nat. Methods. 7, 473-478 (2010).
  23. Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
  24. Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
  25. Brown, C. R., Hong-Brown, L. Q., Welch, W. J. Correcting temperature-sensitive protein folding defects. J. Clin. Invest. 99, 1432-1444 (1997).
  26. Van Dyk, T. K., Gatenby, A. A., LaRossa, R. A. Demonstration by genetic suppression of interaction of GroE products with many proteins. Nature. 342, 451-453 (1989).
  27. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311, 1471-1474 (2006).
  28. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 14914-14919 (2009).
  29. Burkewitz, K., Choe, K., Strange, K. Hypertonic stress induces rapid and widespread protein damage in. C. elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 301, 566-576 (2011).
  30. Alavez, S., Vantipalli, M. C., Zucker, D. J., Klang, I. M., Lithgow, G. J. Amyloid-binding compounds maintain protein homeostasis during ageing and extend lifespan. Nature. 472, 226-229 (2011).
  31. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS Biol. 8, (2010).
  32. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. In press, (2013).
  33. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5, (2009).
  34. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genet.. 7, (2011).
  35. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 14204-14209 (2011).
  36. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  37. Gengyo-Ando, K., Kagawa, H. Single charge change on the helical surface of the paramyosin rod dramatically disrupts thick filament assembly in Caenorhabditis elegans. J. Mol. Biol. 219, 429-441 (1991).
  38. Clark, S. G., Shurland, D. L., Meyerowitz, E. M., Bargmann, C. I., vander Bliek, A. M. A dynamin GTPase mutation causes a rapid and reversible temperature-inducible locomotion defect in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 94, 10438-10443 (1997).
  39. Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300, 1142-1145 (2003).
  40. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Mol. Biol. Cell. 15, 657-664 (2004).
  41. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes Dev. 22, 1427-1438 (2008).
  42. Taylor, R. C., Dillin, A. Aging as an event of proteostasis collapse. Cold Spring Harb. Perspect. Biol.. 3, (2011).
  43. Tissenbaum, H. A. Genetics, Life Span, Health Span, and the Aging Process in Caenorhabditis elegans. J. Gerontol. A. Biological Sci. Med. Sci. 67, 503-510 (2012).
  44. Hosono, R., Mitsui, Y., Sato, Y., Aizawa, S., Miwa, J. Life span of the wild and mutant nematode Caenorhabditis elegans. Effects of sex, sterilization, and temperature. Exp. Gerontol. 17, 163-172 (1982).
  45. Madi, A., et al. Mass spectrometric proteome analysis for profiling temperature-dependent changes of protein expression in wild-type Caenorhabditis elegans. Proteomics. 3, 1526-1534 (2003).
  46. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  47. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295, 669-671 (2002).
  48. Melkani, G. C., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. The UNC-45 chaperone is critical for establishing myosin-based myofibrillar organization and cardiac contractility in the Drosophila heart model. PLoS One. 6, (2011).
  49. Gosai, S. J., et al. Automated high-content live animal drug screening using C. elegans expressing the aggregation prone serpin alpha1-antitrypsin Z. PLoS One. 5, (2010).
  50. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. (313), 1604-1610 (2006).
  51. Cohen, E., et al. Reduced IGF-1 signaling delays age-associated proteotoxicity in mice. Cell. 139, 1157-1169 (2009).
  52. Shemesh, N., Shai, N. Ben-Zvi A (2013) Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (2013), 814-822 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи