Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Быстрая генерация амилоида из нативных белков in vitro

6.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50869

⸱

5 декабря 2013 г.

 ,  , 
1Department of Immunology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

Белки могут либо принимать нативную структуру, либо неправильно сворачиваться в нерастворимый амилоид. Условия, благоприятствующие неправильному сворачиванию, приводят к образованию различных типов амилоидных фибрилл. Описанные здесь методы позволяют быстро превращать нативные белки в амилоид in vitro.

Аннотация

Белки выполняют важнейшие задачи в организмах, выполняя функции, возникающие из их специфических трехмерных складок. Несмотря на то, что нативные структуры полипептидов выполняют множество функций, в настоящее время признано, что большинство белков могут принимать альтернативную сборку амилоида, богатого бета-листами. Нерастворимые амилоидные фибриллы первоначально ассоциируются с множественными заболеваниями человека, но они все чаще проявляются как функциональные игроки, участвующие в различных важных клеточных процессах. Кроме того, амилоид, депонированный в тканях пациента, содержит небелковые компоненты, такие как нуклеиновые кислоты и гликозаминогликаны (ГАГ). Эти кофакторы могут способствовать образованию амилоида, что приводит к образованию различных типов нерастворимых осадков. Воспользовавшись нашим пониманием того, как белки неправильно сворачиваются через промежуточную стадию растворимого предшественника амилоида, мы разработали метод преобразования нативных белков в амилоидные фибриллы in vitro. Такой подход позволяет получать амилоид в больших количествах, изучать свойства амилоида, получаемого из конкретных белков, и оценивать структурные изменения, сопровождающие конверсию.

Введение

Белки являются наиболее распространенными биологическими макромолекулами, присутствующими во всех типах клеток. Они встречаются в самых разных размерах, структурах и посттрансляционных модификациях и выполняют огромный спектр важных биологических функций в своих естественных формах. Более двух десятков аберрантных полипептидов были вовлечены в многочисленные патологические состояния человека, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и диабет2 типа 1-4. Концевые неправильно свернутые белки накапливают в виде амилоидных фибрилл, нерастворимых стабильных агрегатов, которые возникают внеклеточно или внутриклеточно.

Несмотря на участие специфических белков в некоторых заболеваниях, все больше доказательств подтверждают, что все полипептиды обладают внутренними свойствами, которые обеспечивают трансформацию амилоида. Полногеномное исследование последовательностей выявило «амилом», благодаря которому склонные к амилоиду фрагменты составляют примерно 15% всех сегментов кодирующих пептидов от E. coli до человека. Соответственно, в последние годы обнаруживается все большее количество функциональных амилоидов, которые участвуют в различных важных клеточных процессах. Например, бактерии собирают амилоиды с образованием биопленочных и споровых структур, которые имеют решающее значение для их выживания и патогенеза6-9. Пептидные гормоны образуют амилоидные отложения во время хранения в секреторных гранулах млекопитающих перед высвобождением, что также означает, что белковая амилоидная форма может выполнять полезные биологические функции6,10,11. Кроме того, белки также могут собираться в амилоидные фибриллы для передачи критических клеточных сигналов12,13.

В течение многих лет наиболее изученные амилоиды получают из отдельных пептидов, которые связаны с заболеваниями человека, таких как бета-амилоид или прионный пептид. Эти пептиды обычно не имеют четко определенной структуры и со временем спонтанно образуют амилоид в растворе, что опосредовано частично неправильно свернутым промежуточным продуктом, который служит предшественником нерастворимого амилоида. Предшественником амилоида также называют растворимый белок олигомер, который встречается редко и нестабилен при образовании из природных пептидов14,15. Однако, как описано ранее, почти любой белок в принципе может принять амилоидную конформацию при соответствующих условиях. Недавно нами был разработан метод получения стабилизированных растворимых олигомеров нативных белков, которые легко образуют амилоид в присутствии различных кофакторов16. Полученные амилоидные фибриллы отражают сложную природу концевых белков, неправильно сворачивающих агрегаты17,18. Здесь мы используем термин «только белковый амилоид» для обозначения белковых фибрилл без кофакторов и гибридный амилоид для фибрилл, содержащих небелковые компоненты.

Ранее были разработаны различные методы получения амилоида in vitro с применением условий, которые, как известно, способствуют неправильному сворачиванию белка, такие как высокая температура, гидрофобная среда и колебания pH19-23. Тем не менее, они связаны с различными проблемами, такими как низкая эффективность, реверсивное складывание, большие вариации партий или медленная кинетика. Описанный здесь подход воспроизводим, легко масштабируется и позволяет точно контролировать сроки и условия конверсии амилоида.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка буфера MES

  1. Используйте MES-буфер (0,1 М 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты и 0,9 М NaCl) для получения как амилоида, содержащего только белки, так и стабилизированные растворимые белковые олигомеры. Весить 1,95 г MES и 5,27 г NaCl. Добавьте H2O и отрегулируйте pH до 4,7. Составляем итоговый объем до 100 мл. Хранить при температуре 4º C до 6 месяцев.

2. Приготовьте амилоид, состоящий только из белка, непосредственно из нативных белков

  1. Взвесьте выбранный белок (любой нативный белок или пептид) и восстановите до 10 мг/мл в буфере MES.
  2. Выдерживать при температуре 65 ºC на водяной бане в течение 4 часов. К концу периода в растворе виден белый осадок.
  3. Нейтрализуйте образец 10% (v/v) Tris-HCl (1 M, pH 10,5).
  4. Диализируйте белок в диализной кассете на ночь, чтобы заменить его в нужный буфер для дальнейшего анализа.
  5. Контрольный образец нативного белка можно получить, выполнив шаги 2.1, 2.3 и 2.4 без осаждения тепла (шаг 2.2).

3. Приготовьте гибридный амилоид из стабилизированных растворимых олигомеров нативных белков

  1. Приготовление стабилизированных олигомеров растворимого белка
    1. Взвесьте выбранный белок и восстановите до 10 мг/мл в буфере MES. Оставить при комнатной температуре на 15 минут.
    2. Взвесьте 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимимид гидрохлорид (EDC) и приготовьте свежий запас 20 мг/мл в буфере MES.
    3. Смешайте растворы белка и EDC в соотношении 2:5 (v/v), т.е. 2 мг белка на каждые 10 мг EDC.
    4. Выдерживать при комнатной температуре в течение 2 часов.
    5. Нейтрализуйте образец 10% (v/v) Tris-HCl (1 M, pH 10,5).
    6. Диализируйте белок в диализной кассете на ночь, чтобы заменить его в нужный буфер для дальнейшего анализа.
    7. Храните стабилизированный растворимый белковый олигомер при температуре 4 ºC до 4 недель.
  2. Готовят гибридные амилоиды из стабилизированного олигомера растворимого белка.
    1. Для получения ДНК-содержащего амилоида необходимо смешать ДНК и стабилизированный олигомер растворимого белка в соотношении 1:1 (w/w). Оставьте при температуре 4 ºC не менее чем на 2 часа. В этот период нерастворимый осадок виден в растворе при начальной концентрации белка 0,5 мг/мл или выше.
    2. Для получения РНК-содержащего амилоида необходимо смешать РНК и стабилизированный олигомер растворимого белка в соотношении 1:1 (w/w). Оставьте при температуре 4 ºC не менее чем на 2 часа. В этот период нерастворимый осадок виден в растворе при начальной концентрации белка 0,5 мг/мл или выше.
    3. Для получения гепаринсодержащего амилоида смешайте гепарин и стабилизированный олигомер растворимого белка в соотношении 1:1 (масса/масса). Оставьте при температуре 4 ºC не менее чем на 2 часа. В этот период нерастворимый осадок виден в растворе при начальной концентрации белка 0,5 мг/мл или выше.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Способность нативных белков напрямую превращаться в амилоиды основана на конформационных изменениях, происходящих при высокой температуре в MES-буфере. Выпадение осадка в растворе служит хорошим признаком агрегации белков и возможного образования амилоидов. С другой стороны, для стабилизации растворимых олигомеров белков используют EDC, который сшивает белки, закрепляя олигомерную конформацию, индуцированную в MES-буфере. В результате стабилизированные олигомеры белков представляют собой мультимерные белки (Рисун...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный здесь метод предлагает быстрое и гибкое средство для получения амилоидных фибрилл in vitro практически из любого белка или пептида по выбору. Можно надежно получить несколько различных типов амилоида - только белковые фибриллы или гибридные агрегаты, содержащие ДНК, РНК или гликозаминогликаны. Необходимые процедуры просты, понятны и не требуют продвинутой технической подготовки. Амилоид, полученный таким методом, достаточно стабилен и может безопасно храниться при температуре 4 ºC или замораживаться пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа поддерживается грантами для W.C. от Национальных институтов здравоохранения Грант AI074809 и Программой институциональных исследований Онкологического центра им. М. Д. Андерсона Техасского университета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота (MES)Sigma-AldrichM8250
NaClFisherBP358-10
1-этил-3-[3-диметил-аминопропил] карбодиимида гидрохлорид (EDC)Thermo/Pierce22980
ДНК из спермы лососяSigmaD1626
РНК из дрожжей торулыSigmaR6625
Гепарин из слизистой оболочки кишечника свиньиSigmaH3149
Tris baseFisherBP152-1
Оборудование:
Водяная баняFisher ScienceIsotemp 210
Slide-A-Lyzer диализная кассетаThermo/Pierce66380

Ссылки

  1. Selkoe, D. J. Folding proteins in fatal ways. Nature. 426, 900-904 (2003).
  2. Schnabel, J. Protein folding: The dark side of proteins. Nature. 464, 828-829 (2010).
  3. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366 (2006).
  5. Goldschmidt, L., Teng, P. K., Riek, R., Eisenberg, D. Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3487-3492 (2010).
  6. Fowler, D. M., Koulov, A. V., Balch, W. E., Kelly, J. W. Functional amyloid - from bacteria to humans. Trends Biochem. Sci. 32, 217-224 (2007).
  7. Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli Curli Operons in Directing Amyloid Fiber Formation. Science. 295, 851-855 (2002).
  8. Barnhart, M. M., Chapman, M. R. Curli Biogenesis and Function. Annu. Rev. Microbiol. 60, 131-147 (2006).
  9. Claessen, D., et al. A n olved in aerial hyphae formation in Streptomyces coelicolor by forming amyloid-like fibrils. Genes Dev. 17, 1714-1726 (2003).
  10. Maji, S. K., et al. Functional Amyloids As Natural Storage of Peptide Hormones in Pituitary Secretory Granules. Science. 325, 328-332 (2009).
  11. Badtke, M. P., Hammer, N. D., Chapman, M. R. Functional Amyloids Signal Their Arrival. Sci. Signal. 2, pe43(2009).
  12. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
  13. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
  14. Stefani, M. Biochemical and biophysical features of both oligomer/fibril and cell membrane in amyloid cytotoxicity. FEBS J. 277, 4602-4613 (2010).
  15. Glabe, C. G. Structural classification of toxic amyloid oligomers. J. Biol. Chem. 283, 29639-29643 (1074).
  16. Di Domizio, J., et al. Binding with nucleic acids or glycosaminoglycans converts soluble protein oligomers to amyloid. J. Biol. Chem. 287, 736-747 (2012).
  17. Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).
  18. Jiménez, J. S. Protein-DNA Interaction at the Origin of Neurological Diseases: A Hypothesis. J. Alzheimer's Dis. 22, 375-391 (2010).
  19. Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin. J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).
  20. Vetri, V., et al. Bovine Serum Albumin protofibril-like aggregates formation: Solo but not simple mechanism. Arch. Biochem. Biophysics. 508, 13-24 (2011).
  21. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
  22. McParland, V. J., Kalverda, A. P., Homans, S. W., Radford, S. E. Structural properties of an amyloid precursor of b2-microglobulin. Nat. Struct. Mol. Biol. 9, 326-331 (2002).
  23. Chiti, F., et al. Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3590-3594 (1999).
  24. McParland, V. J., et al. Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro. Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).
  25. Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin. Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).
  26. Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid. Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).
  27. Di Domizio, J., et al. Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).
  28. Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β. Nat. Immunol. 9, 857(2008).
  29. Masters, S. L., O'Neill, L. A. Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome. Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Образование амилоидовнеправильное сворачивание белковбуфер MESтермическое осаждениесшивка с помощью EDCамилоиды нуклеиновых кислотгепариновые амилоидырастворимые олигомеры белкованализ сдвига в гелеанализ цитотоксичности
Быстрая генерация амилоида из нативных белков in vitro
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.