Caenorhabditis Elegan является полезной моделью для изучения функции полиненасыщенных жирных кислот в развитии и физиологии. Этот протокол описывает эффективный метод дополняющий C. Элеганс диета с полиненасыщенными жирными кислотами.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Диетических добавок полиненасыщенных жирных кислот в
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Жирные кислоты необходимы для многочисленных клеточных функций. Они выступают в качестве эффективных молекул хранения энергии, составляют гидрофобного ядра мембран, а также участвовать в различных сигнальных путей. Caenorhabditis Элеганс синтезирует все ферменты, необходимые для производства целого ряда омега-6 и омега-3 жирных кислот. Это, в сочетании с простой анатомии и диапазон доступных генетических инструментов, делают его привлекательным моделью для изучения функции жирных кислот. Для того чтобы исследовать генетические пути, которые опосредуют физиологические эффекты биологически активных жирных кислот, мы разработали метод в целях пополнения C. Элеганс диета с ненасыщенных жирных кислот. Дополнение является эффективным средством для изменения состава жирных кислот червей, а также может быть использован, чтобы спасти дефекты в кислых дефицитом мутантов жирных. Наш метод использует нематод роста среднего агар (NGM) с добавлением жирных acidsodium солей. Жирные кислоты в дополненных пластин стать IncorporaТед в мембраны бактериальной источника пищи, который затем, с которой соприкасается С. Элеганс, которые питаются на дополненных бактерий. Мы также описываем протокол газовой хроматографии для мониторинга изменений в составе жирных кислот, которые происходят в дополненных червей. Это эффективный способ пополнить рацион больших и малых популяций C. Элеганс, что позволяет для ряда приложений для этого метода.
Введение
Жирные кислоты необходимы структурные компоненты мембран, а также молекулы эффективного хранения энергии. Кроме того, жирные кислоты можно отщепить от клеточных мембран по липаз и быть ферментативно модифицированы с получением сигнализации эффекторы 1. Природные полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) содержат два или более цис двойные связи. Омега-3 жирные кислоты и омега-6 жирные кислоты отличаются друг от друга на основе позиции двойных связей по отношению к концевой метильной группы жирной кислоты. Здоровые диеты требуют как омега-6 и омега-3 жирных кислот. Тем не менее, западные диеты особенно богаты омега-6 жирных кислот и бедными в омега-3 жи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Полиненасыщенные жирные кислоты являются чувствительными к тепла, света и кислорода. Таким образом, необходимо соблюдать осторожность при подготовке добавок пластины жирных кислот, такие жирные кислоты, которые не подвергались воздействию избыточного тепла и света. NGM среды, содержащие 0,1% Tergitol (NP-40) в автоклаве и частично охлаждают, после чего натриевые соли жирных кислот добавляют при постоянном перемешивании. Планшеты дают высохнуть в темноте. Поглощение жирных кислот С. Элеганс культивировали на этих пластин может быть контролируют с помощью газовой хроматографии.
1. Подготовка жирных кислот дополняется СМИ
- ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Дополнение от С. Элеганс диета ограничена способностью бактериального источника питания для поглощения и включать жирные кислоты в бактериальной мембраны. Для определения способности Е. палочка OP50 ассимилировать различных жирных кислот в мембранах его, OP50 высевали на носитель без добавки, 0,1 мМ и 0,3 мМ концентраци х стеариновой кислоты (18:00), олеат натрия (18:01 Н-9), и натрий DGLA (20 : 3n-6). Планшеты сушили при комнатной температуре в течение 2 дней в темноте, и инкубировали при 20 ° С в теч.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы опишем метод добавок C. Элеганс с диетическими ненасыщенных жирных кислот. Как упоминалось выше, необходимо соблюдать осторожность при подготовке ПНЖК, дополненной пластин, так как реактивный характер двойных связей в ПНЖК вызывает эти жирные кислоты чувствительны к окислению под воздействием тепла и света 11. Чтобы избежать окисления, важно, чтобы добавить ПНЖК в жидкость агаровой среде после того, как средства массовой информации охлаждают до 55 ° С и сохраняет пластин в темной окружающей .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Мы благодарим Крис Вебстер для выполнения предварительных экспериментов показано на рисунке 3 представительных результатов и Джейсон Уоттс и Крис Вебстер за полезные замечания по рукописи. Финансирование данного исследования была предоставлена за счет гранта от Национального института здоровья (США) (R01DK074114) в JLW. Некоторые штаммы нематод, используемые в этой работе были предоставлены Caenorhabditis генетический центр, который финансируется по NIH Управления научно-исследовательских программ в области инфраструктуры (P40 OD010440).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Холестерин | Sigma | C8667-25G | (5 мг/мл в этаноле) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Дигомогамма линолеат натрия | NuCHEK | S-1143 | |
| Теплая стерильная вода | Millipore | ||
| Стерильная вода для сбора глистов | |||
| Нуклеаза безнуклеазная вода для стокового раствора DGLA | Ambion | AM9932 | |
| Ампициллин | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 мг/мл в воде (для пластин РНК) |
| Изопропил-бета-D-тиогалактопиранизид (IPTG) | Золотая биотехнология | 12481C100 | 1 М в воде (для пластин РНК-интерференции) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Метанол | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Гексан | Fisher Scientific | H302-4 | |
| диаминдинофенилиндол (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Стеклянная колба | Corning | 4980-2L | |
| Автоклавируемые стеклянные бутылки с стирбарами | Fisherbrand | FB-800 | |
| Автоклавируемый стеклянный градуированный цилиндр | Fisherbrand | 08-557 | |
| Пластина для перемешивания | VWR | 97042-642 | |
| Водяная баня при 55+ ° C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Завинчивающаяся крышка Коричневый стеклянный флакон | Sun SRI | 200 494 | |
| Аргоновый газовый баллон | |||
| Автоматизированный пипетка | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Стерильные серологические пипетки (25 мл) | Corning | 4489 | |
| Бунзеновская горелка | VWR | 89038-534 | |
| Диссекционный микроскоп | Leica | ||
| Пробирка из силанизированного стекла | Thermo Scientific | STT-13100-S | для деривации FAMEs |
| Винтовые крышки из ПТФЭ | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Клиническая настольная центрифуга | IEC | ||
| GC Обжимной флакон | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Вкладыш для флакона | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Крышка флакона | SUN SRi | 200 100 | |
| Газовый хроматограф | Agilent | 7890A | |
| Масс-спектрометрический детектор | Agilent | 5975C | |
| Колонка для газовой хроматографии | Suppelco | SP 2380 | 30 м x 0,25 мм Капиллярная колонка из плавленого диоксида кремния |
Ссылки
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary satu....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
