Методическая статья

Дистанционное Магнитный Приведение в микрометрической зондов для

8.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50857

⸱

2 мая 2014 г.

 ,  ,  ,  , 
1Physicochime Curie, CNRS UMR 168, Institut Curie, Sorbonne Universités, UPMC, 2Unité de Génétique des Biofilms, Institut Pasteur, 3Laboratoire Jean Perrin, CNRS UMR 8237, Sorbonne Universités, UPMC

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе показано оригинальную методологию, основанную на пульте дистанционного приведения в действие магнитных частиц, посеянных в бактериальной биопленки и развитие специализированных магнитных пинцетом для измерения на месте местные механические свойства комплексной жилой материала построен микроорганизмов на границах.

Аннотация

Бактериальной адгезии и роста на интерфейсах привести к образованию трехмерных гетерогенных структур так называемых биопленки. Клетки, живущие в этих структурах скрепляются физических взаимодействий, опосредованных сети внеклеточных полимерных веществ. Бактериальные биопленки влиять на многие виды деятельности человека и понимание их свойств имеет решающее значение для лучшего контроля их развития - сохранение или ликвидация - в зависимости от их отрицательное или положительное исходом. Эта статья описывает новую методологию, направленную для измерения на месте местные физические свойства биопленки, которая была, до сих пор рассматривалось только от макроскопического и однородного материального точки зрения. Эксперимент, описанный здесь включает введение магнитных частиц в растущую биопленки, чтобы отобрать местные зондов, которые могут быть дистанционным управлением, не нарушая структурные свойства биопленки. Выделенные магнитные пинцет были развивприпрыжку приложить определенное усилие на каждой частице, встроенного в биопленки. Установка монтируется на этапе микроскопом, чтобы включить запись покадровой изображений на период частиц потянув. Траектории частиц затем извлекают из тянущего последовательности и местные вязкоэластичные параметры выводятся из каждой кривой частиц смещения, тем самым обеспечивая 3D-пространственное распределение параметров. Получение взглянуть на биопленки механической профиль имеет важное значение с точки инженера зрения для целей контроля биопленки, но и с фундаментальной точки зрения, чтобы уточнить связь между архитектурными свойствами и конкретного биологии этих структур.

Введение

Бактериальные биопленки сообщества бактерий, связанных с биологическими или искусственных поверхностей 1-3. Они образуют с помощью механизма адгезии роста в сочетании с производством полисахарида богатых внеклеточного матрикса, который защищает и стабилизирует здание 4,5. Эти биопленки не просто пассивные комплексы клеток, застрявших на поверхности, но организовал и динамические сложные биологические системы. Когда бактерии переключаться с планктонных в биопленки образа жизни, изменения в экспрессии генов и клеточной физиологии наблюдаются, а также повышенной устойчивостью к противомикробным препаратам и провести иммунную защиту будучи в начале многих стойких и хронических инфекций 6. Тем не менее, под контролем развитие этих живых структур также предлагают возможности для промышленных и экологических применений, таких как биоремедиации мест захоронения опасных отходов, био-фильтрации технической воды или образования био-барьеров для защиты почвы и грунтовых вод от разлиAtion.

В то время как молекулярные особенности, характерные для биопленки образа жизни все чаще описываются механизмы, способствующие развитию развитию общин и упорство остаются неясными. Используя последние достижения на микромасштабных измерений с использованием сканирования электрохимические или флуоресцентной микроскопии, эти живые организации было показано, обладает значительным структурным, химической и биологической гетерогенности 7. Тем не менее, до сих пор, механика биопленки не были в основном рассмотрены макроскопически. Например, наблюдение биопленки стримеров деформации из-за различий в жидкости расхода 8,9, одноосное сжатие биопленки штук поднять из агаровой среде или выращивают на покрытие скользит 10,11, сдвиг биопленки, собранной из окружающей среды, а затем перевели в параллельный пластина Реометр 12,13, атомно-силовая спектроскопия с использованием бусины и покрытием с бактериальной биопленки, прикрепленной к АСМ кантилевера 14 или выделенной микрocantilever метод измерения прочности на разрыв отдельные фрагменты биопленки 15,16 были реализованы в течение десяти последних лет, предоставляя полезную информацию о вязкоупругой природы материала 17. Тем не менее, вполне вероятно, что информация о в точке биопленки механических свойств теряется, когда материал будет удален из его родной среде, которая была часто бывает в этих подходов. Кроме того, лечение биопленки в виде однородного материала попадает в информацию о возможном неоднородности физических свойств в обществе. Таким образом, точные последствия механике структуры в формировании биопленок и биологических черт, таких как экспрессии генов паттерна или химических градиентов вряд ли могут быть признаны. Для продвижения к микромасштабной описания биопленки физических свойств, новые специализированные инструменты необходимы.

Эта статья подробно оригинальный подход задуман для достиженияизмерение локальных механических параметров в месте, не нарушая биопленки и позволяет чертеж пространственного распределения микромасштабных свойств материала, а затем механической неоднородности. Принцип эксперимента опирается на легирования растущей биопленки с магнитными микрочастицами с последующим их удаленной загрузки с использованием магнитных пинцетом в зрелом биопленки. Смещение частиц при контролируемой магнитной силовой применения отображаемого под микроскопом позволяет местным вывод параметров вязкоупругих, каждую частицу отчетности собственную локальную среду. Исходя из этих данных, 3D механический профиль биопленки можно сделать, открыв пространственных и экологических условий зависимости. Весь эксперимент будет показано здесь на Е. палочка биопленки сделаны генной инженерии штамм, несущий derepressed F-как плазмиды. Результаты подробно изложены в недавней работе 18 обеспечивают уникальное видение интерьера интактных механики биопленки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Бактерии Культура и подготовка Подвеска

  1. Выберите только что выращенного колонию из чашки с агаром лизогении бульон (LB), привить его в 5 мл жидкость LB среду, содержащую 100 μ г / мл ампициллина и 7,5 μ г / мл тетрациклина и инкубировать в течение 5 до 6 часов при 37 ° С на встряхивая платформы.
  2. Затем добавляют 100 μ л бактериальной культуры в 5 мл минимальной среды (M63B1) с добавлением 0,4% глюкозы и тех же концентраций антибиотика. Инкубируйте этот разбавленный недавно культуры в течение ночи при 37 ° С на качалке платформы.
  3. После 16 часов инкубации, добавьте 100 мкл ночной культуры в 5 мл M63B1, 0,4% глюкозы. Хранить трубку при 37 ° С в качалке платформы до 0,5 OD будет достигнута. Затем суспензию готов к инъекции в эксперименте канала для образования биопленки.

Подготовка 2. Магнитных частиц

  1. Возьмите 10 мкл магнитных частиц -2,8 μ м в диаметре - со склада и мыть их 3x в 190 мкл минимальной среды с помощью магнитного образца стойке.
  2. Отрегулируйте концентрацию частиц до 5 х 10 6 бисером / мл. Обычно 50 мкл промытого раствора борта смешивают с дополнительным 950 μ л M63B1 с 0,4% глюкозы.

3. Подготовка канала и биопленки роста

  1. Монтаж канала
    1. Вырежьте два квадратных (800 μ м длина стороны) боросиликатного стекла капилляров длиной 10 см, чтобы получить длинные два 8 см кусочки.
    2. Приклейте две капиллярные штук на двух стеклах - разрезать пополам сначала - 2 см друг от друга с 1 см навеса на любом конце, как на рисунке 1 с помощью быстродействующего цианакрилатный клей (так называемый супер-клей).
    3. Автоклав всю установку и необходимую трубы, необходимую для дальнейшей связи канала.
    4. Соберите все стерильные материалы подламинарный поток капот: я) установлен канал и ловушки 1, II) трубы и соединители, III) два пузырь ловушки - пузырь фильтр, обычно используемые для обеспечения детский капельного вскармливания (ловушки 1) и самодельный пузыря ловушку как долго 4 см трубы большего диаметра (ловушки 2), внутривенно) зажимы, объем) 30 мл шприцы, наполненные M63B1, 0,4% глюкозы, и VI) бутылки отходов.
    5. Подключите всю установку с Луер блокировки связкой или переходов в следующем порядке: 50 мл M63B1 шприца контролируется шприцевой насос, педиатрической фильтра пузыря, домашний пузыря ловушку, капиллярной (рис. 1, панель B), и через трубу к бутылке отходов. Затем заполнить установку стерильной M63B1, 0,4% глюкозы, включение шприцевого насоса со скоростью примерно 10 мл / ч, выше экспериментальных ставок. Тщательно отслеживать и устранять все пузыри в цепи.
    6. Расход среды через систему в течение 10-15 минут; одновременно смешивать 1 мл бактерий суспензии при OD 0,5 из раздела1.3 1 мл промытого борта раствора, приготовленного в разделе 2.2.
    7. Прикрепите (но не закрывайте) зажимы для трубок в двух положениях: до и после капилляров. Переключите поток прочь.
    8. Введем бактериально-шарик смеси в капилляр после самодельным пузыря ловушку, используя 1 мл шприц, заботясь, чтобы задержать концов труб, чтобы предотвратить попадание воздуха. Повторно прикрепить трубку и закройте зажимы.
    9. Повторите ту же процедуру для второго капилляра и проверить все трубы для пузырьков.
    10. Перенести аппарат к микроскопу и дайте ему постоять в течение 15-20 мин, чтобы позволить бактерии урегулировать и приложить к поверхности капилляра. Установите капилляр на столике микроскопа с контейнером отходов на более высоком уровне. Поместите шприцевой насос на рабочей поверхности рядом с микроскопом. Поднимите пузыря ловушку перед капилляра несколько выше, чем капиллярной плоскости захватить пузыри.
  2. Биопленки Грут-й
    1. Отрегулируйте расход на шприцевой насос и начать поток, биопленки теперь развиваются на поверхности капилляров в необходимый период - как правило, 24 или 48 ч в этих экспериментах.
    2. Сосредоточьтесь на капиллярной нижней плоскости и начать запись покадровой из примеров изображений - обычно частоты приобретение 2 изображений / мин будет адекватно сообщить рост биопленки. Это видеомониторы биопленки роста после управления (см. выдержки в Видео 1, 2 и 3).

4. Магнитные Пинцет Установка

  1. Винтовые магнитные пинцет на управляемых вручную XYZ микроманипуляторов и закрутите микроманипуляторами на столик микроскопа, чтобы отрегулировать положение пинцета относительно капилляра. Поместите пинцет как на рисунке 2, чтобы обеспечить соответствующий градиент магнитного поля генерируется в зоне наблюдения.
  2. Подключите пинцет Tо функции генератора через усилитель мощности для генерации 40 сек период времени, изготовленный из 24 сек нулевого сигнала и 16 сек 4 постоянного тока с триггером послал к яркому поля световой затвор после 20 сек для синхронизации сигнала обеспечивая последовательность события, как на рисунке 3.
    Примечание: Эти две операции могут быть достигнуты в любое время между капиллярной установки и начала измерения. Смотреть экспериментировать обзор эскиз на рисунке 4.

Creep Кривая Приобретение 5.

  1. Используйте регулятор движения ху из столике микроскопа, чтобы принести край левой магнитного полюса и левого края капилляра в той же области наблюдения. Возьмите происхождение анализа ссылочной на пересечении рентгеновских и у-осей, определенных краю капилляра и краю полюса, соответственно (см. рисунок 2).
  2. Отрегулируйте вертикальное положение капилляра с помощью тонкой Focus Control ручка от положения микроскопа. Как правило, первый рассмотрены самолет находится от 4 до 7 μ м над капиллярной дне. Видео 1 соответствует ху области, который имеет свой ​​верхний левый угол в начале пространственной ссылочной.
  3. Trigger последовательность 40 сек событий, описанных в разделе 4.2 и на рисунке 3, включив генератора тока и в то же время, вручную запустить последовательность получения изображений из видео 1.
  4. Перемещение капилляр в правом поле соседа по 250 μ м переводе столик микроскопа слева и работать как в разделе 5.3 для создания видео 2 срез 2 и так далее до получения требуемых видео. Как правило от 3 ​​до 4 поля 250 х 250 μ м 2 собирают вдоль оси х перед изменением плоскости и повторяя те же операции для новой плоскости.

6. Силы Калибровка

  1. Приготовьте раствор глицерина путем смешивания 39,8 г глицерина с 190 μ л бидистиллированной воды и 10 мкл магнитных частиц на 2 х 10 9 частиц / мл и заполнить экспериментальный канал с этой смесью и поместить его на столик микроскопа , как описано для образца биопленки.
  2. После установки магнитных пинцет, как указано в разделе 4, применять магнитную силу, как указано в разделе 5.4 и сделать покадровой изображения для извлечения каждый скорость одной частицы (V) и его положение в капилляр, чтобы получить файл калибровки. Этот файл должен содержать приложенной силы в зависимости от его положения в зоне анализа капилляра в соответствии с Стокса закона, F = 6πRηv (R: радиус частицы).

7. Анализ

  1. Используйте программное обеспечение "частица трекер" для получения текстовых файлов с позициями частиц в каждом кадре для всех стеков изображений, полученных, как указано в разделе 5. Усинг частота приобретение стек изображение, вычислить смещение частиц в виде функции времени (например, рисунок 5 и видео 4).
  2. Использование файла калибровки силы, конвертировать кривые смещения в кривых соблюдения (всего соблюдения материала - J (т) - в зависимости от времени) по формуле соответствия:
    figure-protocol-1
    который дает связь между материальной процедить и приложенное напряжение для пробной частицы радиуса R, встроенного в несжимаемой, однородной вязкоупругой среды в порядке, установленном ранее Schnurr с сотрудниками 19.
  3. Отрегулируйте кривые на соблюдение норм ползучести для широкой Бюргерса модели вязкоупругих материалов и получить вязкоупругие параметры, J 0, J 1, η 0, η 1 для каждой частицы ( Рис. 6) в соответствии с формулой Бюргерса:
    figure-protocol-2
    Примечание: Этот феноменологический анализ был ранее использован для широкого спектра материалов, включая биологических материалов, таких как биопленки интерпретировать макроскопических СВЕДЕНИЯ реологии 20-22.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Типичный анализ даст пространственное распределение вязкоупругих параметров на микрон шкалой на живого биопленки, не нарушая его оригинальное расположение. Типичные результаты приведены на рисунке 7, где значения J 0 - упругой податливости, - приводятся в зависимости от оси по глубине и по оси у вдоль поперечного размера биопленки. Каждая точка соответствует шарик, который анализ кривой ползучести предоставил J 0 значение. Данные показали, что местное соблюдение изменяться по глуби...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это магнитная частица посева и потянув эксперимент включен на месте 3D отображения вязкоупругих параметров растущего биопленки в исходное состояние. Этот подход показал механическую неоднородность Е. палочка биопленки вырос здесь и дал ключи, чтобы указать на компоненты биопленки, поддерживающие биопленки физические свойства, сильно предполагая фундаментальную причастность внеклеточного матрикса и точнее степень его сшивки.

Признание механические свойства моделей в бактериа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантами от Agence Nationale Pour La Recherche, программы PIRIbio Dynabiofilm и от CNRS программы Междисциплинарный рисками. Мы благодарим Филиппа Томен за его критическое прочтение рукописи и Кристоф Beloin за предоставление E. Штамм используется в этой работе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Table 1: Реагенты и ячейки
Магнитные частицы Технологиижизни14307DМикрометрические магнитные частицы, 2.8 &; m
диаметр ампициллина (антибиотик)Sigma-AldrichA9518
Тетрациклин (антибиотик)Sigma-Aldrich87128
Бактериальный штамм MG1655gfpFUGB, Институт Пастера, ФранцияПроизводит на своей поверхности F. pili, устойчивый к ампициллину и тетрациклину.
Table 2: Капилляры и трубки
Фильтры для педиатрической перфузииProdimed-Plastimed6932002
полые квадратные капиллярыКомпозитный металл Scientific8280-100Изготовлен из боросиликатного стекла. Квадрат 0,8 мм x 0,8 мм
Трубка силиконовый пероксидVWR international228-0512Диаметр 1 мм
Трубка силиконовый пероксидVWR international228-0700Диаметр 3 мм
Table 3: Биопленка для роста
Лизогения Бульон (LB) растворAmresco-VWRJ106-10PKСтандартная среда, используемая для выращивания бактерий.
Раствор M63B1Домашнийстандарт минимальная среда, используемая для выращивания бактерий.
ГлюкозаSigma-AldrichG8270Используется для изготовления среды M63B1 с 0,4% глюкозы.
Table 4: Электронная
камера EMCCD   HamamatsuC9100-02
Контроллер нагревателяМировые прецизионные приборы300354
Функции генератораAgilent технологии33210A
Усилитель мощностиСамодельныйВыдает токовый сигнал с амплитудами до 4 А.
Шприцевые насосыKd ScientificKDS-220
ShutterVincent AssociatesUniblitz T132
Магнитный пинцетСамодельныйДва электромагнитных полюса, каждый из которых изготовлен из медной катушки с 2 120 витками диаметром 0,56 мм Медная проволока и сердечники из магнитного сплава (Supra50-Arcelor Mittal, Франция) квадратной формы по чертежу, показанному на рисунке Рисунок 10. Два ядра установлены на северном полюсе, обращенном к южному полюсу, чтобы генерировать магнитную силу в одном направлении по длине капилляра. Подробные сведения о проводке катушки см. на рисунке Рисунок 11.
Table 5: Оптический
инвертированный микроскоп NikonTE-300
S Fluor x40 Объектив (NA 0.9, WD0.3)NikonЭто объектив с большим рабочим расстоянием, позволяющий наблюдать биопленку в глубине.
Эпифлуоресцентные фильтры: 1) для зеленой флуоресценции: Exc 480/20 нм; DM 495; Em 510/20  2) для красной флуоресценции: Exc 540/25 нм; DM 565; Em 605/55Chroma1)#49020 2)#31002Смещение частиц при приложении силы регистрируется с помощью красного флуоресцентного фильтрующего блока.
Table 6: Анализ изображений
ImageJNIH - плагин
для отслеживания частиц

Ссылки

  1. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
  2. Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8, 881-890 (2002).
  3. Costerton, J. W., Stewart, P. S. Battling biofilms. Scientific American. 285, 74-81 (2001).
  4. Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
  5. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
  6. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  7. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6, 199-210 (2008).
  8. Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: an in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnology and bioengineering. 65, 83-92 (1999).
  9. Klapper, I., Rupp, C. J., Cargo, R., Purvedorj, B., Stoodley, P. Viscoelastic fluid description of bacterial biofilm material properties. Biotechnol Bioeng. 80, 289-296 (2002).
  10. Korstgens, V., Flemming, H. C., Wingender, J., Borchard, W. Uniaxial compression measurement device for investigation of the mechanical stability of biofilms. Journal of microbiological. 46, 9-17 (2001).
  11. Cense, A. W., et al. Mechanical properties and failure of Streptococcus mutans biofilms, studied using a microindentation device. Journal of microbiological methods. 67, 463-472 (2006).
  12. Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Physical Review Letters. 93, (2004).
  13. Towler, B. W., Rupp, C. J., Cunningham, A. B., Stoodley, P. Viscoelastic properties of a mixed culture biofilm from rheometer creep analysis. Biofouling. 19, 279-285 (2003).
  14. Lau, P. C., Dutcher, J. R., Beveridge, T. J., Lam, J. S. Absolute quantitation of bacterial biofilm adhesion and viscoelasticity by microbead force spectroscopy. Biophysical journal. 96, 2935-2948 (2009).
  15. Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Micro-cantilever method for measuring the tensile strength of biofilms and microbial flocs. Journal of microbiological methods. 55, 607-615 (2003).
  16. Aggarwal, S., Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Development and testing of a novel microcantilever technique for measuring the cohesive strength of intact biofilms. Biotechnology and bioengineering. 105, 924-934 (2010).
  17. Guélon, T., Mathias, J. -D., Stoodley, P. Biofilm Highlights. Series on Biofilms (eds Hans-Curt Flemming, Jost Wingender, & Ulrich Szewzyk). 5, Springer. Berlin Heidelberg. (2011).
  18. Galy, O., et al. Mapping of Bacterial Biofilm Local Mechanics by Magnetic Microparticle Actuation. Biophysical journal. 103, 1-9 (2012).
  19. Schnurr, B., Gittes, F., MacKintosh, F. C., Schmidt, C. F. Determining Microscopic Viscoelasticity in Flexible and Semiflexible Polymer Networks from Thermal Fluctuations. Macromolecules. 30, 7781-7792 (1997).
  20. Aggarwal, S., Hozalski, R. M. Effect of Strain Rate on the Mechanical Properties of Staphylococcus epidermidis Biofilms. Langmuir. 28, 2812-2816 (2012).
  21. Towler, B. W., Cunningham, A., Stoodley, P., McKittrick, L. A model of fluid-biofilm interaction using a Burger material law. Biotechnol Bioeng. 96, 259-271 (2007).
  22. Jones, W. L., Sutton, M. P., McKittrick, L., Stewart, P. S. Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms. Biofouling. 27, 207-215 (2011).
  23. Apgar, J., et al. Multiple-particle tracking measurements of heterogeneities in solutions of actin filaments and actin bundles. Biophysical journal. 79, 1095-1106 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи