Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Методы идентификации ЯМР-резонансов 13C-диметилN-концевого амина на редуктивно метилированных белках

5.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50875

⸱

12 декабря 2013 г.

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Louisiana State University

В этой статье

Краткое содержание

Описаны два метода назначения сигналов ядерного магнитного резонанса α- и ε-диметиламина восстановительно 13С-метилированного N-концевого лизина. Один метод использует pH-индуцированную селективность реакции восстановительного метилирования, а другой использует аминопептидазу для селективного удаления N-концевого лизина.

Аннотация

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) является проверенным методом для изучения структуры и динамики белков. Для изучения белков с помощью ЯМР стабильные магнитные изотопы обычно включаются метаболически для повышения чувствительности и обеспечения последовательного резонансного назначения. Восстановительное 13С-метилирование является альтернативным методом мечения белков, которые не поддаются сверхэкспрессии бактериального хозяина, наиболее распространенным методом включения изотопов. Восстановительное 13-С-метилирование — это химическая реакция, протекающая в мягких условиях, которая модифицирует основные аминогруппы белка (лизин ε-аминогруппы и N-концевая α-аминогруппа) до 13С-диметиламиногрупп. Структура и функция большинства белков не изменяются в результате модификации, что делает ее жизнеспособной альтернативой метаболическому мечению. Поскольку восстановительное 13-С-метилирование добавляет разреженные изотопные метки, традиционные методы назначения сигналов ЯМР неприменимы. Был разработан альтернативный метод назначения с использованием масс-спектрометрии (МС) для помощи в назначении сигналов ЯМР белка 13С-диметиламина. Метод основан на частичном и различном количестве 13С-мечения в каждой первичной аминогруппе. Одно из ограничений метода возникает, когда N-концевой остаток белка является лизином, потому что α- и ε-диметиламиногруппы Lys1 не могут быть измерены индивидуально с помощью МС. Чтобы обойти это ограничение, описаны два способа идентификации ЯМР-резонанса 13С-диметиламинов, связанных как с N-концевым α-амином, так и с боковой цепью ε-амином. Сигналы ЯМР N-концевого α-диметиламина и боковой цепи ε-диметиламина лизоцима белка куриного яйца, Lys1, идентифицированы в 1спектре гетеронуклеарной одноквантовой когерентности H-13C.

Введение

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) является ценным инструментом для выяснения структуры белков1. ЯМР-спектроскопия может быть использована для определения структуры раствора белка в его нативном состоянии. Чтобы преодолеть низкую естественную распространенность стабильных магнитных изотопов, необходимо включить 13C и 15N в интересующий белок. Наиболее распространенным методом является рекомбинантная экспрессия в организме бактерии-хозяина2-3. Тем не менее, два недостатка гиперэкспрессии бактериального хозяина заключаются в том, что она не может вызывать посттрансляционные модификации и работает не для всех белков3-4. Когда бактериальная экспрессия не является жизнеспособным путем для производства белка, можно использовать сверхэкспрессию у небактериальных хозяев, но изотопное мечение является сложным и дорогостоящимпроцессом 5. Альтернативные методы экспрессии для включения изотопов 13С и 15N в белки для ЯМР-анализа включают методы разреженного мечения с использованием метаболических предшественников для метильного мечения6 и одиночных аминокислот 13С, 15N7-9. Химический подход к разреженному мечению, используемый в настоящем документе, представляет собой хорошо зарекомендовавшую себя реакцию восстановительного 13С-метилирования (рис. 1), в которой первичные аминогруппы белка - N-концевой α-амин и лизин боковой цепи ε-аминов - метилируются. После образования монометиламинов амин легко подвергается повторному метилированию из-за более высокого значения pKa, образуя диметиламины.

Восстановительное метилирование впервые было представлено как метод химической модификации белков с помощью Минса и Фини10. Преимущества этой реакции заключаются в ее широкой применимости и мягких условиях реакции при буферизованном, физиологическом pH и низких температурах11,12. В присутствии формальдегида и восстановителя, такого как диметиламино-борановый комплекс (DMAB), лизиновые ε-аминогруппы и N-концевая α-аминогруппа селективно метилируются с получением диметилированных аминов. Хотя известно, что формальдегид сшивает белки путем образования метиленовых мостиков, этот процесс блокируется восстановителем13,14.

Восстановительное метилирование было успешно использовано для изучения белков с помощью ЯМР и рентгеновской кристаллографии. Восстановительное метилирование используется для облегчения кристаллизации белков, которые в противном случае были бы неподатливы15. Лизоцим белка куриного яйца был первым белком, кристаллизованным в его диметилированной форме. Среднеквадратичная разность между тяжелыми атомами в метилированных и неметилированных лизоцимных структурах составляет 0,40Å16. Это сравнение демонстрирует, что структура белка может сохраняться после восстановительного метилирования, что делает реакцию жизнеспособным инструментом мечения для выяснения структуры.

Используя 13С-меченый формальдегид в реакции восстановительного метилирования, получают 13С-диметилированных аминов. 13С-диметиламинов являются ЯМР-детектируемыми зондами, которые широко используются для изучения динамики, структуры и функции белков. ЯМР и восстановительное 13С-метилирование были использованы для изучения белок-лигандных и белок-белковых взаимодействий для β2 адренергического рецептора17, рибонуклеазы А18, лизоцима19, белка20 гена fd 5 и цитохрома с21. Аналогичным образом, были изучены структурные и функциональные свойства редуктивно 13С-метилированной рибонуклеазы A22, лизоцима23, белка24 гена fd 5, ферредоксина Clostridium pasteurianum 25, Fc-фрагмента IgG26, аполипопротеина A-I27 и MIP-1α28. Динамика 13С-диметиламиногрупп была изучена на конканавалине А29-30 и кальмодулине31.

Несмотря на то, что восстановительное 13С-метилирование широко использовалось для изучения белков с помощью ЯМР, метод мечения всегда был ограничен трудностями присвоения резонансов ЯМР26. Большинство стратегий распределения редуктивно 13С-метилированных белков основывались на небольшом числе сайтов,20,28 известных структурных свойств11,19,23,26,31,32. или обширные генетические модификации33. Ни в одном из этих исследований не было успешно отнесены все 13пиков С-диметиламина, за исключением исследования кальмодулина, где пики были распределены по сайт-направленному мутагенезу каждого лизина33. В исследовании образования димеров MIP-1α впервые сообщалось об использовании масс-спектрометрии (МС) для помощи в назначении ЯМР восстановительно 13С-метилированных аминов28. Для идентификации лизина на границе раздела димера использовалась МС с матричной лазерной десорбцией ионизации (MALDI-TOF). Частично метилированные лизины триптических пептидов MIP-1α человека были идентифицированы с МС и коррелировали с появлением моно- и диметиламиновых сигналов интактного белка, наблюдаемых вспектрах 28 ЯМР 2D 1 H-13C HSQC. Наша группа подробно остановилась на использовании РС и представила метод присвоения, который не требует предварительных знаний о структуре белка или его свойствах, отличных от аминокислотной последовательности34. Этот метод применим к большинству белков. Одним из исключений является случай, когда белок имеет N-концевой лизин, потому что изотопный профиль MS N-концевого лизина α- и ε-13С-диметиламинов не может быть измерен независимо.

Здесь мы представляем два метода, один химический и один ферментативный, для идентификации N-концевого α-диметиламина и сайтов боковой цепи ε-диметиламина N-концевого остатка лизина. Первый метод был вдохновлен Córdova et al.которые использовали pH для контроля селективности ацетилирования белка35. Реакция благоприятствует N-концевому α-амину при низком pH и боковой цепи ε-аминам при высоком pH, что позволяет различать белковые α- и ε-аминогруппы в их исследованиях с помощью капиллярного электрофореза35. Мы демонстрируем, как высокий и низкий pH используется для изменения мечения белковых аминогрупп с помощью восстановительной реакции метилирования 13C, а также для применения стратегии назначения с помощью МС. Второй метод назначения N-концевых α- и ε-13С-диметиламинов использует преимущества селективного удаления N-концевых остатков с использованием рекомбинантной аминопептидазы Aeromonas proteolytica.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Восстановительное метилирование лизоцима

  1. Приготовьте 500 мл 50 мМ натрий-фосфатного буфера при pH 7,5. Хранить при комнатной температуре.
  2. Промаркируйте три пробирки микроцентрифуги объемом 1 мл для полностью меченого образца (FLS), частично меченого образца с низким pH (LpH) и частично меченого образца с высоким pH (HpH).
  3. Взвесьте 10 мг лизоцима и растворите в 2 мл фосфатно-натрийевого буфера до получения водного раствора с концентрацией 5 мг/мл. Накройте пробирки алюминиевой фольгой, чтобы защитить формальдегид от разложения под воздействием света. Добавьте по 500 мкл раствора лизоцима в каждую пробирку.
  4. Приготовьте свежие 1,0 М растворы диметиламина боранового комплекса (ДМАБ) и 13С-формальдегида. Хранить при температуре 0 °C.
  5. Для полностью меченого образца используйте молярное соотношение 1:10 (реакционноспособный амин: формальдегид), а для частично меченых образцов используйте соотношение 1:5. В качестве альтернативы соотношение можно оптимизировать. Например, для того, чтобы увидеть доминирование пика α-13C-диметиламина при низком pH, требовалось соотношение 2:7.
  6. Добавьте 6,1 мкл 1,0 М DMAB в FLS, добавьте 3,2 мкл 1,0 М DMAB в LpH и Hp и аккуратно сделайте вихрь. Затем добавьте 12,3 мкл 1,0 М 13С-формальдегида в FLS и 6,1 мкл 1,0 М 13С-формальдегида в LpH и HpH. Встряхните реакционные смеси при 4 °C в течение 2 ч.
  7. Добавьте еще одну аликвоту 1,0 М DMAB и 13С-формальдегида, как на предыдущем этапе, и встряхните реакционную смесь в течение ночи при 4 °C для общего времени реакции 18-24 часа.
  8. Замените буфер образца на фосфат при pH 7,5 для удаления избытка реагентов и побочных продуктов с помощью центробежного фильтра (отсечка молекулярной массы 3 кДа).
  9. Для частично меченых образцов восстановительно метилируйте образцы при pH 7,5 с помощью формальдегида естественного содержания для создания гомогенного модифицированного белка. Готовят новые 1,0 М растворы ДМАБ и природного содержания формальдегида.
  10. Накройте пробирки с образцами фольгой, добавьте 6,1 мкл DMAB к LpH и HpH, и аккуратно перемешайте. Затем добавьте 12,3 μл природного содержания формальдегида. Встряхните реакционные смеси при температуре 4 °C в течение 2 часов.
  11. Добавьте еще одну аликвоту 1,0 М DMAB и натуральную концентрацию формальдегида, как на предыдущем этапе, и встряхните реакционные смеси в течение ночи при 4 °C для общего времени реакции 18-24 часа. Затем замените буфер с помощью шагов 2.5-2.6 и храните образцы 50 мкг при -20 °С для МС.

2. Подготовьте образец для ЯМР-анализа

  1. Приготовьте 2,0 М буферный раствор бората натрия при pH 8,5 вH2O.
  2. Добавьте 375 мкл 2,0 М буферного раствора бората натрия в четыре конические пробирки по 15 мл. Запишите верхушки на пленку и проделайте отверстия. Поместите колбу в лиофилизирующую колбу и заморозьте образец.
  3. Поместите замороженный образец на лиофилизатор для просушки. Удалите, когда высохнет.
  4. С помощью пипетки добавьте по 15 мл D2O в каждую пробирку и перемешайте.
  5. Пометьте три центробежных фильтра объемом 4 мл (отсечка молекулярной массы 3 кДа) FLS, LpH и HpH. Добавьте соответствующий образец в пробирки фильтра (~500 μл). Добавьте в каждую пробирку по 3,0 мл буфера из 50 мМ бората натрия при pH 8,5. Изготовьте балансировочную трубку для третьей пробирки и сконцентрируйте образцы до 500 мкл с помощью центрифуги с ротором с фиксированным углом наклона 35° при 4 °C и 7 500 RCF.
  6. Опорожните ловушку под каждым фильтром. Добавьте к образцам еще 3,0 мл буфера и снова сконцентрируйте образцы до 500 μл. Повторите шаг 2.5 4 раза.
  7. С помощью анализа белка бицинхониновой кислоты (БЦА)36 определяют концентрацию каждого образца. Разбавьте образцы лизоцима буфером из бората натрия 50 мМ до получения образцов с концентрацией 150 мкМ.
  8. Перенесите 530 мкл в ЯМР-трубку диаметром 5 мм или 250 мкМ в трубку с магнитной восприимчивостью 5 мм.
  9. Приготовьте 80 мМ стоковый раствор 1,2-дихлорэтана-13 С2 в D2O. Храните этот стоковый раствор при -80 °С. Разведите до 24 мМ в 80 мкл и переложите в коаксиальную вставную трубку для использования в качестве эталона в ЯМР-анализе. Проанализируйте образцы с помощью ЯМР. Примечание: Запустите 1D 1 H-13C HSQC и интегрируйте пиковые области для каждого резонанса. Пиковые площади должны быть одинаковыми для полностью меченого образца.

3. Деградация лизоцима аминопептидазой

  1. Приготовьте раствор лизоцима в ультрачистой воде в дозе 5 мг/мл.
  2. Добавьте 250 μл раствора лизоцима в чистую центрифужную пробирку объемом 1 мл.
  3. Добавьте 25 мкл 0,1 М раствора трицина, pH 8,0 и 6 мкл 2,16 мкг/мл раствора аминопептидазы Aeromonas proteolytica.
  4. Инкубировать при 37 °C в течение 6 часов.
  5. Добавьте в образец еще 6 мкл раствора аминопептидазы 2,16 мкг/мл для получения молярного отношения аминопептидазы к лизоциму в соотношении 1:50. Инкубировать для добавления 20 часов при 37 °C.
  6. Обессолите 30 мкл образца с помощью спиновой колонки C18 (в соответствии с протоколом производителя). Хранить при температуре -20 °C для анализа MALDI MS.
  7. Подготовьте оставшийся образец белка для ЯМР в соответствии с протоколом 2).

4. Подготовка образцов для масс-спектрометрии

  1. Используя 50 мкг образца, зарезервированного на этапе 2.3, замените буфер на 100 мМ бикарбоната аммония, pH 8,0, и сконцентрируйте примерно до 50 мкл, используя центробежный фильтр объемом 1 мл (отсечка молекулярной массы 3 кДа). Переложите образец в центрифужную пробирку объемом 1 мл и заверните в алюминиевую фольгу.
  2. Добавьте 2,0 мкл 500 мМ дитиотреитола для уменьшения дисульфидных связей. Инкубировать раствор при температуре 60 °C в течение 1 часа.
  3. Добавьте 2 мкл свежеприготовленного 500 мМ йодоацетамида для алкилирования тиоловых групп. Выдерживать при комнатной температуре в течение 20 минут.
  4. Снимите фольгу и добавьте 1,0 мкл 500 мМ раствора дитиотреита, чтобы погасить реакцию.
  5. Добавьте 2,0 мкг трипсина секвенционного качества, чтобы переварить белок. Инкубировать смесь при температуре 37 °C в течение 16-24 часов.
  6. Добавляйте ТФК до тех пор, пока pH не станет меньше 2, чтобы угасить пищеварение. (Также можно использовать муравьиную и уксусную кислоты)
  7. Обессолите образец на спиновой колонке C18 и разбавьте белок в 80% ацетонитрила/0,1% TFA. Высушите образец с помощью вакуумного концентратора.
  8. Восстановите образец в 5,0 мкл 50% ацетонитрила/0,1% TFA для анализа MALDI MS. Смешайте равные объемы восстановленного образца и насыщенный раствор матричного раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты на целевой пластине MALDI. Проанализируйте образцы на MALDI MS. Примечание: Используйте тандемный MS для подтверждения идентичности пептидных пиков. Сгладьте масс-спектры и проанализируйте. Для каждого диметиламинсодержащего пептида определите пиковую интенсивность и пиковую площадь каждого изотопа в профиле. Рассчитайте процент 13С-инкорпорации, как описано ранее34.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Восстановительное метилирование и pH

На примере лизоцима была продемонстрирована pH-индуцированная хемоселективная восстановительная 13C-метилизация. При низком значении pH реакция протекает преимущественно по N-терминальному α-амину, а не по ε-аминам боковых цепей, и наоборот при высоком pH. В растворе аминогруппы белка находятся в равновесии между свободным амином и сопряженной кислотой, которое можно регулировать с помощью pH. Оптимальный диапазон pH для этой реакции зависи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Присвоение сигналов ЯМР редуктивно 13С-метилированных белков необходимо для полного использования этого метода изотопного мечения. Использование МС для помощи в распределении сигналов ЯМР через корреляцию данных частичного 13-С-включенияявляется многообещающим методом. Преимущество этого метода перед другими методами назначения заключается в том, что требуется только первичная аминокислотная последовательность. Метод назначения с помощью РС ограничен, когда N-концевая аминокислота является лизином, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано премией номер R00RR024105 от Национального центра исследовательских ресурсов, Национального института здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АцетонитрилSigma34851
Amicon Ultra 4 мл центробежный фильтр (3k MWCO)Fisher ScientificUFC800308 (8шт)
АминопептидазаCreative BiomartАминопептидаза-86А
Бикарбонат аммонияSigmaA6141
Сульфат аммонияSigmaA5132
Боран-диметиламиновый комплексСигма180238Внесите свежий 1 М раствор перед применением.
Борная кислотаSigmaB6768
Инсулин поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigmaI5500
C18 Спиновые колонкиThermo Scientific89870
Оксид дейтерияКембриджские изотопные лабораторииDLM-4-100
1,2-дихлорэтан-13C2Sigma71432180 мМ стоковый раствор, хранящийся при -80 °C. Используется в качестве эталона в спектрах ЯМР при 24 мМ.
Формальдегид (36,5% мас./масса)Sigma33220Перед применением приготовьте свежий 1 М раствор.
13C-формальдегид (99%)Cambridge Isotope LaboratoriesCLM-806-1Приготовьте свежий 1 М раствор перед использованием.
Лизоцим (белок куриного яйца)SigmaL6376
Фосфат натрия (двухосновной гептагидрат)SigmaS9390
Фосфат натрия (одноосновный)SigmaS9638
ТрицинSigmaT0377
Трифторуксусная кислотаSigma302031
700 МГц Varian VNMRS с зондом 5 мм HCN 5922Agilent Технологии
Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOFBruker

Ссылки

  1. Bax, A., Grzesiek, S. Methodological Advances in Protein NMR. Accounts of Chemical Research. 26 (4), 131-138 (1993).
  2. Shimba, N., Yamada, N., Yokoyama, K., Suzuki, E. Enzymatic Labeling of Arbitrary Proteins. Analytical Biochemistry. 301 (1), 123-127 (2002).
  3. Palomares, L., Estrada-Moncada, S., Ramírez, O. Production of Recombinant Proteins. Recombinant Gene Expression. Balbás, P., Lorence, A. 267, Humana Press. New York City, New York, USA. 15-51 (2004).
  4. Graslund, S., et al. Protein Production and Purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  5. Terwilliger, T. C., Stuart, D., Yokoyama, S. Lessons from Structural Genomics. Annual Review of Biophysics. 38, 371-383 (2009).
  6. Goto, N. K., Kay, L. E. New Developments in Isotope Labeling Strategies for Protein Solution NMR Spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 10 (5), 585-592 (2000).
  7. Lian, L., Middleton, D. Labelling Approaches for Protein Structural Studies by Solution-State and Solid-State NMR. Progress in Nuclear Magn. Reson. Spectroscopy. 39 (3), 171-190 (2001).
  8. Mason, A., Siarheyeva, A., Haase, W., Lorch, M., van Veen, H., Glaubitz, C. Amino Acid Type Selective Isotope Labelling of the Multidrug ABC Transporter LmrA for Solid-State NMR Studies. Febs Lett. 568 (1-3), 117-121 (2004).
  9. Chen, C., et al. Preparation of Amino-Acid-Type Selective Isotope Labeling of Protein Expressed in Pichia pastoris. Proteins:Structure Function and Bioinformatics. 62 (1), 279-287 (2006).
  10. Means, G., Feeney, R. Reductive Alkylation of Amino Groups in Proteins. Biochem. 7 (6), 2192 (1968).
  11. Jentoft, J. E., Jentoft, N., Gerken, T. A., Dearborn , D. G. C-13 NMR-Studies of Ribonuclease-A Methylated With Formaldehyde-C-13. J. Biol. Chem. 254 (11), 4366-4370 (1979).
  12. Rayment, I. Reductive alkylation of lysine residues to alter crystallization properties of proteins. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276 (97), 171-179 (1997).
  13. French, D., Edsall, J. T. The Reactions of Formaldehyde with Amino Acids and Proteins. Adv. Protein Chem. 2, 277-335 (1945).
  14. Jentoft, N., Dearborn, D. G. Labeling of Proteins by Reductive Methylation Using Sodium Cyanoborohydride. J. Biol. Chem. 254 (11), 4359-4365 (1979).
  15. Walter, T., et al. Lysine Methylation as a Routine Rescue Strategy for Protein Crystallization. Struct. 14 (11), 1617-1622 (2006).
  16. Rypniewski, W., Holden, H., Rayment, I. Structural Consequences of Reductive Methylation of Lysine Residues in Hen Egg-White Lysozyme - An X-ray Analysis at 1.8-Angstrom Resolution. Biochem. 32 (37), 9851-9858 (1993).
  17. Bokoch, M. P., et al. Ligand-specific regulation of the extracellular surface of a G-protein-coupled receptor. Nat. 463 (7277), (2010).
  18. Jentoft, J., Gerken, T., Jentoft, N., Dearborn, D. C-13] Methylated Ribonuclease-A - C-13 NMR Studies of the Interaction of Lysine 41 with Active Site. 256 (1), 231-236 (1981).
  19. Sherry, A., Teherani, J. Physical Studies of C-13-Methylated Concanavalin A - pH and Co2+-Induced Nuclear Magn. Reson. Shifts. J. Biol. Chem. 258 (14), 8663-8669 (1983).
  20. Dick, L., Sherry, A., Newkirk, M., Gray, D. Reductive Methylation and C-13 NMR Studies of the Lysyl Residues of fd Gene 5 Protein - Lysines 24, 46, and 69 May be Involved in Nucleic Acid Binding. J. Biol. Chem. 263 (35), 18864-18872 Forthcoming.
  21. Moore, G. R., et al. N-epsilon,N-epsilon-dimethyl-lysine cytochrome c as an NMR probe for lysine involvement in protein-protein complex formation. Biochem. J. 332, 439-449 (1998).
  22. Jentoft, J. E., Gerken, T. A., Jentoft, N., Dearborn, D. G. Studies of the Active-Site Lysine of Ribonuclease-A By C-13 NMR. Biophys. J. 25 (2), 56 (1979).
  23. Gerken, T., Jentoft, J., Jentoft, N., Dearborn, D. Intramolecular Interactions of Amino Groups in C-13 Reductively Methylated Hen Egg-White Lysozyme. J. Biol. Chem. 257 (6), 2894-2900 (1982).
  24. Dick, L. R., Geraldes, C., Sherry, A. D., Gray, C. W., Gray, D. M. C-13 NMR of Methylated Lysines of fd Gene-5 Protein - Evidence for A Conformational Change Involving Lysine-24 Upon Binding of A Negatively Charged Lanthanide Chelate. Biochem. 28 (19), 7896-7904 (1989).
  25. Gluck, M., Sweeney, W. V. C-13-NMR of Clostridium-Pasteurianum Ferredoxin After Reductive Methylation of the Amines Using C-13 Formaldehyde. Biochimica Et Biophysica Acta. 1038 (2), 146-151 (1990).
  26. Jentoft, J. E. Reductive Methylation and C-13 Nuclear-Magnetic-Resonance in Structure-Function Studies of Fc Fragment and Its Subfragments. Methods in Enzymology. 203, 261-295 (1991).
  27. Sparks, D., Phillips, M., Lundkatz, S. The Conformation of Apolipoprotein A-I in Discoidal and Spherical Recombinant High Density Lipoprotein Particles - C-13 NMR Studies of Lysine Ionization. J. Biol. Chem. 267 (36), 25830-25838 (1992).
  28. Ashfield, J., et al. Chemical Modification of a Variant of Human MIP-1 Alpha, Implications for Dimer Structure. Protein Science. 9 (10), 2047-2053 (2000).
  29. Goux, W., Teherani, J., Sherry, A. Amine Inversion in Proteins - A C-13-NMR Study of Proton Exchange and Nitrogen Inversion Rates in N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha-[C-13]Tetramethyllysine, N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha[C-13]Tetramethyllysine Methyl-Ester, and Reductively Methylated Concanavalin-A. Biophysical Chemistry. 19 (4), 363-373 (1984).
  30. Sherry, A. D., Keepers, J., James, T. L., Teherani, J. Methyl Motions in C-13 Methylated Concanavalin-as Studied by C-13 Magnetic-Resonance Relaxation Techniques. Biochemistry. 23 (14), 3181-3185 (1984).
  31. Huque, M., Vogel, H. C-13 NMR Studies of the Lysine Side Chains of Calmodulin and Its Proteolytic Fragments. Journal of Protein Chemistry. 12 (6), 695-707 (1993).
  32. Brown, L., Bradbury, J. Proton-Magnetic-Resonance Studies of Lysine Residues of Ribonuclease-A. Eur. J. Biochem. 54 (1), 219-227 (1975).
  33. Zhang, M., Vogel, H. Determination of the Side Chain pKa Values of the Lysine Residues in Calmodulin. J. Biol. Chem. 268 (30), 22420-22428 (1993).
  34. Macnaughtan, M., Kane, A., Mass Prestegard, J. Spectrometry Assisted Assignment of NMR Resonances in Reductively C-13-Methylated Proteins. J. Am. Chem. Soc. 127 (50), 17626-17627 (2005).
  35. Cordova, E., Gao, J., Whitesides, G. M. Noncovalent Polycationic Coatings for Capillaries in Capillary Electrophoresis of Proteins. Anal. Chem. 69 (7), 1370-1379 (1997).
  36. Smith, P. K., et al. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  37. Larda, S. T., Bokoch, M. P., Evanics, F., Prosser, R. S. Lysine methylation strategies for characterizing protein conformations by NMR. J. Biomolec. NMR. 54 (2), 199-209 (2012).
  38. Bradbury, J. H., Brown, L. R. Determination of Dissociation Constants of Lysine Residues of Lysozyme by Proton-Magnetic-Resonance Spectroscopy. Eur. J. Biochem. 40 (2), 565-576 (1973).
  39. Frey, S. T., Guilmet, S. L., Egan, R. G., Bennett, A., Soltau, S. R., Holz, R. C. Immobilization of the Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica on Mg2+/Al3+ Layered Double Hydroxide Particles. Acs Appl. Mater., & Interfaces. 2 (10), 2828-2832 (2010).
  40. Poncz, L., Dearborn, D. G. The Resistance to Tryptic Hydrolysis of Peptide-Bonds Adjacent to N-epsilon,N-Dimethyllysyl Residues. J. Biol. Chem. 258 (3), 1844-1850 (1983).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Присвоение резонансов ЯМРвосстановительное метилирование C13мечение белковмасс-спектрометрический анализмодификация лизоцимагетероядерная одноквантовая когерентностьдеградация аминопептидазойпроцедура обмена буферавключение изотопа углеродадетектирование N-концевого амина
Методы идентификации ЯМР-резонансов 13C-диметилN-концевого амина на редуктивно метилированных белках
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.