FtsZ полимеризации Анализы: Простые протоколы и соображения

Краткое содержание

Полимеризация FtsZ необходима для деления бактериальных клеток. В этом отчете мы подробно описываем простые протоколы для мониторинга активности полимеризации FtsZ и обсуждаем влияние состава буфера. Протоколы могут быть использованы для изучения взаимодействия FtsZ с регуляторными белками или антибактериальными препаратами, влияющими на полимеризацию FtsZ.

Аннотация

Во время деления бактериальной клетки незаменимый белок FtsZ собирается в середине клетки, образуя так называемое Z-кольцо. FtsZ полимеризуется в длинные филаменты в присутствии ГТФ in vitro, а полимеризация регулируется несколькими дополнительными белками. Полимеризация FtsZ была широко изучена in vitro с использованием основных методов, включая рассеяние света, седиментацию, анализ гидролиза ГТФ и электронную микроскопию. Условия буфера влияют как на полимеризационные свойства FtsZ, так и на способность FtsZ взаимодействовать с регуляторными белками. В этой статье мы описываем протоколы исследований полимеризации FtsZ и проверяем условия и контроль с использованием Escherichia coli и Bacillus subtilis FtsZ в качестве модельных белков. Вводится низкоскоростной анализ седиментации, который позволяет изучать взаимодействие FtsZ с белками, связывающими или скручивающими полимеры FtsZ. Описан усовершенствованный протокол анализа ГТФазы, который позволяет тестировать гидролиз ГТФ с течением времени с использованием различных условий в 96-луночном планшете со стандартизированным временем инкубации, исключающим изменение изменения в развитии цвета в реакции обнаружения фосфатов. Описана подготовка образцов к исследованиям светорассеяния и электронной микроскопии. Несколько буферов используются для определения подходящего pH буфера и концентрации соли для исследований полимеризации FtsZ. Высокая концентрация KCl является оптимальной для большинства экспериментов. Наши методы обеспечивают отправную точку для характеристики in vitro FtsZ не только из E. coli и B. subtilis, но и из любой другой бактерии. Таким образом, эти методы могут быть использованы для изучения взаимодействия FtsZ с регуляторными белками или для тестирования антибактериальных препаратов, которые могут влиять на полимеризацию FtsZ.

Введение

Незаменимый бактериальный белок FtsZ является наиболее хорошо характеризуемым белком механизма деления бактериальных клеток. FtsZ является прокариотическим гомологом тубулина и полимеризуется in vitro ГТФ-зависимым образом. FtsZ является очень привлекательной мишенью для новых антибиотиков благодаря своей консервативной природе и уникальности для бактерий^1,2. В начале деления клетки FtsZ образует цитокинетическое кольцо в средней клетке, которое служит каркасом для сборки других белков клеточного деления. Формирование Z-кольца имеет решающее значение для правильной локализации плоскости деления. Динамика сборки FtsZ регулируется несколькими дополнительными белками, такими как (в зависимости от вида бактерий) MinC, SepF, ZapA, UgtP и EzrA². Полимеризация FtsZ была интенсивно изучена in vitro, и в зависимости от буфера сборки, нуклеотида и дополнительных белков, включенных в анализ, было описано множество различных структур, включая прямые протофиламенты, изогнутые протофиламенты, листы филаментов, пучки филаментов и трубки филаментов^. Архитектура протофиламентов FtsZ in vivo еще не до конца изучена, хотя эксперименты с электронной криотомографией у Caulobacter crescentus позволяют предположить, что Z-кольцо собирается из относительно коротких, прерывистых одиночных протофиламентов без обширного связывания.

In vitro свойства полимеризации FtsZ и взаимодействие FtsZ с регуляторными белками чувствительны к составу реакционного буфера. Например, недавно мы описали сайт взаимодействия для SepF на C-конце FtsZ и показали, что FtsZ_Bs∆16 C-концевое усечение больше не связывается с SepF⁵. В предыдущем исследовании взаимодействия SepF-FtsZ_Bs аналогичный усеченный FtsZ_Bs∆16 все еще соосаждался с SepF, что позволяет предположить, что SepF связывается со вторичным сайтом на FtsZ⁶. Разница между этими исследованиями заключалась в составе реакционных буферов - при рН 7,5 не наблюдалось соседиментации SepF с усеченным FtsZ, тогда как при рН 6,5 наблюдалось соседиментация. Gündoğdu et al. отметили, что SepF не функционирует и выпадает в осадок при pH 6,5⁷, что свидетельствует о том, что наблюдаемое совместное осаждение при pH 6,5, вероятно, вызвано осаждением SepF, а не взаимодействием с C-концевым усечением FtsZ_Bs∆16. Влияние pH и концентрации KCl на полимеризацию FtsZ было изучено ранее. Полимеры E. coli FtsZ (FtsZ_Ec) при pH 6,5 длиннее и обильнее, чем полимеры, образующиеся при нейтральном pH^8,9. Tadros et al. изучили полимеризацию FtsZ_Ec в присутствии одновалентных катионов, отметив, что связывание K⁺ связано с полимеризацией FtsZ_Ec и имеет решающее значение для активности FtsZ10. pH более критичен, когда изучается взаимодействие FtsZ с другими белками, как показано в предыдущем примере SepF, и зависимость pH ингибирующего действия MinC от FtsZ¹¹. Поскольку как pH, так и концентрация соли могут влиять на взаимодействие FtsZ с другими белками, важно выбрать правильные условия и контроль для исследований полимеризации FtsZ.

Здесь мы описываем протоколы для изучения полимеризации FtsZ и активности ГТФазы с помощью рассеяния света, электронной микроскопии, седиментации и анализов ГТФазы. Рассеяние света под прямым углом является стандартным методом изучения полимеризации FtsZ в режиме реального времени¹². Мы внесли несколько улучшений в седиментацию и анализ ГТФазы. Подробно рассказываем, как подготовить образцы для рассеяния света и электронной микроскопии. Было протестировано несколько буферов, используемых в литературе для изучения полимеризации FtsZ, и описаны наилучшие условия для каждого эксперимента. Мы также показываем, какие элементы управления следует внедрить для получения наилучших данных.

Эти методы позволяют быстро изучить полимеризацию FtsZ, активность и взаимодействие с другими белками с помощью простых методов и оборудования, которое доступно в большинстве лабораторий. Существуют более сложные методы изучения полимеризации FtsZ, но они часто требуют доступа к более специализированному оборудованию и/или модификации FtsZ флуоресцентными метками^8,13,14. Простые методы, описанные в данной статье, проиллюстрированы на примере FtsZ из B. subtilis и E. coli, наиболее распространенных организмов Gram+ и Gram-модели. Протоколы могут быть адаптированы к любому другому белку FtsZ. Основываясь на предварительных анализах с использованием этих новых FtsZ, для достижения оптимального результата могут потребоваться незначительные изменения в отношении времени, буфера или температуры инкубации. Описанные здесь эксперименты должны помочь в поиске этих оптимальных условий.

Протокол

Немеченые белки FtsZ очищали, как описано ранее^11,15, диализировали против 20 мМ Tris/HCl (pH 7,9), 50 мМ KCl, 1 мМ EGTA, 2,5 мМ MgAc и 10% глицерина и хранили при -80 °C. В этих условиях белок может храниться более 2 лет без существенной потери активности. Белок следует хранить в аликвотах объемом 100 μл, чтобы избежать размораживания и замораживания образца. После размораживания образец можно хранить при температуре 4 °C не более одной недели. FtsZ растворим в высоких концентрациях и может храниться при концентрации 7-10 мг/мл. Важно поддерживать высокую концентрацию белка, чтобы избежать нежелательных эффектов компонентов буфера хранения в последующих экспериментах. Таким образом, концентрация при хранении должна позволять разбавлять FtsZ не менее чем в 10 раз, чтобы снизить концентрацию глицерина ниже 1% и свести к минимуму концентрацию других компонентов диализного буфера в реакционной смеси. На полимеризацию FtsZ также может влиять присутствие высоких концентраций натрия⁹ или имидазола, поэтому эти компоненты должны быть удалены из полимеризационного буфера. SepF очищали в соответствии с описанием⁷ и хранили в элюирующем буфере при температуре -80 °C. Альтернативные опубликованные методики очистки FtsZ от E. coli и B. subtilis, а также ссылки на процедуры очистки FtsZ из различных источников обобщены в таблице 1 (см. раздел с репрезентативными результатами).

1. Подготовка образцов

1. Приготовьте буферы полимеризации:

   1	50 мМ Hepes/NaOH, pH 7,5
   2	25 мМ ТРУБКИ/ NaOH, pH 6,8
   3	50 мМ MES/NaOH, pH 6,5
   4	50 мМ Hepes/NaOH, pH 7,5; 50 мМ KCl
   5	25 мМ ТРУБКИ/NaOH, pH 6,8; 50 мМ KCl
   6	50 мМ MES/NaOH, pH 6,5; 50 мМ KCl
   7	50 мМ Hepes/NaOH, pH 7,5; 300 мМ KCl
   8	25 мМ ТРУБКИ/NaOH, pH 6,8; 300 мМ KCl
   9	50 мМ MES/NaOH, pH 6,5; 300 мМ KCl

2. Фильтр стерилизует все буферы с помощью мембранного фильтра 22 мкм.
3. Приготовьте 100 мМ стоковых растворов GTP, GDP и MgCl₂ в каждом полимеризационном буфере из пункта (1).
4. Предварительно очистите белки путем вращения при 100 000 x g в течение 20 минут при 4 °C для всех экспериментов.

2. Седиментационный анализ FtsZ

1. Приготовьте реакционную смесь путем добавления MgCl₂ и FtsZ в один из полимеризационных буферов (см. пункт подготовки образца 1) в пробирках, совместимых с высокоскоростным центрифугированием. Общий объем должен составлять 49 мкл, при этом MgCl2 должен составлять 10 мМ, а FtsZ - 12 мкМ при 50 мкл конечного объема.
2. Поместите пробирку в инкубатор с функцией встряхивания, инкубируйте в течение 2 минут при 30 °C при 300 об/мин (в качестве альтернативы образец можно аккуратно перевернуть и кратковременно подвергнуть микрофункции с последующим предварительным подогревом при 30 °C).
3. Начните полимеризацию, добавив 1 мкл стокового раствора ГТФ или GDP в тот же буфер, который использовался в эксперименте (конечная концентрация 2 мМ). Инкубировать в течение 10 или 2 мин (для буферов с 50 мМ KCl и 300 мМ KCl соответственно) при 30 °C при 300 об/мин (или в инкубаторе с функцией встряхивания).
4. Поместите пробирки в ротор ультрацентрифуги и вращайте в течение 10 минут при 350 000 x g (89 700 об/мин для ротора TLA 120.1) при 25 °C.
5. После отжима осторожно снимите трубки с ротора и сразу же переложите надосадочную жидкость в чистую пробирку. Подготовьте образцы для SDS-PAGE, добавив 20 мкл надосадочной жидкости к 20 мкл 2x буфера для образцов. Варить 10 минут при температуре 98 °C.
6. Добавьте 50 мкл 2x буфера для образца к фракции гранул, содержащей полимеры FtsZ. Поместите ультрацентрифужную пробирку в пробирку объемом 2 мл. Повторно суспендируйте гранулу кипячением в течение 10 минут при 98 °C, затем добавьте 50 μл деминерализованной H₂O, чтобы образец получил такое же 2-кратное разбавление, как и образец надосадочной жидкости.
7. Переверните пробирку ультрацентрифуги вверх дном в пробирке объемом 2 мл и вращайте в течение 5 минут в центрифуге Eppendorf при давлении 18 000 x g. Извлеките пробирку ультрацентрифуги из пробирки объемом 2 мл.
8. Загрузите по 10 мкл каждой надосадочной жидкости и образец гранул рядом друг с другом на 10% гель SDS-PAGE. Запустите гель при напряжении 150 В.
9. Окрасьте гель Coomassie Brilliant Blue G-250 и оставьте для количественного определения.

3. Седиментационный анализ FtsZ при медленном вращении

1. Приготовьте раствор полимеризации, как описано на шаге 2, добавьте SepF и/или FtsZ (конечная концентрация 12 μM). Эти эксперименты могут быть выполнены в одноразовых пробирках Beckman объемом 1,5 мл в сочетании с ротором TLA-55.
2. Поместите пробирку в инкубатор с функцией встряхивания и инкубируйте в течение 2 минут при 30 °C при 300 оборотах в минуту.
3. Полимеризацию начинают с добавления 1 мкл ГТФ или ГДВ из исходного раствора (конечная концентрация 2 мМ), инкубируют в течение 20 мин при 30 °С при 300 об/мин.
4. Вращайте в течение 15 минут при 24 600 x g (20 000 об/мин для ротора TLA 55) при 25 °C.
5. Удалите надосадочную жидкость и переложите в чистую пробирку, возьмите 20 μл и переложите в 20 μл 2x буфер для образца. Варить 10 минут при температуре 98 °C.
6. Добавьте 50 мкл 2x буфера для проб к гранулированной фракции, содержащей полимеры, и повторно суспендируйте кипячением в течение 10 мин при 98 °C, добавьте 50 μл деминерализованного H₂O.
7. Загрузите по 10 мкл каждой надосадочной жидкости и образец гранул рядом друг с другом на 10% гель SDS-PAGE. Запустите гель при напряжении 150 В.
8. Окрасьте гель Coomassie Brilliant Blue G-250 и оставьте для количественного определения.

4. Количественная оценка анализов седиментации FtsZ

1. Сфотографируйте окрашенный гель Кумасси с помощью системы документирования геля (например, LAS-4000, Fujifilm).
2. Откройте изображение геля в программе, подходящей для денситометрического анализа гелей (например, программе AIDA image analyzer (Raytest)) и опишите анализ в этой программе ниже.
3. Нажмите кнопку «Оценка» на панели инструментов.
4. Выберите «2D денситометрия» из списка и нажмите «ОК».
5. В главном меню нажмите «Оценка» и выберите запись «Определение региона».
6. Чтобы создать область на геле, нажмите на символ инструмента Автоконтур в наборе инструментов Определение региона.
7. Нажмите в левом верхнем углу белковой полосы на геле, удерживайте кнопку мыши и перетащите ее к нужному нижнему правому концу полосы и отпустите кнопку мыши.
8. Отметьте каждую полосу FtsZ/SepF таким же образом.
9. Всю информацию об оценке назначенных регионов можно найти в Отчете по регионам. Чтобы получить отчет по региону, нажмите кнопку «Показать отчет по региону» на панели инструментов «Определение региона».
10. Чтобы экспортировать отчет, в главном меню нажмите кнопку «Файл» и выберите пункт «Экспорт в 2D региональный отчет».
11. В отчете по регионам должна быть найдена интенсивность каждого созданного региона. Рассчитайте процентное содержание белка (FtsZ, регуляторный белок) в грануле, используя значения интенсивности из отчета.

5. Рассеяние света на 90°

1. Включите флуоресцентный спектрометр (например, AMINCO-Bowman Series 2), дайте лампе прогреться в течение нескольких минут, чтобы избежать тепловых колебаний, и включите циркуляционную водяную баню для поддержания температуры кюветной камеры на уровне 30 °C.
2. Определите рабочие параметры спектрометра: детектор высокого напряжения 300 В, длина волны излучения и возбуждения: 350 нм, ширина щели: 4 нм. Обратите внимание, что многие спектрометры автоматически настраивают сигнал в начале эксперимента на определенный процент (например, 60%) от максимума. Это приводит к тому, что сигнал рассеяния выходит за пределы диапазона, как только GTP добавляется для полимеризации FtsZ. Прежде чем приступать к серии экспериментов, целесообразно сначала выбрать правильное усиление сигнала - детектор высокого напряжения - для максимальной полимеризации.
3. Запрограммируйте протокол сбора данных. Выберите сбор данных по времени с продолжительностью 3 600 секунд.
4. Тщательно очистите флуоресцентную кювету водой и этанолом, при необходимости - ультразвуком на водяной бане при комнатной температуре в течение 5 минут. В этом протоколе использовались кюветы с длиной пути 1 см и объемом 200 μл, которые хранились в накопительном растворе (0,5-1% Hellmanex). В качестве альтернативы можно использовать одноразовые УФ-совместимые пластиковые кюветы (UVette, Eppendorf).
5. Приготовьте 294 мкл исходной смеси полимеризационного буфера (см. пункт подготовки образца 1) с 10 мМ MgCl₂ и 12 мкМ FtsZ в качестве конечной концентрации, рассчитанной для 300 мкл, и вортекс.
6. Перенесите 196 мкл полимеризационного буфера в кювету и поместите его в спектрометр. Выдерживать в течение 2 минут при температуре 30 °C.
7. Запустите сбор данных и подождите 90 секунд, чтобы убедиться в стабильности сигнала.
8. Добавьте 4 мкл 100 мМ ГТФ или GDP (конечная концентрация: 2 мМ), чтобы получить конечный объем реакции 200 мкл, пипетируйте вверх и вниз с помощью пипетки большего объема для смешивания и возобновите сбор
.

6. Просвечивающая электронная микроскопия

1. Подготовьте образцы как для седиментационного анализа FtsZ (конечный объем может быть уменьшен до 10 мкл для экономии материала).
2. По истечении времени инкубации нанесите 2 мкл образца на тлеющую медную сетку с углеродным покрытием 400 меш, инкубируйте в течение 15 секунд.
3. Промокните сетку насухо, осторожно коснувшись или перетащив сетку параллельно или перпендикулярно листу фильтровальной бумаги.
4. Окрасьте сетку 4 мкл 2% раствора уранилацетата. Промокните сетку насухо, как описано в шаге 6.3.
5. Посмотрите на сетку на электронном микроскопе Philips CM120, работающем на напряжении 120 кВ при 39 200-кратном увеличении.

7. Анализ гидролиза ГТФ

Установка эксперимента разработана таким образом, что гидролиз ГТФ FtsZ останавливается после различных времен реакции путем смешивания реакции с малахитовым зеленым. Таким образом, время развития цвета малахитового зеленого одинаково для каждого образца.

1. Приготовьте 1,5 мл 2 мМ ГТФ в одном из полимеризационных буферов (см. пробоподготовку, пункт 1).
   Приготовьте стандартное разведение фосфатов 0-40 мкМ в полимеризационном буфере и приготовьте рабочий реагент для зеленого малахита, как описано в наборе POMG-25H (биоанализы). В качестве альтернативы рабочие реагенты могут быть приготовлены собственными силами в соответствии с протоколами, описанными Lanzetta et al.¹⁶
2. Готовим мастер-смеси общим объемом 360 μл:

   я	24 мкМ FtsZBs, 20 мМ MgCl2, буфер для полимеризации
   Глава II	12 мкМ FtsZEc, 20 мМ MgCl2, полимеризационный буфер
   III (управление 1)	24 мкМ FtsZBs, 2 мМ ЭДТА, буфер для полимеризации
   IV (контроль 2)	12 мкМ FtsZEc, 2 мМ ЭДТА, полимеризационный буфер

3. Пипетка 20 мкл аликвот исходных смесей, 100 мкл стандартных фосфатов и 180 мкл 2 мМ ГТФ в 96-луночном планшете для количественной ПЦР в следующем порядке:

   	a	В	С	Г	Е	Ф	Г	Ч
   1	Глава III	Глава III	я	я	Глава IV	Глава IV	Глава II	Глава II
   2	Глава III	Глава III	я	я	Глава IV	Глава IV	Глава II	Глава II
   3	Глава III	Глава III	я	я	Глава IV	Глава IV	Глава II	Глава II
   4	Глава III	Глава III	я	я	Глава IV	Глава IV	Глава II	Глава II
   5	Глава III	Глава III	я	я	Глава IV	Глава IV	Глава II	Глава II
   6	Глава III	Глава III	я	я	Глава IV	Глава IV	Глава II	Глава II
   7	Глава III	Глава III	я	я	Глава IV	Глава IV	Глава II	Глава II
   8	Глава III	Глава III	я	я	Глава IV	Глава IV	Глава II	Глава II
   9	ПС	ПС	ПС	ПС	ПС	ПС	ПС	ПС
   10	ПС	ПС	ПС	ПС	ПС	ПС	ПС	ПС
   11
   12	ГТП	ГТП	ГТП	ГТП	ГТП	ГТП	ГТП	ГТП

   
   PS - стандарт фосфата
4. Поместите планшет для количественной ПЦР в ПЦР-машину с программой, установленной на 40-минутный цикл при температуре 30 °C.
5. Приготовьте 20 мкл аликвот малахитового зеленого рабочего реагента в 96-луночной пластине. Добавьте 60 мкл полимеризационного буфера из эксперимента в полосы 1'-8'. Образец будет разбавлен в 4 раза по сравнению со стандартом фосфата, пожалуйста, учитывайте этот факт при окончательных расчетах.

   	a	В	С	Г	Е	Ф	Г	Ч
   1'	Глава III	Глава III	я	я	Глава IV	Глава IV	Глава II	Глава II
   2'	Глава III	Глава III	я	я	Глава IV	Глава IV	Глава II	Глава II
   3'	Глава III	Глава III	я	я	Глава IV	Глава IV	Глава II	Глава II
   4'	Глава III	Глава III	я	я	Глава IV	Глава IV	Глава II	Глава II
   5'	Глава III	Глава III	я	я	Глава IV	Глава IV	Глава II	Глава II
   6'	Глава III	Глава III	я	я	Глава IV	Глава IV	Глава II	Глава II
   7'	Глава III	Глава III	я	я	Глава IV	Глава IV	Глава II	Глава II
   8'	Глава III	Глава III	я	я	Глава IV	Глава IV	Глава II	Глава II
   9'	ПС	ПС	ПС	ПС	ПС	ПС	ПС	ПС
   10'	ПС	ПС	ПС	ПС	ПС	ПС	ПС	ПС

6. Добавьте 20 μл GTP в дорожку 1, пипеткой вверх и вниз для смешивания, запустите таймер (это начальная точка времени для 30-минутной реакции).
7. Через 10 минут, через 30 секунд добавьте ГТФ в дорожку 2, пипетируйте вверх и вниз для смешивания (реакция 20 минут).
8. Через 16 минут добавьте ГТФ в дорожку 3, пипетируйте вверх и вниз для смешивания (реакция 15 минут).
9. Через 21 минуту, через 30 секунд добавьте ГТФ на дорожку 4, пипеткой вверх и вниз для смешивания (реакция 10 минут).
10. Через 25 минут добавьте ГТФ в дорожку 5, пипеткой вверх и вниз для перемешивания (реакция 7 минут).
11. Через 27 минут, через 30 секунд добавьте ГТФ на дорожку 6, пипетируйте вверх и вниз для смешивания (реакция 5 минут).
12. Через 29 минут добавьте ГТФ на дорожку 7, пипеткой вверх и вниз для смешивания (реакция 4 минуты
).
13. Через 30 минут переведите 20 μл из дорожки 1 в дорожку 1', пипетируйте вверх и вниз для смешивания (начальная точка развития малахитового зеленого цвета для 30-минутной реакции).
14. Через 30 мин через 30 сек переведите 20 мкл с дорожки 2 на 2', пипеткой вверх и вниз для смешивания (начальная точка развития малахитового зеленого цвета для 20-минутной реакции).
15. Повторяйте этот шаг для полос движения 3-7 каждые 30 секунд.
16. Через 33 минуты, через 30 секунд добавьте 20 μл GTP в дорожку 8, пипетируйте вверх и вниз для смешивания и переведите 20 μл в дорожку 8', пипетку вверх и вниз для смешивания (0 минут реакции и начальный момент времени для развития малахитового зеленого цвета для реакции).
17. Через 34 минуты добавьте 80 μл с полосы 9 по 9', пипеткой вверх и вниз для смешивания (начальная точка времени для развития цвета малахитового зеленого для фосфатного стандарта 1).
18. Через 34 мин 30 сек переведите 80 мкл с дорожки 10 на 10', пипетируйте вверх и вниз для смешивания (начальная точка времени для развития цвета малахитового зеленого для фосфатного стандарта 2).
19. Удалите из образцов все пузырьки воздуха и выдержите планшет при комнатной температуре еще 25 минут 30 секунд.
20. Поместите планшет в 96-луночный считыватель планшетов.
21. Через 60 минут измеряйте пластину 10 раз в 30 секунд на длине волны 630 нм (раскрытие цвета малахитового зеленого цвета теперь составляет 30 минут для первой реакции). Каждое измерение соответствует каждой временной точке из шагов 7.6-7.12 и 7.16 и должно быть рассчитано отдельно во время анализа данных.
22. Рассчитайте содержание свободных фосфатов в каждом образце с помощью стандартной калибровочной кривой фосфатов.
23. Отобразите данные в виде выделения фосфатов с течением времени и рассчитайте активность гидролиза FtsZ GTP из линейного диапазона кривой.

Результаты

Очистка FtsZ от различных бактериальных источников была описана в литературе и кратко изложена в таблице 1.

См. См.

источник	метод	модификация	Полученный урожай [мг/л культуры]>	Ссылки
В. subtilis	1) Осаждение/ионообменная хроматография сульфата аммония	Нет	40	Эта работа, 11,15
2) Аффинная хроматография	Хис-тег	НД	17
Кишечная палочка	1) Осаждение/ионообменная хроматография сульфата аммония	Нет	35	Эта работа, 11,15
2) Осаждение кальция, ионообменная хроматография	Нет	40	18
Methanococcus jannaschii	1) Аффинная хроматография в условиях денатурации/сворачивания/осаждения сульфата аммония/гелевой фильтрации	Хис-тег	1.3	19
2) Аффинная хроматография / гелевая фильтрация	Хис-тег	НД	20
Термотога морская (Thermotoga maritima)	Ионообменная хроматография/гелевая фильтрация	Нет	6,7	19
Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa)	Аффинная хроматография/гелевая фильтрация	Strep-tag, His-tag	НД	21
Микобактерии туберкулеза	1) Аффинная/ионообменная хроматография	Нет	НД	22
2) Аффинная хроматография / гелевая фильтрация	Нет	30	23
Aquifex aeolicus	Аффинная хроматография/гелевая фильтрация	His-tag, С-образное усечение (331-367)	НД	24
Caulobacter crescentus	Ионообменная хроматография/осаждение сульфата аммония/гелевая фильтрация	Нет	НД	25

Таблица 1. Описаны протоколы очистки FtsZ. НД: Не определено.

Осаждение полимеров FtsZ

Изначально мы использовали две разные скорости для вращения полимеров FtsZ. Мы обнаружили, что только при скорости 350 000 x g отдельные полимеры FtsZ_Ec вращаются вниз (рис. 1), тогда как при 190 000 x g во фракции гранул присутствуют только пучки FtsZ_B (данные не показаны). Поэтому в наших дальнейших экспериментах было использовано 350 000 x g. Процентное содержание полимеризованных FtsZ_Ec и FtsZ_Bs одинаково при 50 мМ KCl, несмотря на то, что эксперименты по рассеянию света показали гораздо более высокий сигнал рассеяния для FtsZ_B. Это связано с пучками, образованными FtsZ_B, которые рассеивают больше света, чем отдельные полимеры FtsZ_Ec. В эксперименте с 300 мМ KCl для_{FtsZ Ec} и FtsZ_Bs получить большое количество полимеров FtsZ в гранулированной фракции не удалось (рис. 1). Мы связываем это с сочетанием быстрой разборки структур FtsZ и уменьшения связывания нитей.

Седиментация канальцев FtsZ-SepF

Для анализа взаимодействия FtsZ с определенными активаторами можно проводить седиментационные анализы при более низких скоростях центрифугирования. При такой скорости могут быть гранулированы только крупные структуры FtsZ, например, крупные канальцы, образованные кольцами SepF и нитями⁵ FtsZ_Bs, или пучки, образованные FtsZ и ZapA. Мы использовали более низкое центрифугирование (24 600 x g), чтобы продемонстрировать осуществимость этого подхода для канальцев, образованных FtsZ и SepF. FtsZ был обнаружен в грануле выше фоновых уровней только тогда, когда в образце присутствовали как SepF, так и GTP (рис. 2), и присутствие SepF не влияет на активность FtsZ GTPase⁷, показывая, что FtsZ полностью активен в присутствии SepF. Удельное осаждение SepF и FtsZ составляет примерно 45% от общего SepF и 15% от общего FtsZ (по сравнению с осаждением материала при добавлении GDP). Это показывает, что канальцы SepF-FtsZ содержат больше SepF, чем FtsZ. Это может быть связано с тем, что многие кольца SepF организуют канальцы FtsZ-SepF^5,7. Точная стехиометрия SepF-FtsZ в этих канальцах неизвестна, но наши результаты показывают, что SepF присутствует больше, чем FtsZ.

Свойства полимеризации и связывания FtsZ_{Z Ec} и FtsZ_Bs

Чтобы охарактеризовать эффективность полимеризации FtsZ_Bs и FtsZ_Ec в различных буферах, мы проанализировали оба белка с помощью рассеяния света под углом 90°. При 50 мМ KCl FtsZ_Bs дает в 20-40 раз более высокий сигнал светорассеяния, чем FtsZ_Ec, в зависимости от pH буфера (рис. 3A и B), подтверждая результаты Buske et al. ²⁶ Увеличение концентрации KCl в буфере не оказало существенного влияния на сигнал светорассеяния FtsZ_Ec (рис. 3D), но сигнал FtsZ_Bs снизился в ~80 раз при рН 7,5, ~30 раз при рН 6,8 и ~45 раз при рН 6,5 в 300 мМ KCl (рис. 3C) по сравнению с буферами с 50 мМ KCl (рис. 3A). Разборка полимеров FtsZ происходит быстрее при более высокой концентрации KCl для обоих белков (рис. 3C и D). Исследования Pacheco-Gómez et al. показывают, что полимеризация и связывание E. coli FtsZ зависят от pH. Эти авторы обнаружили, что в буфере с 50 мМ KCl сигнал светорассеяния полимеризации FtsZ был выше, а разборка FtsZ занимала больше времени при pH 6,0 по сравнению с pH 7,0 ⁸. Эти результаты не согласуются с нашими данными по полимеризации FtsZ_Ec при концентрации 50 мМ KCl (рис. 3B), но следует отметить, что мы использовали три различных буфера (HEPES, MES и PIPES), в которых Pacheco-Gómez et al. Использовались только MES. Таким образом, не только pH, но и буферный состав (ионная сила) влияет на кинетику полимеров FtsZ при концентрации 50 мМ KCl. Однако при концентрации 300 мМ KCl ни состав буфера, ни pH не влияли на сборку FtsZ_Ec детектируемым образом.

Эксперимент по рассеянию света FtsZ_Bs в буферах без KCl был невозможен из-за осаждения белка в этих условиях. При снижении концентрации FtsZ_Bs до 3 мкМ осадков не было. Однако 3 мкМ не является физиологической концентрацией FtsZ в клетке. В пластиковых кюветах FtsZ_Bs не выпадал в осадок при 12 мкМ при pH 7,5, но при pH 6,8 и 6,5 FtsZ все еще выпадал в осадок в отсутствие KCl.

Морфология структур FtsZ из E. coli и B. subtilis

Структуры, сформированные FtsZ, были проверены TEM. FtsZ_{B собраны} в плотно уплотненные полимеры, которые покрывают всю сетку во всех буферах с низким содержанием соли (рисунки 4A-C). FtsZ_Ec формировал длинные нити накаливания, кабели и жгуты во всех буферах с низким содержанием соли (рисунки 4D-F). Однако наблюдаемое количество полимеров, образованных FtsZ_Ec, было ниже, чем количество, образованное FtsZ_Bs. В буферах с высоким содержанием солей FtsZ_Bs образовывали более длинные одноцепочечные протофиламенты, которые не ассоциировались в пучки (рисунки 4G-I). В то время как протофиламенты FtsZ_Bs изменяли структуру при более высокой концентрации соли, FtsZ_Ec образовывали структуры, неотличимые от структур буфера с низким содержанием солей (рис. 4J-L). Не наблюдалось заметного влияния pH на полимеризацию FtsZ_Ec, но FtsZ_Bs образует больше пучков при pH 6,5, которые видны в виде плотно уплотненных полимеров и листов (рис. 4B). Эти результаты согласуются с нашими экспериментами по рассеянию света и ранее опубликованной работой TEM^8,11,26.

Активность ГТФазы FtsZ при высоких и низких концентрациях KCl

Гидролизная активность FtsZ в ГТФ измерялась в различных условиях с использованием колориметрического анализа свободного фосфата. Как сообщалось^ранее15, активность ГТФазы FtsZ увеличивалась с увеличением концентрации KCl: в зависимости от используемого буфера FtsZ_Bs. показал увеличение в 3-7 раз, а FtsZ_Ec показал увеличение активности ГТФазы в 1,5-2,5 раза при 300 мМ KCl по сравнению с 50 мМ KCl. Снижение активности ГТФазы на уровне 50 мМ KCl обусловлено связыванием филаментов FtsZ_Bs. При 50 мМ KCl FtsZ_Ec имел в 3-6 раз более высокую активность ГТФазы, чем FtsZ_Bs, из-за более быстрой разборки полимеров FtsZ_Ec. Разница в активности гидролиза ГТФ между FtsZ_Bs и FtsZ_Ec была уменьшена при 300 мМ KCl, возможно, из-за уменьшения связывания филаментов FtsZ_Bs (рис. 5).

Рисунок 1. Количественное определение полимеризации FtsZ методом осаждения. (A) 12 мкМ FtsZ полимеризовали в присутствии 2 мМ GTP или GDP при pH 7,5 (черные столбцы), 6,8 (серые столбцы) или 6,5 (белые столбцы). Количество гранулированного белка определяли с помощью денситометрического анализа окрашенных гелей Кумасси. GDP служил в качестве контроля для конкретного осаждения, и процент FtsZ, осажденного с GDP, был вычтен из процента FtsZ, осажденного GTP, для получения значений, отображаемых на графике. Слева: FtsZ с осаждением на 50 мМ KCl, справа: FtsZ с осаждением на 300 мМ KCl. (B) Репрезентативные результаты окрашивания гелей Coomassie. Полимеризация FtsZ_Bs (верхний гель) и FtsZ_Ec (нижний гель) при 50 мМ KCl. (S) надосадочной жидкости, (P) гранулированных фракций из эксперимента. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение.

Рисунок 2. Осаждение канальцев SepF/FtsZ на низкой скорости. (A) 12 μM FtsZ_Bs полимеризовали с 2 mM GDP (белые полосы) или GTP (черные полосы). Количество гранулированного белка определяли с помощью денситометрического анализа окрашенных гелей Кумасси. Знаки + и - под осью x указывают на наличие или отсутствие FtsZ и SepF в реакции. (B) Репрезентативные результаты окрашивания гелем Coomassie. Полимеризация FtsZ_Bs в присутствии и отсутствии SepF. В качестве управления использовался SepF без FtsZ. Полимеризацию проводили с помощью ГТФ и ГДД. (S) надосадочная жидкость, (P) фракции гранул из эксперимента. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение.

Рисунок 3. Рассеяние света 12 мкМ FtsZ_Ec и 12 мкМ FtsZ_Bs. FtsZs собирали в присутствии 2 мМ ГТФ, а полимеризацию контролировали с помощью рассеяния света под углом 90°. Полимеризация FtsZ_Bs (A) и FtsZ_Ec (B) при 50 мМ KCl при pH 7,5, pH 6,8, pH 6,5. Полимеризация FtsZ_Bs (C) и FtsZ_Ec (D) при 300 мМ KCl при pH 7,5, pH 6,8 и pH 6,5. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение.

Рисунок 4. Структуры полимеров FtsZ_Bs и FtsZ_Ec, визуализированные с помощью электронной микроскопии. (А-Л) Изображения 12 мкМ FtsZ_Bs (A-C и G-I) и FtsZ_Ec (D-F) и (J-L), полимеризованных 2 мМ ГТФ. (А-С) FtsZ_Bs в буфере с 50 мМ KCl и pH 7,5, 6,8 и 6,5 соответственно. (Д-Ж) FtsZ_Ec в буфере с 50 мМ KCl и pH 7,5, 6,8 и 6,5 соответственно. (Г-И) FtsZ_Bs в буфере с 300 мМ KCl и pH 7,5, 6,8 и 6,5 соответственно. (Дж-Л) FtsZ_Ec в буфере с 300 мМ KCl и pH 7,5, 6,8 и 6,5 соответственно. Масштабная линейка: 100 нм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение.

Рисунок 5. Гидролиз ГТФ при полимеризации FtsZ в 6 различных буферах. Во всех экспериментах использовали 2 мМ ГТФ. В качестве контрольного образца использовали без MgCl₂. Активность FtsZ без MgCl₂ вычиталась из активности FtsZ в присутствии MgCl₂. Слева: активность ГТФазы FtsZ при 50 мМ KCl, справа: активность ГТФазы FtsZ при 300 мМ KCl. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение.

Обсуждение

Мы описываем набор методов, позволяющих быстро проанализировать активность FtsZ и его взаимодействие с другими белками. Для изучения полимеризации FtsZ широко используются методы рассеяния света, седиментации и анализа ГТФазы, а также электронная микроскопия. Мы внесли некоторые улучшения в существующие протоколы, мы показали влияние различных условий на сборку FtsZ, и мы предлагаем контроль, который должен быть включен в исследования FtsZ.

Мы применяем низкоскоростное центрифугирование, чтобы отличить крупные структуры, образованные ассоциацией между FtsZ и взаимодействующими с ним белками, от полимеров FtsZ. Этот метод имеет два преимущества по сравнению со стандартным методом осаждения. Во-первых, полимеры FtsZ не образуют фона в гранулированной фракции, поскольку они не раскручиваются вниз при 24 600 x g. Во-вторых, количество FtsZ, присутствующего в структуре, образованной взаимодействующим белком, может быть рассчитано по гелю. Двумя важнейшими этапами в этом методе являются время инкубации и концентрация ГТФ. Важно центрифугировать крупную белковую структуру, когда она завершена, но до того, как она разберется, когда весь ГТФ гидролизуется. Лучшим контролем для данного исследования является полимеризация FtsZ с GDP. Существует одно потенциальное ограничение анализа. FtsZ образует стабильный комплекс с SepF, который может быть легко раскручен при 24 600 x g. Если проводится осаждение другим активатором или препаратом, связывающим полимеры FtsZ, может потребоваться адаптация анализа. Это может быть сделано путем изменения времени инкубации, либо увеличения скорости центрифугирования.

Правильная подготовка образца является наиболее важной для экспериментов по рассеянию света. Белки должны быть предварительно очищены путем прядения, а все буферы должны быть отфильтрованы перед использованием. Если в образце присутствуют какие-либо агрегаты, они нарушат стабильный сигнал, полученный от полимеров FtsZ. Для анализа структур FtsZ методом электронной микроскопии основным этапом является подготовка сетки. Время инкубации образца на сетке будет иметь эффект получения более или менее уплотненных полимеров. Для пучков FtsZ_B время инкубации должно быть короче, чем для FtsZ_Ec и FtsZ_Bs при высокой концентрации KCl. Мы использовали концентрацию 12 мкМ для каждого образца, чтобы иметь возможность сравнить результаты. Однако для FtsZ_Bs при концентрации 50 мМ KCl следует использовать более низкую концентрацию FtsZ, так как 12 мкМ приводит к полному насыщению сетки. Это делает полимеры сильно уплотненными и их трудно обнаружить. Менее уплотненные полимеры лучше обнаруживать на ЭМ.

Анализ ГТФазы является единственным экспериментом, используемым для изучения активности, а не структуры FtsZ. Mg²⁺ необходим для оборота ГТФ в полимерах FtsZ. Таким образом, в отсутствие Mg²⁺ FtsZ не гидролизует ГТФ. Таким образом, образец без Mg²⁺ является правильным контролем в этом анализе, но катионы Mg присутствуют в буфере хранения FtsZ. Они могут быть удалены путем добавления 1 мМ ЭДТА к контрольному образцу. Критическим этапом в этом анализе является время инкубации. Важно прекратить активность FtsZ через определенное время. Это достигается путем переноса образца FtsZ в зеленый раствор малахита в 96-луночном планшете. Однако освоение цвета малахитового зеленого цвета является непрерывным процессом. Таким образом, измерения должны проводиться в одно и то же время для каждого образца. Используя хорошо спланированный протокол добавления ГТФ с измерениями, проводимыми каждые 30 секунд в установленном порядке, можно получить одинаковое время инкубации и обработки образца для каждой временной точки. Еще одним важным этапом является выбор концентрации белка для эксперимента. В эксперименте мы использовали две разные концентрации для FtsZ,_Ec и FtsZ_Bs. Гидролиз ГТФ для FtsZ_Ec намного быстрее по сравнению с FtsZ_Bs. Активность ГТФазы FtsZ_Ec при выбранных условиях и при 12 мкМ линейна только в течение максимум 5 мин, после чего скорость гидролиза выходит на плато. Таким образом, трудно интерпретировать данные эксперимента, когда он проводился в этих условиях. В этом случае FtsZEc необходимо использовать в более низкой концентрации, чем FtsZ_Bs , чтобы иметь возможность сравнить активность обоих белков. Активность ГТФазы FtsZs из разных источников может различаться. Таким образом, необходимо правильно подобрать концентрацию. Концентрация для полимеризации FtsZ должна быть значительно выше критической концентрации (в общем случае от 2,5-10 мкМ). Также важна динамика сборки и разборки FtsZ. Некоторые белки демонстрируют значительную задержку в полимеризации после добавления ГТФ, как показано для FtsZB при концентрации 50 мМ KCl. Перед анализом ГТФазы полезно провести анализ рассеяния света, чтобы приблизить время сборки и разборки полимеров FtsZ. После этого можно выбрать время инкубации и концентрацию белка. Поскольку условия, выбранные для полимеризации FtsZ, имеют решающее значение, важно использовать правильную концентрацию pH и KCl в каждом методе. В данной работе мы изучили 9 различных буферов с pH в диапазоне от 6,5 до 7,5 и концентрацией KCl от 0 М до 300 мМ. Мы заметили, что наилучшим состоянием для анализа FtsZs из B. subtilis и E.coli и их биологической активности является рН, близкий к физиологическому уровню (7,5), в сочетании с высокой концентрацией KCl. При высокой концентрации KCl FtsZ обладает более высокой активностью ГТФазы и образует полимеры, которые лучше обнаруживаются с помощью электронной микроскопии. Мы также подтвердили, что физиологический pH и высокая концентрация KCl лучше подходят для изучения взаимодействия между FtsZ и регуляторными белками, чем любые другие буферы, в основном используемые для изучения сборки FtsZ. FtsZBs проявляет аналогичную активность FtsZEc при изучении при высокой концентрации KCl. Кроме того, при низкой концентрации соли влияние pH более заметно, чем в буферах с высокой концентрацией солей. FtsZ иногда выпадает в осадок при использовании буферов без KCl, в результате следует избегать буферов без соли. Осаждение полимеров FtsZ низкое при использовании буферов с высокими концентрациями KCl. Это может быть преимуществом при изучении взаимодействий между FtsZ и белками, которые собирают филаменты FtsZ, такими как SepF и ZapA, поскольку эти структуры более высокого порядка легко обнаружить с помощью центрифугирования. Во всех наших экспериментах мы использовали MgCl₂ в концентрации 10 мМ. Показано, что относительно высокая концентрация Mg²⁺ стабилизирует полимеры FtsZ и снижает активность ГТФазы FtsZ. В таблице 2 обобщены результаты различных исследований, описывающих полимеризацию FtsZ и активность ГТФазы при различных концентрациях Mg²⁺ с использованием идентичных в остальном буферных условий ²⁷. Измеренная концентрация свободного цитоплазматического^Mg2+ составляет 0,9^мМ3. Следует отметить, что ГТФ хелатирует эквивалентное количество Mg²⁺. Таким образом, оптимальная концентрация Mg²⁺ для экспериментов с ГТФазой составляет около 2-2,5 мМ, что близко к физиологическому уровню³. Однако в наших экспериментах мы использовали MgCl₂ в концентрации 10 мМ для получения легко обнаруживаемого сигнала светорассеяния и стабилизации полимеров FtsZ во время седиментационного анализа.

Несмотря на то, что мы применили наши протоколы к FtsZ от модельных организмов E. coli и B. subtilis, они могут быть адаптированы к FtsZ от любого другого организма. Следует отметить, что физиологический рН и концентрации одновалентных и двухвалентных катионов различаются в зависимости от организма. Таким образом, оптимальные условия полимеризации FtsZ могут варьироваться. Различия во времени удвоения и условиях роста разных бактерий могут приводить к разной кинетике сборки FtsZ и оптимальным условиям экспериментов. Тем не менее, наш протокол является хорошей отправной точкой для экспериментов с FtsZs из других организмов. Протоколы должны быть полезны для изучения FtsZ с регуляторными белками или изучения влияния малых соединений и лекарств на FtsZ.

Источник	Полимеризация [% осажденного FtsZ]	ГТФаза [Pi/FtsZ/мин]	Концентрация Mg2+ [мМ]	Концентрация ftsZ [μM]	Ссылки
FtsZEc	~ 28%	~ 2.1	10	12	Эта работа
	~ 50%	~ 2.4	10	12.5	27
	~ 43%	~ 3.5	5	12.5	27
	~ 27%	~ 4.6	2.5	12.5	27
	НД	~ 5.4	2.5	5	26
FtsZBs	~ 30%	~ 0.8		12	Эта работа
	~ 52% (с ДЭЭ декстраном)	~ 0,5	10	10	11
	НД	~ 2.25	2.5	5	26

Таблица 2. Влияние Mg²⁺ на полимеризацию FtsZ и ГТФазу. Результаты этой работы в сравнении с опубликованными данными. Все эксперименты проводились при 50 мМ MES/NaOH, pH=6,5, 50 мМ KCl.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
GTP	Roche	10106399001	Часть 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Толстостенные поликарбонатные трубки	Beckman Coulter	343776	Часть 2
Ультрацентрифуга Optima MAX-XP	Beckman Coulter	393315	Часть 2, 3
Полиалломеровая трубка с защелкивающейся крышкой	Beckman Coulter	357448	Часть 3
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL	Raytest Isotopenmessgerä te GmbH	15000001	Часть 4
Анализатор люминесцентного изображения LAS-4000	Fujifilm		Часть 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Люминесцентный спектрометр	Spectronic Instruments		Часть 5
Флуоресцентная ячейка	Hellma Analytics	105-250-15-40	Часть 5
квадратная 400 меш, медь, 100/флакон	Электронная микроскопия Sciences	G400-Cu	Часть 6
CM120 Электронный микроскоп, работающий при напряжении 120 кВ	Philips		Часть 6
96 мл x 0,2 мл Пластина	BIOplastics	B70501	Часть 7
Набор для анализа малахитового зеленого фосфата	Биопробирная система	POMG-25H	Часть 7
PowerWave HT Микропланшетный спектрофотометр	BioTek		Часть 7