Методическая статья

Использование Caenorhabditis elegans в качестве модельной системы для изучения белкового гомеостаза в многоклеточном организме

DOI:

10.3791/50840

⸱

18 декабря 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University of the Negev

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы изучить взаимосвязь между белковым гомеостазом, стрессом и старением, мы отслеживали изменения в сворачивании белка, отслеживая белковую дисфункцию, локализацию белка в клетке и стабильность белка на организменном, клеточном и белковом уровнях, используя генетически податливого многоклеточного Caenorhabditis elegans в качестве модельной системы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сворачивание и сборка белков необходимы для функции белка, долгосрочного здоровья клетки и долголетия организма. Исторически сложилось так, что функция и регуляция сворачивания белка изучались in vitro, в изолированных клетках тканевой культуры и в одноклеточных организмах. Недавние исследования выявили связь между белковым гомеостазом (протеостазом), метаболизмом, развитием, старением и температурным восприятием. Эти результаты привели к разработке новых инструментов для мониторинга сворачивания белка в модельном многоклеточном организме Caenorhabditis elegans. В нашей лаборатории мы сочетаем поведенческие анализы, визуализацию и биохимические подходы с использованием чувствительных к температуре или встречающихся в природе метастабильных белков в качестве датчиков среды сворачивания для мониторинга неправильного сворачивания белка. Поведенческие анализы, которые связаны с неправильным сворачиванием определенного белка, обеспечивают простое и мощное считывание белка, позволяя быстро проводить скрининг генов и условий, которые модулируют сворачивание. Аналогичным образом, такое неправильное сворачивание может быть связано с неправильной локализацией белка в клетке. Таким образом, мониторинг локализации белка может выявить изменения в способности клеток к сворачиванию, происходящие в различных тканях, на разных стадиях развития и в условиях изменяющихся условий. Наконец, используя биохимические инструменты ex vivo, мы можем напрямую контролировать стабильность и конформацию белка. Таким образом, комбинируя поведенческие анализы, визуализацию и биохимические методы, мы можем отслеживать неправильное сворачивание белка с разрешением организма, клетки и белка соответственно.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взаимодействие различных этапов биосинтеза белка, таких как транскрипция, обработка и трансляция мРНК, а также сворачивание белка, транслокация и сборка/разборка, определяет нагрузку метастабильных белков, функция которых зависит от механизмов контроля качества клеточных белков1. Таким образом, отсутствие или неисправность механизмов контроля качества белка может привести к функциональному снижению различных типов клеточных механизмов и к возникновению болезней, связанных с неправильным сворачиванием белка2-7. Когда способность механизмов сворачивания и выведения белков уравновешивается нагрузкой метастабильных белков, достигается белковый гомеос....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование поведенческих анализов для мониторинга сворачивания белка в живом организме

1. Синхронизация животных для поведенческих анализов

  1. Следуйте стандартным методам содержания C. elegans36, включая приготовление сред и планшетов, приготовление пищи и условия роста животных. Тщательно контролируйте условия выращивания, включая температуру (15-25 °C), размер популяции и доступность пищи. Выбросьте все пластины, на которых видно бактериальное или грибковое заражение.
  2. Отоберите 15-30 эмбрионов, перенесите их в новые пластины и выращивайте при нужной температуре (15-25 °C) на протяжении всег....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нарушенная среда сворачивания может привести к неправильному сворачиванию и агрегации белка. Неправильное сворачивание белка связано с изменением конформации и приводит к потере функции белка. Мы используем дополнительные подходы для мониторинга сворачивания и функции белка у интактных животных, конкретных клеток и белковых экстрактов. Разумный выбор сворачивающего сенсора, основанный на сильных поведенческих и клеточных фенотипах, которые связаны с известной дестабилизирующей мутацией, может быть использован для монитор.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Зонды способности клеточного протеостаза должны быть высокочувствительны к изменениям в среде сворачивания и легко контролироваться таким образом, чтобы обеспечить оценку возможностей контроля качества сворачивания белка в режиме реального времени. Используя метастабильные белки в качестве зондов протеостазной способности, мы отслеживали изменения фенотипа, субклеточной локализации белка и конформации белка. Представленные здесь протоколы сосредоточены на фенотипах, связанных с мышечными белками, включая моторику, органи.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все штаммы нематод, использованные в этой работе, были предоставлены Генетическим центром Caenorhabditis, который финансируется Национальным центром исследовательских ресурсов NIH (NCRR). Моноклональные антитела, разработанные Х.Ф. Эпштейном, были получены из Банка гибридом, разработанного под эгидой NICHD и поддерживаемого Департаментом биологии Университета Айовы. Н. Шемеш был поддержан премией Фэй и Берта Харбора. А.Б.-З. была поддержана стипендией Алона Израильского совета по высшему образованию, грантом Марии Кюри на международную реинтеграцию, а также грантами Двунационального научного фонда и Израильского научного фонда (грант No 91/11).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антитела стэнгинг и фиакшнпараформальдегидаMerc8187151000
Tween-20 Bio-Rad1706531
коллагеназаSigmaC5138-100MG
DABCOMerc8034560100
Triton X-100Alfa Aesar A16046
β -MESigma8057400250
BSAdi Cam000-40-100
  Частичный дайджест ХимотрипсинSigmaC4129-250MG
терморезистентныйSYTOX OrangeInvitrogenS11368
ХолестеринAmaresco0433-250G
ОБОРУДОВАНИЕ
M165 FC флуоресцентный стереоскопLeicaTXR фильтр
EXi синий флуоресцентная микроскопическая камераQImagingEXI-BLU-R-F-M-14-C
ConfoCor 3/510 META конфокальный микроскопZeiss
Пеллетные пестикиSigmaZ359947-100EA
Пеллетный пестик Аккумуляторный моторKontesK749540-0000
MicroCL 17 Микроцентрифуга серииThermo75002455охлаждаеная, , 230 В 50/60 Гц, включает в себя 24x ротор 1,5/2,0 мл с крышкой ClickSeal Biocontainment

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
  2. Arias, E., Cuervo, A. M. Chaperone-mediated autophagy in protein quality control. Curr. Opin. Cell. Biol. 23, 184-189 (2011).
  3. Tyedmers, J.....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи