Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Методы изучения механизмов действия антипсихотических препаратов в

11.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50864

⸱

4 февраля 2014 г.

 , 
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Mailman Research Center, McLean Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Подходы к тестирования эффектов антипсихотических препаратов (APDS) в Caenorhabditis Элеганс демонстрируются. Анализы описаны для тестирования лекарственные эффекты на развитие и жизнеспособность и на скорости накачки глотки. Эти методы также применимы для экспериментов с фармакогенетических классов лекарственных средств, отличных от ЛФД.

Аннотация

Caenorhabditis Элеганс простой генетический организм поддаются крупномасштабных вперед и назад генетические экраны и химические генетические экраны. С. Элеганс геном включает потенциальную антипсихотические препараты (APD) Цели консервативные у людей, в том числе генов, кодирующих белки, необходимые для синтеза нейромедиаторов и синаптической структуры и функции. Воздействие APD производит задержку и / или летальность в нематод с развитием в зависимости от концентрации. Эти фенотипы обусловлены, в частности, путем APD-индуцированного ингибирования глотки насосного 1,2. Таким образом, фенотип развития имеет нервно-мышечную основу, что делает его полезным для фармакогенетических исследований нейролептиков. Здесь мы показываем, подробные процедуры тестирования APD воздействие на развитие нематоды и глотки накачки. Для анализа развития, синхронизированные эмбрионы помещают на нематод роста среды (NGM) пластин, содержащие APDS, и этапах разработки Анинормалей затем забил в день. Для скорости накачки глотки анализа, устроили молодые взрослые животные были протестированы на NGM пластин, содержащих APDS. Количество глотки насосов в единицу времени записывается, и скорость накачки рассчитывается. Эти анализы могут быть использованы для изучения многие другие типы малых молекул или даже больших молекул.

Введение

Caenorhabditis Элеганс простой генетический организм поддаются крупномасштабных прямой и обратной генетических экранов и химических генетических экранов. С. Элеганс чувствителен к широкому спектру биологически активных соединений, и поэтому успешно применяется для определения механизмов действия различных таких соединений. Например, биологически активных соединений изучены с помощью червя фармакогенетика включают агонисты рецептора ацетилхолина (например левамизол, никотина, морантел и Пирантела), анестетики (например, галотан), кофеин, ингибиторы холинэстеразы (например алдикарб, lannate и трихлорфон), фторид, ГАМК-связанных соединения (например ГАМК и мусцимол), ивермектин, паракват, форбол сложные эфиры и серотонина, связанных препараты (например, серотонина и imiprimine) 3. Кроме того, С. Элеганс был использован для крупномасштабных экранов небольшой молекулы, что позволяет открытие нового биологически активного соединенияс и выявление новых генетических мишеней 4.

С. Элеганс геном включает потенциальную антипсихотические препараты (APD) Цели консервативные у людей, в том числе генов, кодирующих белки, необходимые для синтеза нейромедиаторов и синаптической структуры и функции 5. Таким образом, С. Элеганс нейрогенетики и методы нейробиологии предложение для обнаружения новых молекулярных механизмов действия ЛФД. У нематод, экспозиция APD на ранних стадиях развития производит задержку развития и при более высоких концентрациях, летальность 2,6. Воздействие APD во взрослом возрасте вызывает поведенческие фенотипы. Например, клозапин воздействие подавляет передвижение и глотки накачку и повышает яйценоскость 1,2,7.

APD-индуцированной задержка развития и летальность являются мощными фенотипы для крупномасштабных химических генетических экранов. Эти фенотипы комплекс в той мере, они, вероятно, имеют более одного клеточные и генетические Basiс. Поэтому такие генетические экраны ожидается выход разнообразные косвенные лекарственных препаратов. Тем не менее, наша лаборатория провела генов-кандидатов экраны и экран RNAi генома для гасителей APD-индуцированной задержки развития и летальности и успешно восстановлены гены, которые, вероятно, кодируют прямые цели, в том числе дофамина, инсулин и никотиновых рецепторов ацетилхолина 2,8. Генетические экраны на основе APD-индуцированных поведения у взрослых, также привели к идентификации новых мишеней APD, и мы теперь проверки цели из обоих развития и поведения экранов у млекопитающих 7. Таким образом, беспозвоночных химические генетический подход, чтобы обнаружить новые молекулярные механизмы действия ЛФД представляется, возможно 5,8.

С. Элеганс глотки является органом, который включает в себя 20 нейронов, 20 мышечных клеток, и 20 вспомогательных клеток, завернутые базальной мембраной. Как и в сердца млекопитающих, глотки является автономнымй постоянно насосы еду в из внешней среды 9. Ингибирование скорости насосного глотки компромиссы поглощение пищи, и, таким образом мутации или препараты, которые подавляют глотки насосную причиной задержки развития или ареста 9. ЛФД ингибирования скорости глотки насосную, что составляет в части для их влияний на развитие и жизнеспособность 1,2. Здесь мы используем атипичной APD клозапин в качестве примера для демонстрации анализы наркотиков для развития нематод и глотки накачки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Задержка развития / Летальность Анализ: дикого типа (N2) и два Мутант (Mut1 и Mut2) штаммы были испытаны в трех клозапин концентраций в 12-луночный планшет

  1. В день 1, заливают 2 мл NGM среды 10 в каждую лунку 12-луночного планшета (каждую лунку с диаметром 2 см) и позволяют затвердеть на скамье при комнатной температуре (RT) в течение ночи. В тот же день, выберите колонию кишечной палочки OP50 бактерий, заразить бутылку 50 мл раствора LB, и культура его в шейкере 37 ° C при 220 вращения оборотов в минуту в течение ночи.
  2. В день 2, передать 20 мкл OP50 бактериальной культуры на центр каждого NGM скважины. Инкубируйте пластин в инкубаторе 37 ° C или оставить их при комнатной температуре в течение ночи, чтобы позволить бактериальная газон расти толще.
  3. Сделать 80 мм клозапин маточного раствора путем растворения клозапин в ДМСО (диметилсульфоксид) растворителя. Тогда сделать рабочий раствор 80 мкл с маточного раствора, разведенного в 1,7 мл уксусной кислоты BAsed в таблице 1.
    Примечание: Рабочий раствор для конкретного препарата интереса должно быть определено, делая серию предварительных испытаний концентрации, чтобы найти наиболее соответствующую концентрацию для различения дикого типа от мутантов.
  4. Передача 80 мкл клозапин рабочего раствора на затравку, NGM пластины хорошо и вращать пластинку, чтобы решение равномерно распределить на поверхности. Подождите, пока пластина для просушки. Используйте пластины для анализа в тот же день или поместить его в 20 ° С инкубатор, который будет использоваться на следующий день.
    Примечание: Рабочий раствор представляет собой суспензию препарат из-за низкой растворимости клозапин, особенно при высокой концентрации. Таким образом, вихревой трубки перед передачей решение пластины наркотиков для того, чтобы гарантировать, что концентрация лекарственного средства является точной.
  5. Вымойте червей от 3,5 см пластину, содержащую много беременных взрослых с М9 буфера и затем спина их в 15 мл трубкив 2000 оборотах в минуту в течение 1 мин.
  6. Аспирируйте супернатант. Добавьте 5 мл раствор отбеливателя (NaOH: гипохлорит: DDH 2 O в 4:01:05) и нарушить нематод, аккуратно переворачивая пробирки.
  7. Соблюдайте животных, пока половина из них не растворяются в пределах 5 мин. Спин вниз яйца в 2000 оборотах в минуту в течение 1 мин.
  8. Аспирируйте супернатант и добавить 14 мл M9 буфер быстро.
  9. Спин вниз яйца в 2000 оборотах в минуту в течение 1 мин и аспирации супернатант, оставляя приблизительно 100 мкл раствора. Vortex приостановить яйца.
  10. Передача 2 мкл яйца приостановлено в M9 на регулярной NGM пластины для проверки, сколько яйцеклетки переносятся. Регулировка громкости взвешенных яиц, чтобы обеспечить, что Есть около 30-35 яиц в каждой передаче. Передача 30-35 яиц в каждую лунку аналитического планшета, а затем инкубируют в инкубаторе при 20 ° C в течение 24 часов.
  11. На первом день анализа, оценка количества яиц вылупились. Регулировка общее количество заштрихованных животных 25/well по Pickiнг лишние червей, если это необходимо.
  12. В последующие дни, наблюдать за животными и забить им каждые 24 ч. Этап развития оценивается в зависимости от размера животного и формы вульвы 11. Эксперимент длится 5-6 дней с самой надежной эффекта обычно увидеть на третий или четвертый день.
  13. Входной данные в файл Excel и вычислить процент животных на каждом этапе развития для каждого день эксперимента. Генерация графики с функцией '100% Гистограмма с накоплением 'в '2-D колонке "меню.

2. Фарингальный Насосная Анализ: Young Adult Животные для дикого типа и мутантных штаммов оцениваются по клозапин Планшеты

  1. Аналитический планшет выполнен по той же протокол, используемый для развития задержки / летальность анализа.
  2. Возьмите 50 L4 животных для каждого штамма к сеяных NGM пластин 24 часа в сутки до анализа и инкубировать червей при 20 ° С.
  3. Возьмите 10 животных к Ассау пластины хорошо. Затем выберите 10 животных на следующий же каждый 15-20 мин.
  4. После того, как животные в первой скважины были подвержены препарата в течение 30 мин, начали проводить анализ, наблюдая глотки накачку под микроскопом рассечение и забивать насосы на 20 сек 9. После глотки накачки забил, выбрать червя от пластины.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

1. Задержка развития / летальность результат анализа

Типичный результат для развития задержки / летальность анализа показано в фигурах 1a и 1b. Когда дикого типа животных в контрольной группе выросли до беременной взрослой стадии (рис. 1а), дикого типа животных, подвергшихся воздействию клозапин еще в молодых личиночной стадии или мертвы (рис. 1b). Рисунок 1в показывает характерный результат сравнения супрессор мутант (Mut1...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем методы тестирования эффектов ЛФД на развитие и поведение С. Элеганс. ДМСО или этаноле используют для растворения клозапин, так как препарат является относительно нерастворимым в воде. Поскольку растворители, как сообщается, повлияет C. Элеганс биологии 12, ДМСО-отдельно или этанол-один контрольные группы имеют важное значение. Самая высокая концентрация ДМСО используется в наших тестах до 3%, что не имеет очевидное влияние на С. Элеганс развития. ДМСО может быть и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что нет конфликта интересов участников.

Благодарности

Работа была поддержана NIH Клинический награждения развития науки K08NS002083, грант Shervert Фрейзер научно-исследовательский институт, и NARSAD премия для молодых следователь к Эдгара А. Buttner.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
КлозапинSigmaC6305
Диметилсульфоксид (ДМСО)SigmaD8418
Уксусная кислота (HAC)FisherBP2401
Гидроксид натрия (NaOH)EMDSX0590-13
ГипохлоритSigma-Aldrich425044
центрифуга 5810Eppendorf5810 000.017
Шейкер инкубатораNew Brunswick ScientificM1246-0006
Низкотемпературный инкубатор 815Precision ScientificJ1790-1B
СтереомикроскопOlympusSZX12
Чашка Петри 35 x 10 ммFisher ScientificNC9434271
12-луночный планшет для культуры тканейBD FalconREF 353043

Ссылки

  1. Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition. Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).
  2. Karmacharya, R., et al. Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).
  3. Rand, J. B., Johnson, C. D. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 187-204 (1995).
  4. Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
  5. Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease. Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).
  6. Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors. Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).
  7. Karmacharya, R., et al. Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus. Brain Res. 1393, 91-99 (2011).
  8. Saur, T., et al. A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target. PLoS Genet. 9, (2013).
  9. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , Available from: http://www.wormbook.org (2012).
  10. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. 47, (2011).
  11. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 3-29 (1995).
  12. Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans. Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).
  13. Kage-Nakadai, E., et al. Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5, (2010).
  14. Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).
  15. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. J. Vis. Exp. (51), (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

C elegans
Методы изучения механизмов действия антипсихотических препаратов в
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.