Методическая статья

FtsZ полимеризации Анализы: Простые протоколы и соображения

15.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50844

⸱

16 ноября 2013 г.

 , 
1Department of Molecular Microbiology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen

В этой статье

Краткое содержание

Полимеризация FtsZ необходима для деления бактериальных клеток. В этом отчете мы подробно описываем простые протоколы для мониторинга активности полимеризации FtsZ и обсуждаем влияние состава буфера. Протоколы могут быть использованы для изучения взаимодействия FtsZ с регуляторными белками или антибактериальными препаратами, влияющими на полимеризацию FtsZ.

Аннотация

Во время деления бактериальной клетки незаменимый белок FtsZ собирается в середине клетки, образуя так называемое Z-кольцо. FtsZ полимеризуется в длинные филаменты в присутствии ГТФ in vitro, а полимеризация регулируется несколькими дополнительными белками. Полимеризация FtsZ была широко изучена in vitro с использованием основных методов, включая рассеяние света, седиментацию, анализ гидролиза ГТФ и электронную микроскопию. Условия буфера влияют как на полимеризационные свойства FtsZ, так и на способность FtsZ взаимодействовать с регуляторными белками. В этой статье мы описываем протоколы исследований полимеризации FtsZ и проверяем условия и контроль с использованием Escherichia coli и Bacillus subtilis FtsZ в качестве модельных белков. Вводится низкоскоростной анализ седиментации, который позволяет изучать взаимодействие FtsZ с белками, связывающими или скручивающими полимеры FtsZ. Описан усовершенствованный протокол анализа ГТФазы, который позволяет тестировать гидролиз ГТФ с течением времени с использованием различных условий в 96-луночном планшете со стандартизированным временем инкубации, исключающим изменение изменения в развитии цвета в реакции обнаружения фосфатов. Описана подготовка образцов к исследованиям светорассеяния и электронной микроскопии. Несколько буферов используются для определения подходящего pH буфера и концентрации соли для исследований полимеризации FtsZ. Высокая концентрация KCl является оптимальной для большинства экспериментов. Наши методы обеспечивают отправную точку для характеристики in vitro FtsZ не только из E. coli и B. subtilis, но и из любой другой бактерии. Таким образом, эти методы могут быть использованы для изучения взаимодействия FtsZ с регуляторными белками или для тестирования антибактериальных препаратов, которые могут влиять на полимеризацию FtsZ.

Введение

Незаменимый бактериальный белок FtsZ является наиболее хорошо характеризуемым белком механизма деления бактериальных клеток. FtsZ является прокариотическим гомологом тубулина и полимеризуется in vitro ГТФ-зависимым образом. FtsZ является очень привлекательной мишенью для новых антибиотиков благодаря своей консервативной природе и уникальности для бактерий1,2. В начале деления клетки FtsZ образует цитокинетическое кольцо в средней клетке, которое служит каркасом для сборки других белков клеточного деления. Формирование Z-кольца имеет решающее значение для правильной локализации плоскости деления. Динамика сборки FtsZ регулируется несколькими дополнительными белками, такими как (в зависимости от вида бактерий) MinC, SepF, ZapA, UgtP и EzrA2. Полимеризация FtsZ была интенсивно изучена in vitro, и в зависимости от буфера сборки, нуклеотида и дополнительных белков, включенных в анализ, было описано множество различных структур, включая прямые протофиламенты, изогнутые протофиламенты, листы филаментов, пучки филаментов и трубки филаментов. Архитектура протофиламентов FtsZ in vivo еще не до конца изучена, хотя эксперименты с электронной криотомографией у Caulobacter crescentus позволяют предположить, что Z-кольцо собирается из относительно коротких, прерывистых одиночных протофиламентов без обширного связывания.

In vitro свойства полимеризации FtsZ и взаимодействие FtsZ с регуляторными белками чувствительны к составу реакционного буфера. Например, недавно мы описали сайт взаимодействия для SepF на C-конце FtsZ и показали, что FtsZBs∆16 C-концевое усечение больше не связывается с SepF5. В предыдущем исследовании взаимодействия SepF-FtsZBs аналогичный усеченный FtsZBs∆16 все еще соосаждался с SepF, что позволяет предположить, что SepF связывается со вторичным сайтом на FtsZ6. Разница между этими исследованиями заключалась в составе реакционных буферов - при рН 7,5 не наблюдалось соседиментации SepF с усеченным FtsZ, тогда как при рН 6,5 наблюдалось соседиментация. Gündoğdu et al. отметили, что SepF не функционирует и выпадает в осадок при pH 6,57, что свидетельствует о том, что наблюдаемое совместное осаждение при pH 6,5, вероятно, вызвано осаждением SepF, а не взаимодействием с C-концевым усечением FtsZBs∆16. Влияние pH и концентрации KCl на полимеризацию FtsZ было изучено ранее. Полимеры E. coli FtsZ (FtsZEc) при pH 6,5 длиннее и обильнее, чем полимеры, образующиеся при нейтральном pH8,9. Tadros et al. изучили полимеризацию FtsZEc в присутствии одновалентных катионов, отметив, что связывание K+ связано с полимеризацией FtsZEc и имеет решающее значение для активности FtsZ10. pH более критичен, когда изучается взаимодействие FtsZ с другими белками, как показано в предыдущем примере SepF, и зависимость pH ингибирующего действия MinC от FtsZ11. Поскольку как pH, так и концентрация соли могут влиять на взаимодействие FtsZ с другими белками, важно выбрать правильные условия и контроль для исследований полимеризации FtsZ.

Здесь мы описываем протоколы для изучения полимеризации FtsZ и активности ГТФазы с помощью рассеяния света, электронной микроскопии, седиментации и анализов ГТФазы. Рассеяние света под прямым углом является стандартным методом изучения полимеризации FtsZ в режиме реального времени12. Мы внесли несколько улучшений в седиментацию и анализ ГТФазы. Подробно рассказываем, как подготовить образцы для рассеяния света и электронной микроскопии. Было протестировано несколько буферов, используемых в литературе для изучения полимеризации FtsZ, и описаны наилучшие условия для каждого эксперимента. Мы также показываем, какие элементы управления следует внедрить для получения наилучших данных.

Эти методы позволяют быстро изучить полимеризацию FtsZ, активность и взаимодействие с другими белками с помощью простых методов и оборудования, которое доступно в большинстве лабораторий. Существуют более сложные методы изучения полимеризации FtsZ, но они часто требуют доступа к более специализированному оборудованию и/или модификации FtsZ флуоресцентными метками8,13,14. Простые методы, описанные в данной статье, проиллюстрированы на примере FtsZ из B. subtilis и E. coli, наиболее распространенных организмов Gram+ и Gram-модели. Протоколы могут быть адаптированы к любому другому белку FtsZ. Основываясь на предварительных анализах с использованием этих новых FtsZ, для достижения оптимального результата могут потребоваться незначительные изменения в отношении времени, буфера или температуры инкубации. Описанные здесь эксперименты должны помочь в поиске этих оптимальных условий.

Протокол

Немеченые белки FtsZ очищали, как описано ранее11,15, диализировали против 20 мМ Tris/HCl (pH 7,9), 50 мМ KCl, 1 мМ EGTA, 2,5 мМ MgAc и 10% глицерина и хранили при -80 °C. В этих условиях белок может храниться более 2 лет без существенной потери активности. Белок следует хранить в аликвотах объемом 100 μл, чтобы избежать размораживания и замораживания образца. После размораживания образец можно хранить при температуре 4 °C не более одной недели. FtsZ растворим в высоких концентрациях и может храниться при концентрации 7-10 мг/мл. Важно поддерживать высокую концентрацию белка, чтобы избежать нежелательных эффектов компонентов буфера хранения в последующих экспериментах. Таким образом, концентрация при хранении должна позволять разбавлять FtsZ не менее чем в 10 раз, чтобы снизить концентрацию глицерина ниже 1% и свести к минимуму концентрацию других компонентов диализного буфера в реакционной смеси. На полимеризацию FtsZ также может влиять присутствие высоких концентраций натрия9 или имидазола, поэтому эти компоненты должны быть удалены из полимеризационного буфера. SepF очищали в соответствии с описанием7 и хранили в элюирующем буфере при температуре -80 °C. Альтернативные опубликованные методики очистки FtsZ от E. coli и B. subtilis, а также ссылки на процедуры очистки FtsZ из различных источников обобщены в таблице 1 (см. раздел с репрезентативными результатами).

1. Подготовка образцов

  1. Приготовьте буферы полимеризации:
    150 мМ Hepes/NaOH, pH 7,5
    225 мМ ТРУБКИ/ NaOH, pH 6,8
    350 мМ MES/NaOH, pH 6,5
    450 мМ Hepes/NaOH, pH 7,5; 50 мМ KCl
    525 мМ ТРУБКИ/NaOH, pH 6,8; 50 мМ KCl
    650 мМ MES/NaOH, pH 6,5; 50 мМ KCl
    750 мМ Hepes/NaOH, pH 7,5; 300 мМ KCl
    825 мМ ТРУБКИ/NaOH, pH 6,8; 300 мМ KCl
    950 мМ MES/NaOH, pH 6,5; 300 мМ KCl
  2. Фильтр стерилизует все буферы с помощью мембранного фильтра 22 мкм.
  3. Приготовьте 100 мМ стоковых растворов GTP, GDP и MgCl2 в каждом полимеризационном буфере из пункта (1).
  4. Предварительно очистите белки путем вращения при 100 000 x g в течение 20 минут при 4 °C для всех экспериментов.

2. Седиментационный анализ FtsZ

  1. Приготовьте реакционную смесь путем добавления MgCl2 и FtsZ в один из полимеризационных буферов (см. пункт подготовки образца 1) в пробирках, совместимых с высокоскоростным центрифугированием. Общий объем должен составлять 49 мкл, при этом MgCl2 должен составлять 10 мМ, а FtsZ - 12 мкМ при 50 мкл конечного объема.
  2. Поместите пробирку в инкубатор с функцией встряхивания, инкубируйте в течение 2 минут при 30 °C при 300 об/мин (в качестве альтернативы образец можно аккуратно перевернуть и кратковременно подвергнуть микрофункции с последующим предварительным подогревом при 30 °C).
  3. Начните полимеризацию, добавив 1 мкл стокового раствора ГТФ или GDP в тот же буфер, который использовался в эксперименте (конечная концентрация 2 мМ). Инкубировать в течение 10 или 2 мин (для буферов с 50 мМ KCl и 300 мМ KCl соответственно) при 30 °C при 300 об/мин (или в инкубаторе с функцией встряхивания).
  4. Поместите пробирки в ротор ультрацентрифуги и вращайте в течение 10 минут при 350 000 x g (89 700 об/мин для ротора TLA 120.1) при 25 °C.
  5. После отжима осторожно снимите трубки с ротора и сразу же переложите надосадочную жидкость в чистую пробирку. Подготовьте образцы для SDS-PAGE, добавив 20 мкл надосадочной жидкости к 20 мкл 2x буфера для образцов. Варить 10 минут при температуре 98 °C.
  6. Добавьте 50 мкл 2x буфера для образца к фракции гранул, содержащей полимеры FtsZ. Поместите ультрацентрифужную пробирку в пробирку объемом 2 мл. Повторно суспендируйте гранулу кипячением в течение 10 минут при 98 °C, затем добавьте 50 μл деминерализованной H2O, чтобы образец получил такое же 2-кратное разбавление, как и образец надосадочной жидкости.
  7. Переверните пробирку ультрацентрифуги вверх дном в пробирке объемом 2 мл и вращайте в течение 5 минут в центрифуге Eppendorf при давлении 18 000 x g. Извлеките пробирку ультрацентрифуги из пробирки объемом 2 мл.
  8. Загрузите по 10 мкл каждой надосадочной жидкости и образец гранул рядом друг с другом на 10% гель SDS-PAGE. Запустите гель при напряжении 150 В.
  9. Окрасьте гель Coomassie Brilliant Blue G-250 и оставьте для количественного определения.

3. Седиментационный анализ FtsZ при медленном вращении

  1. Приготовьте раствор полимеризации, как описано на шаге 2, добавьте SepF и/или FtsZ (конечная концентрация 12 μM). Эти эксперименты могут быть выполнены в одноразовых пробирках Beckman объемом 1,5 мл в сочетании с ротором TLA-55.
  2. Поместите пробирку в инкубатор с функцией встряхивания и инкубируйте в течение 2 минут при 30 °C при 300 оборотах в минуту.
  3. Полимеризацию начинают с добавления 1 мкл ГТФ или ГДВ из исходного раствора (конечная концентрация 2 мМ), инкубируют в течение 20 мин при 30 °С при 300 об/мин.
  4. Вращайте в течение 15 минут при 24 600 x g (20 000 об/мин для ротора TLA 55) при 25 °C.
  5. Удалите надосадочную жидкость и переложите в чистую пробирку, возьмите 20 μл и переложите в 20 μл 2x буфер для образца. Варить 10 минут при температуре 98 °C.
  6. Добавьте 50 мкл 2x буфера для проб к гранулированной фракции, содержащей полимеры, и повторно суспендируйте кипячением в течение 10 мин при 98 °C, добавьте 50 μл деминерализованного H2O.
  7. Загрузите по 10 мкл каждой надосадочной жидкости и образец гранул рядом друг с другом на 10% гель SDS-PAGE. Запустите гель при напряжении 150 В.
  8. Окрасьте гель Coomassie Brilliant Blue G-250 и оставьте для количественного определения.

4. Количественная оценка анализов седиментации FtsZ

  1. Сфотографируйте окрашенный гель Кумасси с помощью системы документирования геля (например, LAS-4000, Fujifilm).
  2. Откройте изображение геля в программе, подходящей для денситометрического анализа гелей (например, программе AIDA image analyzer (Raytest)) и опишите анализ в этой программе ниже.
  3. Нажмите кнопку «Оценка» на панели инструментов.
  4. Выберите «2D денситометрия» из списка и нажмите «ОК».
  5. В главном меню нажмите «Оценка» и выберите запись «Определение региона».
  6. Чтобы создать область на геле, нажмите на символ инструмента Автоконтур в наборе инструментов Определение региона.
  7. Нажмите в левом верхнем углу белковой полосы на геле, удерживайте кнопку мыши и перетащите ее к нужному нижнему правому концу полосы и отпустите кнопку мыши.
  8. Отметьте каждую полосу FtsZ/SepF таким же образом.
  9. Всю информацию об оценке назначенных регионов можно найти в Отчете по регионам. Чтобы получить отчет по региону, нажмите кнопку «Показать отчет по региону» на панели инструментов «Определение региона».
  10. Чтобы экспортировать отчет, в главном меню нажмите кнопку «Файл» и выберите пункт «Экспорт в 2D региональный отчет».
  11. В отчете по регионам должна быть найдена интенсивность каждого созданного региона. Рассчитайте процентное содержание белка (FtsZ, регуляторный белок) в грануле, используя значения интенсивности из отчета.

5. Рассеяние света на 90°

  1. Включите флуоресцентный спектрометр (например, AMINCO-Bowman Series 2), дайте лампе прогреться в течение нескольких минут, чтобы избежать тепловых колебаний, и включите циркуляционную водяную баню для поддержания температуры кюветной камеры на уровне 30 °C.
  2. Определите рабочие параметры спектрометра: детектор высокого напряжения 300 В, длина волны излучения и возбуждения: 350 нм, ширина щели: 4 нм. Обратите внимание, что многие спектрометры автоматически настраивают сигнал в начале эксперимента на определенный процент (например, 60%) от максимума. Это приводит к тому, что сигнал рассеяния выходит за пределы диапазона, как только GTP добавляется для полимеризации FtsZ. Прежде чем приступать к серии экспериментов, целесообразно сначала выбрать правильное усиление сигнала - детектор высокого напряжения - для максимальной полимеризации.
  3. Запрограммируйте протокол сбора данных. Выберите сбор данных по времени с продолжительностью 3 600 секунд.
  4. Тщательно очистите флуоресцентную кювету водой и этанолом, при необходимости - ультразвуком на водяной бане при комнатной температуре в течение 5 минут. В этом протоколе использовались кюветы с длиной пути 1 см и объемом 200 μл, которые хранились в накопительном растворе (0,5-1% Hellmanex). В качестве альтернативы можно использовать одноразовые УФ-совместимые пластиковые кюветы (UVette, Eppendorf).
  5. Приготовьте 294 мкл исходной смеси полимеризационного буфера (см. пункт подготовки образца 1) с 10 мМ MgCl2 и 12 мкМ FtsZ в качестве конечной концентрации, рассчитанной для 300 мкл, и вортекс.
  6. Перенесите 196 мкл полимеризационного буфера в кювету и поместите его в спектрометр. Выдерживать в течение 2 минут при температуре 30 °C.
  7. Запустите сбор данных и подождите 90 секунд, чтобы убедиться в стабильности сигнала.
  8. Добавьте 4 мкл 100 мМ ГТФ или GDP (конечная концентрация: 2 мМ), чтобы получить конечный объем реакции 200 мкл, пипетируйте вверх и вниз с помощью пипетки большего объема для смешивания и возобновите сбор
    9. .

6. Просвечивающая электронная микроскопия

  1. Подготовьте образцы как для седиментационного анализа FtsZ (конечный объем может быть уменьшен до 10 мкл для экономии материала).
  2. По истечении времени инкубации нанесите 2 мкл образца на тлеющую медную сетку с углеродным покрытием 400 меш, инкубируйте в течение 15 секунд.
  3. Промокните сетку насухо, осторожно коснувшись или перетащив сетку параллельно или перпендикулярно листу фильтровальной бумаги.
  4. Окрасьте сетку 4 мкл 2% раствора уранилацетата. Промокните сетку насухо, как описано в шаге 6.3.
  5. Посмотрите на сетку на электронном микроскопе Philips CM120, работающем на напряжении 120 кВ при 39 200-кратном увеличении.

7. Анализ гидролиза ГТФ

Установка эксперимента разработана таким образом, что гидролиз ГТФ FtsZ останавливается после различных времен реакции путем смешивания реакции с малахитовым зеленым. Таким образом, время развития цвета малахитового зеленого одинаково для каждого образца.

  1. Приготовьте 1,5 мл 2 мМ ГТФ в одном из полимеризационных буферов (см. пробоподготовку, пункт 1).
    Приготовьте стандартное разведение фосфатов 0-40 мкМ в полимеризационном буфере и приготовьте рабочий реагент для зеленого малахита, как описано в наборе POMG-25H (биоанализы). В качестве альтернативы рабочие реагенты могут быть приготовлены собственными силами в соответствии с протоколами, описанными Lanzetta et al.16
  2. Готовим мастер-смеси общим объемом 360 μл:
    я24 мкМ FtsZBs, 20 мМ MgCl2, буфер для полимеризации
    Глава II12 мкМ FtsZEc, 20 мМ MgCl2, полимеризационный буфер
    III (управление 1)24 мкМ FtsZBs, 2 мМ ЭДТА, буфер для полимеризации
    IV (контроль 2)12 мкМ FtsZEc, 2 мМ ЭДТА, полимеризационный буфер
  3. Пипетка 20 мкл аликвот исходных смесей, 100 мкл стандартных фосфатов и 180 мкл 2 мМ ГТФ в 96-луночном планшете для количественной ПЦР в следующем порядке:
    aВСГЕФГЧ
    1Глава IIIГлава IIIяяГлава IVГлава IVГлава IIГлава II
    2Глава IIIГлава IIIяяГлава IVГлава IVГлава IIГлава II
    3Глава IIIГлава IIIяяГлава IVГлава IVГлава IIГлава II
    4Глава IIIГлава IIIяяГлава IVГлава IVГлава IIГлава II
    5Глава IIIГлава IIIяяГлава IVГлава IVГлава IIГлава II
    6Глава IIIГлава IIIяяГлава IVГлава IVГлава IIГлава II
    7Глава IIIГлава IIIяяГлава IVГлава IVГлава IIГлава II
    8Глава IIIГлава IIIяяГлава IVГлава IVГлава IIГлава II
    9ПСПСПСПСПСПСПСПС
    10ПСПСПСПСПСПСПСПС
    11
    12ГТПГТПГТПГТПГТПГТПГТПГТП

    PS - стандарт фосфата
  4. Поместите планшет для количественной ПЦР в ПЦР-машину с программой, установленной на 40-минутный цикл при температуре 30 °C.
  5. Приготовьте 20 мкл аликвот малахитового зеленого рабочего реагента в 96-луночной пластине. Добавьте 60 мкл полимеризационного буфера из эксперимента в полосы 1'-8'. Образец будет разбавлен в 4 раза по сравнению со стандартом фосфата, пожалуйста, учитывайте этот факт при окончательных расчетах.
    aВСГЕФГЧ
    1'Глава IIIГлава IIIяяГлава IVГлава IVГлава IIГлава II
    2'Глава IIIГлава IIIяяГлава IVГлава IVГлава IIГлава II
    3'Глава IIIГлава IIIяяГлава IVГлава IVГлава IIГлава II
    4'Глава IIIГлава IIIяяГлава IVГлава IVГлава IIГлава II
    5'Глава IIIГлава IIIяяГлава IVГлава IVГлава IIГлава II
    6'Глава IIIГлава IIIяяГлава IVГлава IVГлава IIГлава II
    7'Глава IIIГлава IIIяяГлава IVГлава IVГлава IIГлава II
    8'Глава IIIГлава IIIяяГлава IVГлава IVГлава IIГлава II
    9'ПСПСПСПСПСПСПСПС
    10'ПСПСПСПСПСПСПСПС
  6. Добавьте 20 μл GTP в дорожку 1, пипеткой вверх и вниз для смешивания, запустите таймер (это начальная точка времени для 30-минутной реакции).
  7. Через 10 минут, через 30 секунд добавьте ГТФ в дорожку 2, пипетируйте вверх и вниз для смешивания (реакция 20 минут).
  8. Через 16 минут добавьте ГТФ в дорожку 3, пипетируйте вверх и вниз для смешивания (реакция 15 минут).
  9. Через 21 минуту, через 30 секунд добавьте ГТФ на дорожку 4, пипеткой вверх и вниз для смешивания (реакция 10 минут).
  10. Через 25 минут добавьте ГТФ в дорожку 5, пипеткой вверх и вниз для перемешивания (реакция 7 минут).
  11. Через 27 минут, через 30 секунд добавьте ГТФ на дорожку 6, пипетируйте вверх и вниз для смешивания (реакция 5 минут).
  12. Через 29 минут добавьте ГТФ на дорожку 7, пипеткой вверх и вниз для смешивания (реакция 4 минуты
    13. ).
  13. Через 30 минут переведите 20 μл из дорожки 1 в дорожку 1', пипетируйте вверх и вниз для смешивания (начальная точка развития малахитового зеленого цвета для 30-минутной реакции).
  14. Через 30 мин через 30 сек переведите 20 мкл с дорожки 2 на 2', пипеткой вверх и вниз для смешивания (начальная точка развития малахитового зеленого цвета для 20-минутной реакции).
  15. Повторяйте этот шаг для полос движения 3-7 каждые 30 секунд.
  16. Через 33 минуты, через 30 секунд добавьте 20 μл GTP в дорожку 8, пипетируйте вверх и вниз для смешивания и переведите 20 μл в дорожку 8', пипетку вверх и вниз для смешивания (0 минут реакции и начальный момент времени для развития малахитового зеленого цвета для реакции).
  17. Через 34 минуты добавьте 80 μл с полосы 9 по 9', пипеткой вверх и вниз для смешивания (начальная точка времени для развития цвета малахитового зеленого для фосфатного стандарта 1).
  18. Через 34 мин 30 сек переведите 80 мкл с дорожки 10 на 10', пипетируйте вверх и вниз для смешивания (начальная точка времени для развития цвета малахитового зеленого для фосфатного стандарта 2).
  19. Удалите из образцов все пузырьки воздуха и выдержите планшет при комнатной температуре еще 25 минут 30 секунд.
  20. Поместите планшет в 96-луночный считыватель планшетов.
  21. Через 60 минут измеряйте пластину 10 раз в 30 секунд на длине волны 630 нм (раскрытие цвета малахитового зеленого цвета теперь составляет 30 минут для первой реакции). Каждое измерение соответствует каждой временной точке из шагов 7.6-7.12 и 7.16 и должно быть рассчитано отдельно во время анализа данных.
  22. Рассчитайте содержание свободных фосфатов в каждом образце с помощью стандартной калибровочной кривой фосфатов.
  23. Отобразите данные в виде выделения фосфатов с течением времени и рассчитайте активность гидролиза FtsZ GTP из линейного диапазона кривой.

Результаты

Методы очистки FtsZ из различных бактериальных источников были описаны в литературе и обобщены в таблице 1.

ИсточникМетодМодификацияПолученный выход [мг/л культуры]>Ссылки
B. subtilis1) Высаливание сульфатом аммония/ионообменная хроматографиянет40Данная работа, 11,15
2) Аффинная хроматографияHis-tagНД17
E. coli1) Высаливание сульфатом аммония/ионообменная хроматографиянет35Данная работа, 11,15
2) Осаждение кальцием, ионообменная хроматографиянет4018
Methanococcus jannaschii1) Аффинная хроматография в денатурирующих условиях/рефолдинг/высаливание сульфатом аммония/гель-фильтрацияHis-tag1.319
2) Аффинная хроматография/гель-фильтрацияHis-tagНД20
Thermotoga maritimaИонообменная хроматография/гель-фильтрациянет6.719
Pseudomonas aeruginosaАффинная хроматография/гель-фильтрацияStrep-tag, His-tagНД21
Mycobacterium tuberculosis1) Аффинная/ионообменная хроматографиянетНД22
2) Аффинная хроматография/гель-фильтрациянет3023
Aquifex aeolicusАффинная хроматография/гель-фильтрацияHis-tag, C-терминальная трункация (331-367)НД24
Caulobacter crescentusИонообменная хроматография/высаливание сульфатом аммония/гель-фильтрациянетНД25

Таблица 1. Описание протоколов очистки FtsZ. ND: не определено.

Седиментация полимеров FtsZ

Первоначально для осаждения полимеров FtsZ мы использовали две разные скорости центрифугирования. Было обнаружено, что только при ускорении 350,000 x g осаждаются одиночные полимеры FtsZEc (Рисунок 1), тогда как при 190,000 x g в осадке присутствуют только пучки FtsZBs (данные не представлены). Таким образом, в последующих экспериментах использовалось ускорение 350,000 x g. Процент полимеризованных FtsZEc и FtsZBs при 50 mM KCl был схожим, несмотря на то, что эксперименты по светорассеянию выявили гораздо более сильный сигнал рассеяния для FtsZBs. Это обусловлено образованием пучков FtsZBs, которые рассеивают свет сильнее, чем одиночные полимеры FtsZEc. В эксперименте с 300 mM KCl не удалось получить большое количество полимеров FtsZ в осадке как для FtsZEc, так и для FtsZBs (Рисунок 1). Мы связываем это с сочетанием быстрой разборки структур FtsZ и снижением степени объединения филаментов в пучки.

Седиментация трубок FtsZ-SepF

Для анализа взаимодействия FtsZ с определенными активаторами можно проводить анализы седиментации при более низких скоростях центрифугирования. При такой скорости в осадок могут попасть только крупные структуры FtsZ, например, крупные трубочки, образуемые кольцами SepF и филаментами FtsZBs5, или пучки, образованные FtsZ и ZapA. Мы использовали центрифугирование при более низкой скорости (24,600 x g), чтобы продемонстрировать применимость этого подхода для трубочек, образованных FtsZ и SepF. FtsZ обнаруживался в осадке выше фонового уровня только при наличии в образце и SepF, и GTP (Рисунок 2), при этом присутствие SepF не влияет на ГТФазную активность FtsZ7, что свидетельствует о полной активности FtsZ в присутствии SepF. Специфическая седиментация SepF и FtsZ составляет примерно 45% от общего количества SepF и 15% от общего количества FtsZ (по сравнению с материалом, осаждающимся при добавлении GDP). Это показывает, что трубочки SepF-FtsZ содержат больше SepF, чем FtsZ. Вероятно, это связано с тем, что многие кольца SepF организуют трубочки FtsZ-SepF5,7. Точная стехиометрия SepF-FtsZ в этих трубочках неизвестна, но наши результаты позволяют предположить, что SepF присутствует в большем количестве, чем FtsZ.

Свойства полимеризации и образования пучков FtsZEc и FtsZBs

Для характеристики эффективности полимеризации FtsZBs и FtsZEc в различных буферах мы проанализировали оба белка методом светлового рассеяния под углом 90°. При 50 mM KCl FtsZBs дает сигнал светлового рассеяния в 20–40 раз выше, чем FtsZEc, в зависимости от pH буфера (рисунки 3A и B), что подтверждает результаты Buske et al.26 Увеличение концентрации KCl в буфере не оказало существенного влияния на сигнал светлового рассеяния FtsZEc (рисунок 3D), однако сигнал FtsZBs снизился примерно в 80 раз при pH 7,5, в 30 раз при pH 6,8 и в 45 раз при pH 6,5 в 300 mM KCl (рисунок 3C) по сравнению с буферами с 50 mM KCl (рисунок 3A). Деполимеризация полимеров FtsZ происходит быстрее при более высокой концентрации KCl для обоих белков (рисунки 3C и D). Исследования Pacheco-Gómez et al. показывают, что полимеризация и формирование пучков FtsZ E. coli зависят от pH. Авторы обнаружили, что в буфере с 50 mM KCl сигнал светлового рассеяния при полимеризации FtsZ был выше, а деполимеризация FtsZ занимала больше времени при pH 6,0 по сравнению с pH 7,0 8. Эти результаты не согласуются с нашими данными по полимеризации FtsZEc при 50 mM KCl (рисунок 3B), однако следует отметить, что мы использовали три различных буфера (HEPES, MES и PIPES), в то время как Pacheco-Gómez et al. использовали только MES. Таким образом, при 50 mM KCl на кинетику полимеров FtsZ влияет не только pH, но и состав буфера (ионная сила). Тем не менее, при 300 mM KCl ни состав буфера, ни pH не оказывали обнаруживаемого влияния на сборку FtsZEc.

Эксперимент по светорассеянию FtsZBs в буферах без KCl провести не удалось из-за преципитации белка в этих условиях. При снижении концентрации FtsZBs до 3 µM преципитация не наблюдалась. Однако 3 µM не является физиологической концентрацией FtsZ в клетке. В пластиковых кюветах FtsZBs не выпадал в осадок при концентрации 12 µM и pH 7.5, но при pH 6.8 и 6.5 FtsZ все равно преципитировал в отсутствие KCl.

Морфология структур FtsZ из E. coli и B. subtilis

Структуры, образованные FtsZ, исследовали с помощью ПЭМ. В всех буферах при низкой концентрации соли FtsZBs собирались в плотно упакованные полимеры, покрывавшие всю сетку (Рисунки 4A-C). FtsZEc во всех буферах при низкой концентрации соли образовывали длинные филаменты, кабели и пучки (Рисунки 4D-F). Однако наблюдаемое количество полимеров, образованных FtsZEc, было меньше, чем количество полимеров, образованных FtsZBs. В буферах с высокой концентрацией соли FtsZBs формировали более длинные одноцепочечные протофиламенты, которые не объединялись в пучки (Рисунки 4G-I). В то время как протофиламенты FtsZBs меняли структуру при более высокой концентрации соли, FtsZEc образовывали структуры, неотличимые от структур в буфере с низкой концентрацией соли (Рисунки 4J-L). Заметного влияния pH на полимеризацию FtsZEc не наблюдалось, но FtsZBs образует больше пучков при pH 6.5, которые видны как плотно упакованные полимеры и пласты (Рисунок 4B). Эти результаты согласуются с нашими экспериментами по светорассеянию и ранее опубликованными работами по ПЭМ8,11,26.

ГТФазная активность FtsZ при высоких и низких концентрациях KCl

Активность гидролиза GTP белком FtsZ измеряли при различных условиях с помощью колориметрического анализа на свободный фосфат. Как сообщалось ранее15, ГТФазная активность FtsZ возрастала при увеличении концентрации KCl: в зависимости от используемого буфера активность FtsZBs увеличивалась в 3–7 раз, а активность FtsZEc — в 1,5–2,5 раза при 300 mM KCl по сравнению с 50 mM KCl. Снижение ГТФазной активности при 50 mM KCl обусловлено образованием пучков филаментов FtsZBs. При 50 mM KCl ГТФазная активность FtsZEc была в 3–6 раз выше, чем у FtsZBs, что объясняется более быстрым распадом полимеров FtsZEc. Разница в активности гидролиза GTP между FtsZBs и FtsZEc сокращалась при 300 mM KCl, вероятно, из-за уменьшения образования пучков филаментов FtsZBs (Рисунок 5).

Полимеризация FtsZ, анализ % осадка, столбчатая диаграмма, гель-электрофорез, сравнение эффекта GTP/GDP.
Рисунок 1. Количественное определение полимеризации FtsZ методом седиментации. (A) Полимеризация 12 µM FtsZ проводилась в присутствии 2 mM GTP или GDP при pH 7,5 (черные столбцы), 6,8 (серые столбцы) или 6,5 (белые столбцы). Количество осажденного белка определяли с помощью денситометрического анализа гелей, окрашенных кумасси. GDP использовали в качестве контроля специфичности седиментации; для получения значений, представленных на графике, процент осажденного FtsZ в присутствии GDP вычитали из процента осажденного FtsZ в присутствии GTP. Слева: седиментация FtsZ при 50 mM KCl, справа: седиментация FtsZ при 300 mM KCl. (B) Репрезентативные результаты электрофореза в гелях, окрашенных кумасси. Полимеризация FtsZBs (верхний гель) и FtsZEc (нижний гель) при 50 mM KCl. (S) супернатант, (P) фракции осадка из эксперимента. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

График взаимодействия FtsZ и SepF и гель, показывающий влияние GTP/GDP на процент белка в осадке.
Рисунок 2. Седиментация трубок SepF/FtsZ при низкой скорости. (A) 12 µM FtsZBs полимеризовали с 2 mM GDP (белые столбцы) или GTP (черные столбцы). Количество осажденного белка определяли с помощью денситометрического анализа гелей, окрашенных кумасси. Знаки + и - под осью x указывают на наличие или отсутствие FtsZ и SepF в реакции. (B) Репрезентативные результаты геля, окрашенного кумасси. Полимеризация FtsZBs в присутствии и отсутствии SepF. В качестве контроля использовали SepF без FtsZ. Полимеризацию проводили с GTP и GDP. (S) супернадант, (P) фракции осадка из эксперимента. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Графики светорассеяния FtsZ при различных концентрациях KCl; показано влияние pH 6,5, 6,8, 7,5.
Рисунок 3. Светорассеяние 12 μM FtsZEc и 12 μM FtsZBs. Сборка FtsZ проводилась в присутствии 2 mM GTP; полимеризация контролировалась методом светорассеяния под углом 90°. Полимеризация FtsZBs (A) и FtsZEc (B) при 50 mM KCl при pH 7,5, pH 6,8, pH 6,5. Полимеризация FtsZBs (C) и FtsZEc (D) при 300 mM KCl при pH 7,5, pH 6,8 и pH 6,5. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Электронная микроскопия полимеров FtsZ при различных значениях pH и концентрациях KCl; структурный анализ.
Рисунок 4. Структуры полимеров FtsZBs и FtsZEc, визуализированные с помощью электронной микроскопии. (A-L) Изображения 12 µM FtsZBs (A-C и G-I) и FtsZEc (D-F) и (J-L), полимеризованных с 2 mM GTP. (A-C) FtsZBs в буфере с 50 mM KCl и pH 7.5, 6.8 и 6.5 соответственно. (D-F) FtsZEc в буфере с 50 mM KCl и pH 7.5, 6.8 и 6.5 соответственно. (G-I) FtsZBs в буфере с 300 mM KCl и pH 7.5, 6.8 и 6.5 соответственно. (J-L) FtsZEc в буфере с 300 mM KCl и pH 7.5, 6.8 и 6.5 соответственно. Масштабная линейка: 100 nm. Нажмите здесь для просмотра изображения в большем размере.

График ГТФазной активности; столбчатая диаграмма FtsZ при 50 мМ против 300 мМ KCl, вариации pH 7,5, 6,8, 6,5.
Рисунок 5. Гидролиз ГТФ при полимеризации FtsZ в 6 различных буферах.Во всех экспериментах использовали 2 mM GTP. В качестве контроля использовали образец без MgCl2. Активность FtsZ без MgCl2 была вычтена из активности FtsZ в присутствии MgCl2. Слева: ГТФазная активность FtsZ при 50 mM KCl, справа: ГТФазная активность FtsZ при 300 mM KCl. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенное изображение.

Обсуждение

Мы описываем набор методов, позволяющих быстро проанализировать активность FtsZ и его взаимодействие с другими белками. Для изучения полимеризации FtsZ широко используются методы рассеяния света, седиментации и анализа ГТФазы, а также электронная микроскопия. Мы внесли некоторые улучшения в существующие протоколы, мы показали влияние различных условий на сборку FtsZ, и мы предлагаем контроль, который должен быть включен в исследования FtsZ.

Мы применяем низкоскоростное центрифугирование, чтобы отличить крупные структуры, образованные ассоциацией между FtsZ и взаимодействующими с ним белками, от полимеров FtsZ. Этот метод имеет два преимущества по сравнению со стандартным методом осаждения. Во-первых, полимеры FtsZ не образуют фона в гранулированной фракции, поскольку они не раскручиваются вниз при 24 600 x g. Во-вторых, количество FtsZ, присутствующего в структуре, образованной взаимодействующим белком, может быть рассчитано по гелю. Двумя важнейшими этапами в этом методе являются время инкубации и концентрация ГТФ. Важно центрифугировать крупную белковую структуру, когда она завершена, но до того, как она разберется, когда весь ГТФ гидролизуется. Лучшим контролем для данного исследования является полимеризация FtsZ с GDP. Существует одно потенциальное ограничение анализа. FtsZ образует стабильный комплекс с SepF, который может быть легко раскручен при 24 600 x g. Если проводится осаждение другим активатором или препаратом, связывающим полимеры FtsZ, может потребоваться адаптация анализа. Это может быть сделано путем изменения времени инкубации, либо увеличения скорости центрифугирования.

Правильная подготовка образца является наиболее важной для экспериментов по рассеянию света. Белки должны быть предварительно очищены путем прядения, а все буферы должны быть отфильтрованы перед использованием. Если в образце присутствуют какие-либо агрегаты, они нарушат стабильный сигнал, полученный от полимеров FtsZ. Для анализа структур FtsZ методом электронной микроскопии основным этапом является подготовка сетки. Время инкубации образца на сетке будет иметь эффект получения более или менее уплотненных полимеров. Для пучков FtsZB время инкубации должно быть короче, чем для FtsZEc и FtsZBs при высокой концентрации KCl. Мы использовали концентрацию 12 мкМ для каждого образца, чтобы иметь возможность сравнить результаты. Однако для FtsZBs при концентрации 50 мМ KCl следует использовать более низкую концентрацию FtsZ, так как 12 мкМ приводит к полному насыщению сетки. Это делает полимеры сильно уплотненными и их трудно обнаружить. Менее уплотненные полимеры лучше обнаруживать на ЭМ.

Анализ ГТФазы является единственным экспериментом, используемым для изучения активности, а не структуры FtsZ. Mg2+ необходим для оборота ГТФ в полимерах FtsZ. Таким образом, в отсутствие Mg2+ FtsZ не гидролизует ГТФ. Таким образом, образец без Mg2+ является правильным контролем в этом анализе, но катионы Mg присутствуют в буфере хранения FtsZ. Они могут быть удалены путем добавления 1 мМ ЭДТА к контрольному образцу. Критическим этапом в этом анализе является время инкубации. Важно прекратить активность FtsZ через определенное время. Это достигается путем переноса образца FtsZ в зеленый раствор малахита в 96-луночном планшете. Однако освоение цвета малахитового зеленого цвета является непрерывным процессом. Таким образом, измерения должны проводиться в одно и то же время для каждого образца. Используя хорошо спланированный протокол добавления ГТФ с измерениями, проводимыми каждые 30 секунд в установленном порядке, можно получить одинаковое время инкубации и обработки образца для каждой временной точки. Еще одним важным этапом является выбор концентрации белка для эксперимента. В эксперименте мы использовали две разные концентрации для FtsZ,Ec и FtsZBs. Гидролиз ГТФ для FtsZEc намного быстрее по сравнению с FtsZBs. Активность ГТФазы FtsZEc при выбранных условиях и при 12 мкМ линейна только в течение максимум 5 мин, после чего скорость гидролиза выходит на плато. Таким образом, трудно интерпретировать данные эксперимента, когда он проводился в этих условиях. В этом случае FtsZEc необходимо использовать в более низкой концентрации, чем FtsZBs , чтобы иметь возможность сравнить активность обоих белков. Активность ГТФазы FtsZs из разных источников может различаться. Таким образом, необходимо правильно подобрать концентрацию. Концентрация для полимеризации FtsZ должна быть значительно выше критической концентрации (в общем случае от 2,5-10 мкМ). Также важна динамика сборки и разборки FtsZ. Некоторые белки демонстрируют значительную задержку в полимеризации после добавления ГТФ, как показано для FtsZB при концентрации 50 мМ KCl. Перед анализом ГТФазы полезно провести анализ рассеяния света, чтобы приблизить время сборки и разборки полимеров FtsZ. После этого можно выбрать время инкубации и концентрацию белка. Поскольку условия, выбранные для полимеризации FtsZ, имеют решающее значение, важно использовать правильную концентрацию pH и KCl в каждом методе. В данной работе мы изучили 9 различных буферов с pH в диапазоне от 6,5 до 7,5 и концентрацией KCl от 0 М до 300 мМ. Мы заметили, что наилучшим состоянием для анализа FtsZs из B. subtilis и E.coli и их биологической активности является рН, близкий к физиологическому уровню (7,5), в сочетании с высокой концентрацией KCl. При высокой концентрации KCl FtsZ обладает более высокой активностью ГТФазы и образует полимеры, которые лучше обнаруживаются с помощью электронной микроскопии. Мы также подтвердили, что физиологический pH и высокая концентрация KCl лучше подходят для изучения взаимодействия между FtsZ и регуляторными белками, чем любые другие буферы, в основном используемые для изучения сборки FtsZ. FtsZBs проявляет аналогичную активность FtsZEc при изучении при высокой концентрации KCl. Кроме того, при низкой концентрации соли влияние pH более заметно, чем в буферах с высокой концентрацией солей. FtsZ иногда выпадает в осадок при использовании буферов без KCl, в результате следует избегать буферов без соли. Осаждение полимеров FtsZ низкое при использовании буферов с высокими концентрациями KCl. Это может быть преимуществом при изучении взаимодействий между FtsZ и белками, которые собирают филаменты FtsZ, такими как SepF и ZapA, поскольку эти структуры более высокого порядка легко обнаружить с помощью центрифугирования. Во всех наших экспериментах мы использовали MgCl2 в концентрации 10 мМ. Показано, что относительно высокая концентрация Mg2+ стабилизирует полимеры FtsZ и снижает активность ГТФазы FtsZ. В таблице 2 обобщены результаты различных исследований, описывающих полимеризацию FtsZ и активность ГТФазы при различных концентрациях Mg2+ с использованием идентичных в остальном буферных условий 27. Измеренная концентрация свободного цитоплазматическогоMg2+ составляет 0,9мМ3. Следует отметить, что ГТФ хелатирует эквивалентное количество Mg2+. Таким образом, оптимальная концентрация Mg2+ для экспериментов с ГТФазой составляет около 2-2,5 мМ, что близко к физиологическому уровню3. Однако в наших экспериментах мы использовали MgCl2 в концентрации 10 мМ для получения легко обнаруживаемого сигнала светорассеяния и стабилизации полимеров FtsZ во время седиментационного анализа.

Несмотря на то, что мы применили наши протоколы к FtsZ от модельных организмов E. coli и B. subtilis, они могут быть адаптированы к FtsZ от любого другого организма. Следует отметить, что физиологический рН и концентрации одновалентных и двухвалентных катионов различаются в зависимости от организма. Таким образом, оптимальные условия полимеризации FtsZ могут варьироваться. Различия во времени удвоения и условиях роста разных бактерий могут приводить к разной кинетике сборки FtsZ и оптимальным условиям экспериментов. Тем не менее, наш протокол является хорошей отправной точкой для экспериментов с FtsZs из других организмов. Протоколы должны быть полезны для изучения FtsZ с регуляторными белками или изучения влияния малых соединений и лекарств на FtsZ.

ИсточникПолимеризация [% осажденного FtsZ]ГТФаза [Pi/FtsZ/мин]Концентрация Mg2+ [мМ]Концентрация ftsZ [μM]Ссылки
FtsZEc~ 28%~ 2.11012Эта работа
~ 50%~ 2.41012.527
~ 43%~ 3.5512.527
~ 27%~ 4.62.512.527
НД~ 5.42.5526
FtsZBs~ 30%~ 0.812Эта работа
~ 52% (с ДЭЭ декстраном)~ 0,5101011
НД~ 2.252.5526

Таблица 2. Влияние Mg2+ на полимеризацию FtsZ и ГТФазу. Результаты этой работы в сравнении с опубликованными данными. Все эксперименты проводились при 50 мМ MES/NaOH, pH=6,5, 50 мМ KCl.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируется.

Благодарности

Работа в нашей лаборатории финансируется грантом VIDI от Нидерландской организации научных исследований (для DJS). Мы благодарим Марка Стюарта и кафедру электронной микроскопии нашего университета за помощь и предоставление доступа к просвечивающему электронному микроскопу.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
GTPRoche10106399001Часть 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Толстостенные поликарбонатные трубкиBeckman Coulter343776Часть 2
Ультрацентрифуга Optima MAX-XPBeckman Coulter393315Часть 2, 3
Полиалломеровая трубка с защелкивающейся крышкойBeckman Coulter357448Часть 3
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FLRaytest Isotopenmessgerä te GmbH15000001Часть 4
Анализатор люминесцентного изображения LAS-4000FujifilmЧасть 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Люминесцентный спектрометрSpectronic InstrumentsЧасть 5
Флуоресцентная ячейкаHellma Analytics105-250-15-40Часть 5
квадратная 400 меш, медь, 100/флаконЭлектронная микроскопия SciencesG400-CuЧасть 6
CM120 Электронный микроскоп, работающий при напряжении 120 кВPhilipsЧасть 6
96 мл x 0,2 мл ПластинаBIOplasticsB70501Часть 7
Набор для анализа малахитового зеленого фосфатаБиопробирная системаPOMG-25HЧасть 7
PowerWave HT Микропланшетный спектрофотометрBioTekЧасть 7

Ссылки

  1. Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
  2. Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).
  3. Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).
  4. Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).
  5. Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ. PLoS One. 7 (8), e43293(2012).
  6. Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length. J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).
  7. Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation. EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).
  8. Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ. PLoS One. 6 (6), e19369(2011).
  9. Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin. J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).
  10. Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations. FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).
  11. Scheffers, D. J. The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA. FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).
  12. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).
  13. Chen, Y., Erickson, H. P. Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).
  14. Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering. J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).
  15. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis. EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).
  16. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).
  17. Ray, S., Kumar, A., Panda, D. GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division. Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).
  18. Rivas, G., Lopez, A., et al. Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly. J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).
  19. Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. Structural insights into FtsZ protofilament formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).
  20. Lowe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
  21. Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).
  22. Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).
  23. White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).
  24. Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. Structural insights into the conformational variability of FtsZ. J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).
  25. Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  26. Buske, P. J., Levin, P. A. Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins. J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).
  27. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).

Перепечатки и разрешения

Теги

Escherichia coliBacillus subtilis
FtsZ полимеризации Анализы: Простые протоколы и соображения
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.