Методическая статья

Индукция инвазивная карцинома Переходные мочевого пузыря в иммунных интактными человеческими MUC1 трансгенных мышах: модель для иммунотерапии развития

DOI:

10.3791/50868

⸱

30 октября 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis, 2Comparative Pathology Laboratory, UC Davis School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 3Merck Serono Research, Merck KGaA, Darmstadt, Germany

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N-бутил-N-(4-гидроксибутил) нитрозаминов модели индуцированного рака мочевого пузыря был разработан в человеческих муцина 1 (MUC1) трансгенных мышей с целью тестирования MUC1-направленной иммунотерапии. После введения MUC1-целевой пептид вакцина, цитотоксических Т-лимфоцитов ответ на MUC1 была подтверждена путем измерения сывороточного уровня цитокинов и Т-клеток специфической активности.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Доклинических моделей инвазивного рака мочевого пузыря был разработан в человеческих муцина 1 (MUC1) трансгенных (MUC1.Tg) мышам с целью оценки иммунотерапии и / или цитотоксической химиотерапии. Чтобы вызвать рак мочевого пузыря, мышей C57BL / 6 (MUC1.Tg и дикий тип) перорально вводили канцероген N-бутил-N-(4-гидроксибутил) нитрозаминов (OH-BBN) при 3,0 мг / сут, 5 сут / неделю в течение 12 недель. Чтобы оценить влияние OH-BBN на цитокиновый профиль сыворотки во время развития опухоли, цельная кровь собирали подчелюстной кровоточит до начала лечения и каждые четыре недели. Кроме того, MUC1-целевых вакцины пептида и плацебо вводили группам мышей в неделю в течение восьми недель. Мультиплекс флуорометрическая immunoanalyses микрошарика сывороточных цитокинов во время развития опухоли и после вакцинации проводились. При прекращении, гамма-интерферона (IFN-γ) / интерлейкина-4 (IL-4) ELISpot анализ MUC1 специфичных Т-клеточный иммунный ответ и гистопатологические оценки типа опухолии класс были выполнены. Результаты показали, что: (1) рака мочевого пузыря в обоих MUC1.Tg и мышей дикого типа составил 67%, (2) переходно-клеточных карцином (TCC), разработанная в соотношении 2:1 по сравнению с плоскоклеточного рака (SCC) , (3) воспалительные цитокины возрастает со временем, во время развития опухоли, а также (4) введение пептида вакцина вызывает Th1-поляризованного профиль сыворотки цитокинов и MUC1 специфический Т-клеточный ответ. Все опухоли в MUC1.Tg мышей были положительными на MUC1 выражения, и половина всех опухолей у MUC1.Tg и мышей дикого типа были инвазивными. В заключение, используя командный подход на основе координации усилий фармакологов, иммунологов, патологоанатомов и молекулярных биологов, мы разработали иммунной нетронутыми трансгенных мышах рака мочевого пузыря, который выражает hMUC1.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рак мочевого пузыря является четвертым наиболее распространенной формой рака и восьмой ведущей причиной смерти от рака среди американских мужчин. В Соединенных Штатах, по оценкам, 72 500 новых случаев заболевания и 15 000 смертей от рака мочевого пузыря, как ожидается, среди мужчин и женщин в 2013 году в сочетании 1. Рака мочевого пузыря примерно в три раза выше у мужчин, чем у женщин. В Соединенных Штатах, переходно-клеточных карцином (TCC) приходится более 90% случаев, в то время как плоскоклеточный рак (SCC) имеют частоту менее 2% 2. Общий относительный 5-летняя выживаемость для папиллярного TCC является 91,5% по сравнению с 30,9% только для SCC 2. Хотя неинвазивный папиллярный страны, предоставляющие войска составляют приблизительно 75% случаев на момент постановки диагноза, даже при лечении более чем 50% пациентов наблюдается рецидив в течение 5 лет, при этом до 30% этих больных прогрессирующей мышечной инвазивных заболеваний 3,4 . Типичные схемы лечения немышечные инвasive болезни включают трансуретральной резекции (ТУР) с последующей внутрипузырной химиотерапии. У пациентов с полноценным Та или T1 опухолей, повторите TUR может быть выполнено до химиотерапии 3,4. Для тех пациентов с низкой степени Ta рецидивов или высококачественный Та или T1 поражений, ТУР последующей адъювантной химиотерапии или иммунотерапии в виде бацилла Кальметта-Герена (BCG), можно использовать 3,4. Внутрипузырной БЦЖ было показано, что превосходит внутрипузырного C митомицин по времени для повторения 5. Для T2 мышц инвазивных заболеваний, радикальной цистэктомии с или без неоадъювантной химиотерапии является рекомендуемым Курс лечения 3. У пациентов с SCC, радикальной цистэктомии, как представляется, наиболее эффективным методом лечения 6. Учитывая очень высокий уровень рецидива, несмотря на все процедуры доступны, существует явная необходимость в новых, более эффективных методов лечения рака мочевого пузыря.

Расширение новых иммунотерапии для bladdER железы является одним из возможных подходов, что может перспективны для расширения выживаемость без признаков заболевания. Исторически сложилось так, BCG была единственным эффективным для иммунотерапии рака мочевого пузыря. Механизм его действия как полагают, включает неспецифический индукции Т-хелперов 1 (Th1) тип иммунного ответа за счет увеличения уровней интерлейкина-2 (ИЛ-2) и интерферона-гамма (IFN-γ) 4. Cellular, или Th1 иммунитет, имеет решающее значение в иммунотерапии рака, как гуморальный, или Th2, иммунитет никогда не была показана эффективность против солидных опухолей, за исключением антител, направленных против рецепторов факторов роста 7. В попытке улучшить преимущества монотерапии BCG, IFN-α 2B/BCG комбинации иммунотерапии оценивали в фазе II клинического испытания с неоднозначные результаты 8. Альтернативный подход к иммунотерапии рака мочевого пузыря может быть ориентация ассоциированные с опухолью антигены (ТАА), идентификация, которая сделала иммунотерапии рака более конкретными 7 .

Одним из таких является ТАА муцина 1 (MUC1), которая представляет собой гликопротеин клеточной поверхности избыточно экспрессируется во многих эпителиальные клетки рака, такие как пузыря, молочной железы, легких и рака поджелудочной железы 9,10. Выражение и модификации MUC1 также существенно изменены при канцерогенезе, так что underglycosylation предоставляет антигенных последовательностей аминокислот, известных как переменное число тандемных повторов (VNTR) в центральной пептидной. В то время как MUC1 является самостоятельной молекулы, эти регионы иммунодоминантные VNTR обычно не воздействует из-за обширных гликозилирования, и таким образом они видны со стороны иммунной системы, как иностранные 11,12. Цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), которые специфически распознают эпитопы MUC1 были выделены из опухолей лимфатических узлах больных раком молочной железы 13, а также в крови и костном мозге больных миеломой 14,15, что делает MUC1 потенциальной мишенью клеточный иммунный ответ. Иммунодоминантные VNTRs из underglycosylateD формы MUC1 признаны ЦТЛ, в результате разрушения опухолевых клеток 16-19. Родные клеточного и / или гуморального иммунного ответа к раковым MUC1, однако, не достаточно сильны, чтобы удалить опухоль. Для увеличения уже существующих слабый иммунный ответ на MUC1, синтетические иммунодоминантном пептиды могут быть введены путем вакцинации, чтобы генерировать ЦТЛ-ответ достаточно сильным, чтобы быть клинической пользы 18,20. MUC1 липосомальной вакцины уже было показано увеличение выживаемости у больных раком легкого 21,22, генерировать ЦТЛ способны убить MUC1-позитивные клетки опухоли, и производят Th1-цитокинов поляризованные ответ 23,24. При высоком уровне MUC1 выражение 9,11,25, рак мочевого пузыря является логическим кандидатом для тестирования MUC1-направленной иммунотерапии 26,27. Кроме того, MUC1 имеет потенциал в качестве прогностического фактора при раке мочевого пузыря 28, MUC1 TCC выражение в значительной степени связано с стадии и степени, и метастатических TCCБыло показано, что по-прежнему выражают MUC1 29.

Для того чтобы оценить потенциальную полезность MUC1-направленной иммунотерапии при раке мочевого пузыря, мы разработали нетронутыми человеческой иммунной MUC1 (hMUC1) экспрессирующих трансгенных (MUC1.Tg) мышиной модели рака мочевого пузыря конгенные на C57BL / 6 фоне 30. MUC1 человека выражается в виде собственного белка под контролем своего собственного промотора, в результате чего образец ткани выражение согласуется с наблюдаемым у людей 30,31. Мыши были индуцированы с известным канцерогеном мочевой пузырь N-бутил-N-(4-гидроксибутил) нитрозаминов (OH-BBN) 32, а затем полученный опухолей оценивали по hMUC1 экспрессии и типа опухоли и класс. Для оценки влияния канцерогенов на Th1/Th2 уровни цитокинов в процессе развития опухоли, сыворотку собирали образцы периодически для мультиплексного анализа. Мышей обрабатывали MUC1-целевой пептид вакцины и сыворотки цитокинов и иммунных реакций были оценТед по мультиплекса флуорометрическая иммунологического микрошарика и ELISpot.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все исследования на животных и эксперименты проводились в рамках протокола принятой в Университете Калифорнии в Дэвисе Институциональные уходу и использованию животных Административные Консультативного комитета.

1. MUC1.Tg разведения мыши и распространения

  1. UC Davis Мышь биологии программы (МВР) пород дикого типа C57BL / 6 мышей-самцов с гетерозиготной MUC1.Tg C57BL / 6 самок мышей установить нашу колонию. MUC1.Tg потомство поставляются для исследования по мере необходимости.
  2. MBP персонала обрезать пальцы потомство определенному шаблону (0-99) для идентификации мыши, и, когда это применимо клип хвост. Палец ноги или хвост ткань обрабатывается для генотипирования с использованием стандартного выделения ДНК и полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализа.

2. Дизайн исследования

  1. Исследовательская группа Задания
    1. Взвесить каждую мышь по отдельности на баланс и записывать вес в граммах для каждой мыши.
    2. Эта часть процедуры инвОЛВЕС методологии и дизайна исследования. Для первой части исследования, назначить соответствующего возраста MUC1.Tg и мышей дикого типа, чтобы начать индукцию рака мочевого пузыря с OH-BBN. Эвтаназии мышей через 8 недель после последнего OH-BBN доза, чтобы подтвердить наличие опухоли мочевого пузыря по гистологии.
    3. Для второй части исследования, случайный мужской MUC1.Tg мыши на соответствующее число лечения и контрольных групп. Эти мыши будет контролироваться для сывороточных цитокинов и Т-клеточного иммунного ответа во время индукции и развитие опухоли, а затем в конце исследования через 8 недель после последнего OH-BBN дозы.
  2. Индукционные Рак мочевого пузыря
    1. ОН-BBN является канцерогеном и высокой токсичностью. Пожалуйста, прочитайте и следуйте рекомендациям паспорта безопасности вещества при обработке и хранении этого химического вещества.
    2. Вычислить дозирования концентрации раствора, необходимую для обеспечения соответствующей дозе (3 мг) в объеме 100 мкл в каждую мышь на основе среднего веса и Numbeр мышей в каждой исследования и группы.
    3. Развести OH-BBN в 100% этаноле. Довести до конечной концентрации 30 мг / мл стерильной водой. Конечный этанол: вода концентрация должна быть 20:80, об / об
    4. Администрирование OH-BBN перорально с использованием нержавеющей стали, 20 г иглы зонда в день, 5 дней / неделю в течение 12 недель, основанная на назначении лечения группы начиная с возраста 8 недель.
  3. Вакцинация Лечение
    1. Разведите каждый флакон лиофилизированной вакцины пептида в 600 мкл 0,9% стерильного физиологического раствора и тщательно ресуспендируйте рисуя раствора через 0,5 дюйма 27 G игла 6x. Использование солевой раствор, регулировать концентрацию так, что желаемый доза вводится в объеме 100 мкл.
    2. Начиная с 20 недели, после введения последней дозы ОН-BBN, прививку на еженедельной основе по восемь-недельного цикла путем подкожной инъекции 100 мкл с использованием иглы 25 G (номер недели соответствует возрасту мышей).
  4. Мониторинга и сбора проб
    1. Взвесить все мыши и пальпации на наличие новой опухолей один раз в неделю. Усыпить любые мышей, которые потеряли ≥ 20% от массы тела или при наличии ощутимой опухоли, кровь в моче и / или задержка мочи.
    2. Перед первым OH-BBN дозу и затем каждые 4 недели после этого собирают цельную кровь через подчелюстные кровотечения. Соберите в сыворотке крови свертывания труб (BD Microtainer), и позволяют 30 минут для свертывания крови.
    3. Центрифуга образцы крови в микроцентрифуге при 3500 х г в течение 10 мин. Тщательно передачи сыворотки, чтобы защитный колпачок криопробирок с помощью пипетки.
    4. Ледяная вспышка в жидком азоте и хранят при температуре -80 ° С до дальнейшего анализа мультиплекса.
    5. Через восемь недель после последней дозы OH-BBN, усыпить всех мышей CO 2 удушья.
    6. Место каждой мыши на рассечение доску и придавить на всех четырех конечностях.
    7. Использование щипцов и ножниц, Массачусетске горизонтальный разрез в верхней области живота. Вставьте ножницы в разрез между эпидермальным слоем и брюшную стенку и осторожно отделить кожу от основной ткани с помощью щипцов.
    8. Сделать вертикальный разрез от горизонтального разреза после средней оси по направлению к переднему концу мыши. Отделить кожу от грудной клетки, и с помощью 1 мл шприц и иглы 22 G, проколов сердце и собирают кровь с гладкой и устойчивой ничьей.
    9. Обратитесь к шагу 2.4.3 и 2.4.4 для сыворотки изоляции и хранения.
    10. С помощью пинцета и ножниц, вырезать и отгибают остальной части слоя эпидермиса. Вырезать через брюшную стенку и брюшину и асептически удалить опухоль мочевого пузыря для иммуногистохимии (IHC) и вестерн-блоттинга.
    11. Сбор селезенки для анализа жизнеспособности клеток (Muse) и ELISpot. Для IHC, место опухоли мочевого пузыря в образце ткани кассеты и закрепить в охлажденном формалина в течение ночи при комнатной температуре.
    12. На следующий день, замените формалина с 70% этанола.
    13. Для Вестерн-блоттинга опухоли, гомогенизировать опухоли, добавить белок экстракционного буфера плюс ингибиторы протеазы Остановка и передать 1,5 мл микроцентрифужных пробирок.
    14. Vortex в течение 30-60 сек и удерживайте на льду в течение 5 мин. Ледяная вспышка в жидком азоте и оттепели в окружающей воде. Повторите процесс встряхивания, замораживания и оттаивания в два раза.
    15. Центрифуга образцов при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ° C и передачи клеточных экстрактов к новым помечены труб.
    16. Количественная оценка концентрации, выполняя бицинхониновой анализа белка кислота (BCA) на белок измерений. Магазин образцы при -80 ° С до готовности для Вестерн-блоттинга.

3. Молекулярная биология / Западная

Следующие процедуры были выполнены для проверки экспрессии MUC1 в мышиной опухоли мочевого пузыря ткани, используя стандартный протокол Вестерн-блоттинга (данные не показыватьп).

  1. Отделить белковые экстракты помощью электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле (SDS-PAGE), а затем передать на PVDF мембраны использованием полусухого аппарата.
  2. Блок мембранного белка передается с 5% обезжиренным молоком в 0,1% Твин-20 в фосфатном буферном растворе (PBS-T), рН 7,4, в течение 1 часа на орбитальном шейкере при комнатной температуре.
  3. Инкубируйте мембраны в течение 1 часа при комнатной температуре на шейкере с анти-MUC1 или анти-β-актин антител в 0,1% PBS-T.
  4. Промойте мембраны путем декантации раствора и добавлением 0,1% PBS-T. Вихревой мембраны на шейкере в течение 5 мин и декантируют. Повторите этот шаг дважды.
  5. Инкубируйте мембраны в течение 1 часа при комнатной температуре с пероксидазой хрена (HRP), конъюгированных вторичных антител.
  6. Промыть 3 раза (см. шаг 3.4).
  7. Следуйте протокол для расширенного Chemiluminesence (ECL) комплект для активации и читать флюорографию.

4. Мультиплекс Флуорометрические иммуноферментного Microbead

  1. Установка и расчеты
    1. Используя 96-луночный планшет карте, назначать заготовки, стандарты, контроль и неизвестными в лунки. Рассчитать количество и объем анализируемых веществ, захват антител и Стрептавидин-Фикоэритрин (SA-PE), необходимых для анализа.
    2. Разрешить все буферы и разбавителей для уравновешивания до комнатной температуры. Подготовка стандартов и разбавлений образца, используя пустой 96-луночного планшета.
    3. Восстановить матрицу сыворотки и лиофилизированный стандарт в соответствии с протоколом производителя и сделать 1:05 последовательного разведения стандарта с соответствующими разбавителя в 96-луночный планшет. В контрольные лунки, использовать соответствующий разбавитель.
    4. Развести все элементы управления и неизвестных образцов 1:02 в соответствующем разбавителе в остальных 96-луночного планшета.
    5. Для шарик смеси, пипеткой требуемое количество соответствующего разбавителя в 15 мл пробирку. Вихревые каждый шарик флакона в течение 20 сек и пипеткой требуемое количество каждого анализируемого вещества в 15 мл пробирку.
    6. Всегда защищайте бусы из света, чтобы избежать фотообесцвечивания. Не ставьте 96-луночный планшет на абсорбирующий материал, чтобы избежать потери образца через влагу.
  2. Протокол анализа
    1. Предварительно смочите 96-луночных фильтр нижнюю пластину 200 мкл буфера для анализа и позволяют полной пропитки фильтра. Аккуратно слить с использованием 96-луночного планшета вакуумный аппарат и высушить в нижней части пластины с бумажным полотенцем.
    2. С помощью многоканальной пипетки, пипетки 25 мкл сыворотки матрицы в лунки назначенные для заготовки и стандартов пипеткой 25 мкл буфера для анализа в лунки назначенные для управления и неизвестных.
    3. Внесите 25 мкл пустым, стандартов, контролей и неизвестных соответствующих назначенных скважин. Вихревые шарик смеси в течение 20 с и передачи шарики с резервуаром.
    4. Пипеткой 25 мкл шарик смеси в каждую лунку. Закройте планшет с алюминиевой фольгой или непрозрачной крышкой пластины для защиты от света.
      5. встряхнуть пластины при 500 оборотах в минуту в течение двух часов при комнатной температуре на шейкере. Слить и промыть пластины с 200 мкл 0,1% Твина 20 в фосфатном буферном растворе (PBS-T) дважды. Слейте воду и промокните насухо.
    5. Приготовления раствора антител захвата. Пипеткой требуемое количество 0,1% PBS-T и захват антитела в 15 мл пробирку и вихревые течение 10 сек. Переносят смесь захватывающего антитела к резервуару и пипеткой 25 мкл в каждую лунку.
    6. Встряхнуть пластины при 500 оборотах в минуту в течение одного часа при комнатной температуре на шейкере. Слить и промыть пластины с 200 мкл 0,1% PBS-T в два раза. Слейте воду и промокните насухо.
    7. Подготовьте SA-PE решение. Внесите необходимые объеме 0,1% PBS-T и SA-PE в 15 мл трубки и вихревые течение 10 сек. Перенесите раствор в резервуар и пипеткой 25 мкл в каждую лунку.
    8. Встряхнуть пластины при 500 оборотах в минуту в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере. Слить и промыть пластины с 200 мкл 0,1% PBS-T в два раза. Слейте воду и BМного сухой.
    9. Вносят по 100 мкл 0,1% PBS-T и встряхивают на шейкере при 500 оборотах в минуту в течение по крайней мере двух минут ресуспендируют бисером. Читать и анализировать табличку на машине Luminex LX200.

5. IFN-γ/IL-4 ELISpot Получение и анализ

  1. В кабинете биологической безопасности, обрабатывают селезенки через 100 мкм ткань нейлон сита в 5 мл стерильного фосфатно-солевой буфер (PBS) в стерильные чашки Петри. Слой спленоцитам на 3 мл среды для отделения лимфоцитов в стерильные 15-мл пробирки.
  2. Центрифуга труб при 600 х г в течение 15 мин для отделения лимфоцитов из эритроцитов. Передача слоистых лимфоцитов выше градиент новые стерильные 15-мл пробирки.
  3. Отрегулируйте громкость до 10 мл стерильного PBS. Центрифугируют суспензию при 600 х г в течение 10 минут для осаждения клеток.
  4. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 1 мл PBS для жизнеспособности клеток и считать с Музойанализатора. Следуйте графа Muse и протокол Жизнеспособность Kit.
  5. Сделать серийные разведения лимфоцитов в 1,5 мл завинчивающейся крышкой центрифужные пробирки на коэффициенты разбавления 1:10, 1:20 и 1:40 (или в случае необходимости) в граф и жизнеспособность реагент (минимальный общий объем 300 мкл). Внесите каждого разведения вверх и вниз несколько раз перемешать и анализировать на Muse.
  6. Подготовьте тарелку карте образцов и условий для пластины ELISpot. Подготовьте ELISpot пластины в соответствии с протоколом производителя и пипеткой 100 мкл среды, пептидом (10 мкг / мл), либо борьба пептида (10 мкг / мл) в каждую лунку.
  7. Вносят по 100 мкл клеточной суспензии, обеспечивая 1,0 × 10 6 клеток в каждую лунку и инкубируют планшет при 37 ° С в течение ночи.
  8. Следуйте протоколу производителя для анализа ELISpot. Анализ проявленной пластины ELISpot использованием рассечение микроскопом.
  9. Количественная оценка результатов путем подсчета количества цветных пятен соответствующегнг каждого анализируемого вещества в каждую лунку. Пятна соответствуют количеству месте клетки, формирующие (SFC) в каждую лунку.

6. Иммуногистохимии (IHC) и гематоксилином и эозином (H & E) Окрашивание

  1. Возьмем опухоли мочевого пузыря ткани сохранена как описано выше (раздел 2.4.11), вставлять в парафин и шаг сечение в 4 мкм для иммуногистохимического анализа.
  2. Выполнение IHC использованием MUC1 антитело, которое распознает область тандемный повтор из MUC1. С помощью комплекта животных исследований пероксидаза, чтобы минимизировать реакционной способности вторичного антитела мыши с эндогенного иммуноглобулина, присутствующего в ткани.
  3. Выполните H & E окрашивания с использованием стандартных протоколов.

7. Статистические методы

Для Мультиплекс Флуорометрические иммуноферментного Microbead, используйте два-Стьюдента-тест, чтобы сравнить средние концентрации сыворотки наблюдается цитокинов между группами лечения и контроля. Для ELISpot, используя один-Wай ANOVA для сравнения месте образуя колонии между контрольными СМИ, яичницу пептидов и пептидных групп. Использование нескольких испытаний Сравнение Даннета, чтобы уменьшить вероятность ложного положительного результата. Р-величина которой ≤ 0,05 считается существенно отличается для всех анализов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Доклинической оценки воздействия новых иммунотерапии и их комбинаций при раке мочевого пузыря требует разработки соответствующей модели животного. В нашем трансгенных мышах, индукционные с химическим канцерогеном OH-BBN привел высокий уровень заболеваемости раком мочевого пузыря преимущественно TCC с некоторыми SCC, которая похожа на рак мочевого пузыря у людей. Для определения гистологической структуре опухоли, MUC1 выражение статуса и иммунный ответ на пептид лечение вакциной, 21 MUC1.Tg и 18 мышей дикого типа были по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешное индукции инвазивных переходных и плоскоклеточный рак мочевого пузыря у человека мышей MUC1.Tg предлагает доклинической модели иммунотерапии развития. Immunotherapeutic исследований требуют использования спонтанное, иммунных нетронутыми модель для оценки воспалительного ответа на прогрессирование опухоли с течением времени, а также иммунного ответа на иммунотерапии. В спонтанной модели развития опухоли, микроокружение опухоли остается неповрежденной и опухоли развиваются в более представительный темп роста, кото...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DPV, GTW, SMG, CJK, AMG и ЖКХ заявляют никакого конкурирующих интересов. ММР является главным исследователем грант, полученный от Merck KGaA и MW является сотрудником Merck KGaA.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить UC Davis Мышь биологии Программа для разведения мышей. Это исследование было поддержано грантом Merck KGaA, Дармштадт, Германия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>реагент 
N-бутил-N-(4-гидроксибутил)-нитрозамин (OH-BBN)TCI AmericaB0938
20 г Gavage NeedlesPopper Sons, Inc.7921
Пептидная вакцинаН/Д/Дисследуемый агент
BD МикротейнерыBD365957
Кассеты для тканейSimportM490-12
10% Нейтральный буферный формалинFisher ScientificSF100-4
Лизис БуферПирс87787
Остановить протеазу & Коктейль ингибиторов фосфатазыThermo Scientific78444
Pierce BCA Protein Assay KitPierce 23225
Мышиный цитокин 20plex InvitrogenLMC006
Магнитные микросферные бусиныLuminexMC100xx-01xx - это область шариков
Anti-mouse TNF-Capture АнтителоBD Pharmingen551225
Антитело против мышиного обнаружения ФНОBD Pharmingen554415
Антитело против мышиного захвата ИФНAbcamab10742
Антитело против мышиного ИФНAbcamab83136
PBS, pH 7,4SigmaP3813-10PAK
Tween-20FisherBP337-500
Буфер для анализаMilliporeL-MAB
Цитокин СтандартМиллипорMXM8070
Мультиэкран HTS 96well Фильтрующие пластиныMilliporeMSBVN1210
SA-PEInvitrogenSA10044
100 м Сита для нейлоновой тканиBD352360
Среда для разделения спленцитовLonza17-829E
TNF- /IL-4 ELISpot пластиныНИР D SystemsELD5217
Rabbit Anti-MUC1 моноклональное антителоEpitomics2900-1
Goat Anti-actin моноклональное антителоSigmaA1978
Anti-rabbit HRP антителаPromegaW401B
Goat anti-mouse HRP антителаSanta Cruz Biotechnology, Inc.SC-2005
PVDF мембранаBioRad162-0174
Mini Protean TGX Сборные гелиBioRad456-1083
Muse Count & Набор для обеспечения жизнеспособностиMilliporeMCH100104
MUC1 АнтителоBD Pharmingen550486IHC антитела
Animal Research Peroxidase KitDakoK3954IHC окрашивание
<сильно>Оборудование и программное обеспечение
Millipore планшетный вакуумный аппаратMilliporeMSVMHTS00
Luminex Lx200Millipore / Luminex40-013Производитель Luminex, распространяется Millipore
Luminex Xponent SoftwareMillipore / LuminexN/AVersion 3.1; входит в состав Luminex Lx200
Milliple Analyst SoftwareMilliplex / VigeneTech40-086Version 5.1
Muse Cell AnalyzerMillipore0500-3115
Muse SoftwareMilliporeN/AVersion 1.1.0.0; входит в состав анализатора
Диссекционирующий микроскопUnitronZ730
Graphpad Prism SoftwareGraphpad Software Inc.N/AVersion 5.1
Mini Protean Tetra Cell Gel аппаратBioRad165-8001
Trans Blot SD Cell и PowerPacBioRad170-3849
из нержавеющей стали Н

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R., Naishadham, D., et al. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
  2. Lynch, C. F., Davila, J. A. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. , National Cancer Institute, SEER Program. Bethesda, MD. 07-6215(2007).
  3. Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
  4. Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
  5. Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
  6. Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
  7. Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
  8. Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
  9. Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
  10. Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
  11. Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
  12. Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
  13. Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
  14. Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
  15. Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
  16. Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
  17. Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
  18. Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
  19. Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
  20. Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
  21. Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
  22. Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
  23. Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
  24. Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
  25. Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
  26. Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
  27. Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
  28. Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
  29. Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
  30. Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
  31. Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
  32. McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
  33. Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
  34. Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
  35. Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
  36. Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
  37. Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
  38. Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
  39. Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

OH BBNELISpotTh1

Похожие статьи