Методическая статья

Установление минимальной бактерицидной концентрации противомикробного агента для планктонных клеток (MBC-P) и биопленочные клетки (MBC-B)

DOI:

10.3791/50854

⸱

2 января 2014 г.

1Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол позволяет проконтриктное и биопленоконное сопротивление бактериальному штамму, который может образовывать биопленку in vitro с помощью 96-ну микротитрной пластины. Планктонные или биопленопленовиты подвергаются серийным разбавлениям противомикробного агента по выбору. Жизнеспособность можно посвястить росту на агарных пластинах.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол позволяет пропрямить сопротивление планктонного и биопленки бактериальному штамму, который может образовывать биопленку in vitro. Бактерии прививаются в колодцы 96-ну микротитр пластины. В случае планктонного анализа к бактериальным суспензиям добавляются серийные разбавления противомикробного агента по своему выбору. В анализе биопленки, после прививки, бактерии остаются для формирования биопленки в течение определенного периода времени. Из колодцев удаляются незакрепленные клетки, пополняются средства массовой информации и добавляются серийные разбавления антимикробного агента по выбору. После воздействия противомикробного агента, планктонные клетки проецированы для роста. Для анализа биопленки, средства массовой информации обновляется со свежими средствами массовой информации не хватает противомикробного агента и биопленки клетки остаются для восстановления. Жизнеспособность биопленоплено-клеток анализуется после периода восстановления. MBC-P для противомикробного агента определяется как самая низкая концентрация препарата, который убивает клетки в планктонной культуре.  В отличие от этого, MBC-B для штамма определяется путем подвергая предварительной биопленки для увеличения концентрации противомикробного агента в течение 24 часов. MBC-B определяется как самая низкая концентрация противомикробного агента, который убивает клетки в биопленки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ устойчивости к антибиотикам был первоначально разработан для анализа устойчивости планктонных (свободно плавающих) культур бактерий. Поскольку многие бактериальные инфекции связаны с биопленкой (поверхностными клетками), мы были заинтересованы в разработке метода анализа биопленки-специфической устойчивости к антибиотикам. Тем не менее, большинство анализов устойчивости к антибиотикам плохо подходят для измерения устойчивости биопленок. Например, определение минимальной ингибирующей концентрации (ВПК) является золотым стандартом для определения устойчивости к антибиотикам планктонных бактериальных культур 1. Этот анализ влечет за собой смешивание разбавленной планктонной культуры с разбавляя ряд антибиотиков.  Концентрация антибиотика, который подавляет видимый рост планктонных клеток является MIC. Поскольку этот анализ опирается на ингибирование роста, по определению, он не может работать с культурами биопленки, что требует изучения чувствительности клеток к антибиотикам в предварительной биопленки. Вместо измерения ингибирования роста, анализ MBC-B, описанный здесь, определяет концентрацию антибиотика, который убивает клетки, уже существующие в биопленки. Таким образом, этот анализ направлен на имитацию лечения антибиотиками установленных биопленоплено инфекций, и обеспечить более релевантное представление о бактериальной устойчивости к антибиотикам in vivo.

Поскольку биопленки, как правило, более устойчивы к антибиотикам, чем планктонные культуры 2-4, необходимо было разработать метод, который непосредственно связывает устойчивость к антибиотикам биопленки с планктонной культурой. Таким образом, еще одна цель этого метода заключается в том, чтобы иметь возможность напрямую сравнить уровень устойчивости к антибиотикам между планктонными и биопленочные клетки. Анализы MBC-P и MBC-B, описанные здесь, делают это возможным, потому что клетки культуризуются в аналогичных условиях. Мы использовали этот метод для изучения нескольких генов, которые имеют важное значение для биопленки конкретных устойчивости к антибиотикам 5-8 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MBC-B

  1. Выращивание биопленки (адаптировано от O'Toole9).
    1. Выращиваем культуру дикого типа штамма интереса и мутантного штамма в течение 16 часов в богатой среде при 37 градусах Цельсия.
    2. Разбавить насыщенных ночных культур 1:100 в свежей среде для анализа устойчивости к антибиотикам. Стандартной средой для P. aeruginosa является минимальная среда M63, дополненная сульфатом магния и аргинином (см. таблицу 1). Эта среда стимулирует образование более надежной биопленки.
    3. Добавьте 100 мкл разбавления на колодец в блюде из микротитров 96-колодец (см. таблицу 1). Так как эти анализы, как правило, выполняются в три раза для каждого штамма, должно быть 24 скважин каждого штамма.
    4. Инкубировать пластину микротитр в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию.
  2. Воздействие предварительной биопленки на градиент концентрации антибиотиков
    1. Приготовьте 10-х разбавляя ряд антибиотиков для 7 скважин. Пример: для антибиотика тобрамицин, окончательные концентрации в скважинах 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125, и 0,006 мг / мл 5-8 . Из бульона 25 мг/мл приготовьте 10x разбавления 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 и 0,06 мг/мл. Оставьте на льду.
    2. Удалите оттягченный супернатант (содержащий планктонные клетки) с помощью многоканальной пипетки (см. таблицу 1).
    3. Добавьте 90 хл M63 (Mg/Arg) ко всем скважинам.
    4. Добавьте 10 мкл из каждой 10-х концентрации антибиотиков для достижения желаемых окончательных концентраций. Добавьте 10 мл воды (без контроля антибиотиков) к окончательному хорошо для каждого репликации и деформации.
    5. Инкубировать пластину микротитр в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию.
  3. Обновление средств массовой информации и предоставление отряда живых клеток.
    1. Удалите оттяченный супернатант (содержащий планктонные клетки) с помощью многоканальной пипетки.
    2. Добавьте 115 мкл M63 (Mg/Arg) ко всем скважинам.
    3. Инкубировать пластину микротитр в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию.
  4. Анализ живых клеток.
    1. Этикетка две пластины LB агар на 96-ну микротитр пластины.
    2. Стерилизовать устройство с мультипронгом (см. таблицу 1),окунув зубцы в 100% этанола и пройдя зубцы через открытое пламя горелки Bunsen. повторять. Пусть зубцы немного остыть. Используя устройство с мультипронгом, перенесите 3 мкл (количество, которое обычно сохраняется на кончиках зубцов) планктонной культуры из каждой колодец пластины микротитров на поверхность пластины LB agar.
    3. Инкубировать пластины LB агар в течение 16 часов при 37 градусов по Цельсию.
    4. Определите минимальную бактерицидную концентрацию антибиотика, определив, глаз, отрез для роста бактерий(рисунок 1).

2. MBC-P

  1. Подготовка бактериальных штаммов
    1. Выращиваем культуру дикого типа штамма интереса и мутантного штамма в течение 16 часов в богатой среде при 37 градусах Цельсия.
    2. Разбавить насыщенных ночных культур 1:100 в свежей среде для анализа устойчивости к антибиотикам. Стандартной средой для P. aeruginosa является минимальная среда M63, дополненная сульфатом магния и аргинином (см. таблицу 1).
    3. Добавьте 90 мкл разбавления на колодец в блюде из микротитров 96-колодец (см. таблицу 1). Так как эти анализы, как правило, выполняются в три раза для каждого штамма, должно быть 24 скважин каждого штамма.
  2. Воздействие планктонных клеток на концентрационный градиент антибиотиков
    1. Подготовка 10x разбавления серии антибиотиков для 7 скважин. Пример: для антибиотика тобрамицин, окончательные концентрации в скважинах 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 и 0,0005 мг/мл. Из бульона 25 мг/мл, подготовить разбавления 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 и 0,005 мг/мл. Оставьте на льду.
    2. Добавьте 10 мкл из каждой 10-х концентрации антибиотиков для достижения желаемых окончательных концентраций. Добавьте 10 мл воды (без контроля антибиотиков) к окончательному хорошо для каждого репликации и деформации.
    3. Инкубировать пластину микротитр в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию.
  3. Анализ живых клеток.
    1. Этикетка две пластины LB агар на 96-ну микротитр пластины.
    2. Стерилизовать устройство с мультипронгом (см. таблицу 1),окунув зубцы в 100% этанола и пройдя зубцы через открытое пламя горелки Bunsen. повторять. Пусть зубцы немного остыть. Используя устройство с мультипронгом, перенесите 3 мкл (количество, которое обычно сохраняется на кончиках зубцов) планктонной культуры из каждой колодец пластины микротитров на поверхность пластины LB agar.
    3. Инкубировать пластины LB агар в течение 16 часов при 37 градусов по Цельсию.
    4. Определите минимальную бактерицидную концентрацию антибиотика, определив, глаз, отрезанный для роста бактерий(рисунок 2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Были проведены анализы MBC-P и MBC-B, сравнивая чувствительность дикого типа PA14 с PA14 ∆ndvB. Тобрамицин использовался в качестве антибиотика. Представлены результаты, соответствующие шагу 1.4.4(рисунок 1)и шагу 2.3.4(рисунок 2). PA14 и ∆ndvB были привиты в MBC-P и MBC-B анализы в три раза. После завершения шагов 1.0-1.4 протокола MBC-B и шагов 2.0-2.3 протокола MBC-P, жизнеспособные ячейки были поцарапывались на пластине Агара LB. Концентрации тобрамицина

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Устойчивость к антибиотикам в планктонных клетках определяется как увеличение минимальной ингибирующей концентрации (ВПК) антибиотика из-за постоянного изменения клеток(например, мутации). Выявленные на сегодняшний день механизмы биопленки или толерантности являются результатом экспрессии генов дикого типа в биопленки. Таким образом, классическое определение резистентности не применяется к биопленки. Тем не менее, был представлен другой набор определений: механизмы устойчивости не позволяют антибиотику получить ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор заявляет, что у нее нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор хотел бы поблагодарить Ли Чжан, Сянь-Чжи Ли, Аарона Хинца и Клейтона Холла за редакционную помощь в этой рукописи. Этот анализ был первоначально разработан в лаборатории Джорджа О'Тула, Гейзельской медицинской школы в Дартмуте. Исследования в лаборатории доктора Ма поддерживается грантами от Природных наук и Инженерных исследований Совета Канады и муковисцидоз Канады.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<с>1х  M63

Prepare as a 5x  Бульон M63 путем растворения 15 г KH2PO4, 35 г K2HPO4 и 10 г (NH4)2SO4 в 1 л воды. Этот бульон не нуждается в автоклавной обработке и может храниться при комнатной температуре. Разбавить 5х  сток 1:5, автоклав, охладить, затем добавить нужные компоненты.

<>KH<>2PO4

Fisher

P285-500

<		p>

K2HPO4

Фишер

P288-500

(NH4)2SO4

Sigma

A5132

Magnesium sulfate

Fisher

M63-500

<		p>Добавить к 1 mM конечной концентрации.  Приготовьте как бульон 1 М в воде и автоклаве.
<>тобрамицин Сигма<выравнивать="центр> <>Приготовьте 50 мг/м&нбл; запас. Aliquot и хранить по адресу -20°C.

Arginine

Sigma

A5131

<		p>Добавить до 0,4% конечной концентрации.  Подготовить как 20% бульон в воде и процедить стерилизовать. Этот альтернативный источник углерода/энергии может заменить глюкозу и казаминокислоты

96-луночные микротитровые пластины

Corning

3595

Стерильный, плоскодонный, с низким испарением

Tranferpette (многоканальная пипетка)

BrandTech

2703610

8-канальный, 20-200 μ l

Multiprong device

Dan-Kar

MC48

48 зубцов входят в ½ 96-луночного микротитровального планшета

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).
  2. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  3. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
  4. Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
  5. Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
  6. Zhang, L., Mah, T. F. The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics. J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).
  7. Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance. J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).
  8. Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
  9. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).
  10. Lewis, K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).
  11. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. 31, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2011).
  12. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.1.1-1B.1.17 (2005).
  13. Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

96LB

Похожие статьи