Method Article

Высокопроизводительная совместимая платформа на основе FRET для идентификации и характеризации модуляторов легкой цепи ботулинического нейротоксина

DOI:

10.3791/50908

⸱

December 27th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, The Scripps Research Institute, 2Worm Institute of Research and Medicine (WIRM), The Scripps Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Легкая цепь ботулинического нейротоксина типа А (BoNT/A LC) - это металлопротеаза, которая проникает в моторные нейроны, расщепляет его субстрат SNAP-25 и нарушает нейротрансмиссию, тем самым приводя к вялому параличу. Используя высокопроизводительный совместимый анализ на основе FRET, можно провести скрининг больших библиотек малых молекул на предмет их влияния на ферментативную активность BoNT/A LC.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ботулинический нейротоксин (BoNT) - это мощный и потенциально смертельный бактериальный токсин, который связывается с двигательными нейронами хозяина, интернализуется в клетку и расщепляет внутриклеточные белки, необходимые для высвобождения нейротрансмиттеров. BoNT состоит из тяжелой цепи (HC), которая опосредует связывание и интернализацию клеток хозяина, и легкой цепи (LC), которая расщепляет внутриклеточные белки хозяина, необходимые для высвобождения ацетилхолина. В то время как методы лечения, ингибирующие связывание/интернализацию токсина, имеют небольшое временное окно введения, соединения, нацеленные на внутриклеточную активность ЛК, имеют гораздо большее временное окно введения, что особенно актуально, учитывая чрезвычайно длительный период полувыведения токсина. В последние годы малые молекулы активно анализируются в качестве потенциальных ингибиторов LC на основании их повышенной клеточной проницаемости по сравнению с более крупными терапевтическими препаратами (пептидами, аптамерами и т. д.). Идентификация свинцов часто включает в себя высокопроизводительный скрининг (HTS), при котором большие библиотеки малых молекул проверяются на основе их способности модулировать терапевтическую целевую функцию. В данной работе мы описываем анализ на основе FRET с коммерческим субстратом BoNT/A LC и рекомбинантным LC, который может быть автоматизирован для HTS потенциальных ингибиторов BoNT. Кроме того, мы описываем мануальную методику, которая может быть использована для последующего вторичного скрининга или для сравнения эффективности нескольких соединений-кандидатов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ботулинический нейротоксин A (BoNT/A), самый мощный из известных в настоящее время токсинов (LD50 ~1 нг/кг)1, является мощным нейротоксином, который вырабатывается бактерией Clostridium botulinum. В пораженном хозяине BoNT/A нарушает нейротрансмиссию в нервно-мышечном соединении, связывая моторные нейроны, интернализуясь в цитозоль и, в конечном итоге, расщепляя нейрональные белки, которые необходимы для ацетилхолинового экзоцитоза. Оказавшись внутри нейрона, BoNT/A может сохраняться до нескольких месяцев2. Длительное ингибирование высвобождения ацетилхолина препятствует нормальному сокращению мышц и приводит к вялому параличу, который в тяжелых случаях может привести к сердечной и/или дыхательной недостаточности. Из-за его чрезвычайной эффективности, простоты производства и долгосрочных эффектов в организме хозяина, CDC пометил все серотипы BoNT как агенты биотерроризма высокого риска.

Механизм действия токсина включает в себя множество этапов, включая связывание с рецепторами нейронной поверхности, клеточное поглощение через рецептор-опосредованный эндоцитоз и транслокацию в цитозоль нейрона. BoNT/A состоит из двух цепей, тяжелой и легкой, и обе цепи необходимы для токсичности. Тяжелая цепь (HC) содержит домены связывания и транслокации, в то время как легкая цепь (LC) представляет собой цинк-зависимую металлопротеазу, которая перемещается из эндосомы в цитоплазму. Попадая внутрь цитозола, металлопротеаза LC/A локализуется на внутренней цитоплазматической мембране и расщепляет связанный с мембраной белок-хозяин SNAP-25. SNAP-25 является членом семейства белков SNARE (растворимый N-этилмалеимид-чувствительный фактор прикрепления белков рецептора), который играет решающую роль в ацетилхолиновом экзоцитозе (рассмотрено в ссылке3). Расщепление LC/A SNAP-25 нарушает функцию комплекса SNARE, что ингибирует высвобождение нейромедиатора ацетихолина и нарушает сокращение мышц.

В настоящее время лечение ботулизма ограничено и часто включает введение лошадиного нейтрализующего антитела4; однако, поскольку токсин быстро интернализуется нейронами, антитело имеет узкое временное окно введения. Таким образом, многие исследователи считают, что ЖК BoNT/A может быть лучшей терапевтической мишенью. Поскольку LC является цинк-зависимой металлопротеназой, одним из подходов к ингибированию активности LC/A является разработка соединений, которые хелатируют активный центр иона цинка. Например, соединения гидроксамата хелатируют активный центр цинка и обладают отличной активностью in vitro (Ki лучшего на сегодняшний день низкомолекулярного ингибитора BoNT/A LC составляет 77 нМ)5. Тем не менее, многие малые молекулы не продвигаются в качестве терапевтических средств из-за различных проблем ex vivo или in vivo, включая плохую растворимость в воде, быстрый метаболизм и/или высокую цитотоксичность. Поэтому необходимы новые соединения с улучшенными фармакологическими и фармакокинетическими свойствами. Идентификация низкомолекулярных соединений часто включает в себя высокопроизводительный скрининг (HTS) для идентификации новых скаффолдов. Первоначальные методы скрининга активности BoNT/A LC были основаны на выявлении ВЭЖХ короткого расщепления пептидного субстрата, что является трудоемким процессом и не поддается применению HTS6-8. Впоследствии Шмидт и коллеги9 разработали высокопроизводительный анализ активности BoNT/A LC, в котором используется меченый флуоресцеином пептидный субстрат, ковалентно прикрепленный к микротитировочной пластине. BoNT/A LC расщепляет подложку и высвобождает флуоресцеин, который можно количественно определить с помощью флуориметра. Планшетный формат этого анализа позволяет одновременно проводить скрининг нескольких соединений; Тем не менее, анализ требует маркировки синтетических пептидов флуоресцеином и покрытия тестовых пластин дериватизированными молекулами субстрата, что является громоздким методом. Гораздо более простой метод обнаружения активности BoNT/A LC при низких концентрациях был позже описан Schmidt et al., где для мониторинга активности BoNT LC в режимереального времени был использован ряд флюорогенных субстратов. Дополнительные методы, описанные в литературе, включают анализ деполяризации после резонансного переноса энергии для обнаружения и количественного определения активности BoNT в сырых экстрактах; Этот метод может быть использован для высокопроизводительных приложений10,11, хотя для него требуется сложное оборудование для измерения флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) и поляризационных сигналов. Наконец, было сообщено о нескольких клеточных моделях интоксикации BoNT (рассмотренных в ссылке11), которые позволят исследователям изучить часто ограничивающие свойства ранее упомянутых соединений, включая цитотоксичность, проницаемость и стабильность клеток. Тем не менее, большинство существующих клеточных анализов не поддаются HTS, являются трудоемкими и трудоемкими.

Здесь мы подробно описываем протокол для метода HTS, который использует коммерчески доступный субстрат BoNT/A LC на основе FRET. Субстрат основан на последовательности расщепления SNAP-25 и представляет собой синтетический 13-мерный пептид, который содержит концевой флуорофор и гаситель. Расщепление BoNT/A разделяет флуорофор и гаситель, устраняя FRET и увеличивая измеренную флуоресценцию, которую можно непрерывно измерять в считывателе флуориметровых пластин. Анализ регулярно используется в нашей, а также в других лабораториях для идентификации новых классов ингибиторов BoNT/A LC или для определения относительной активности ранее идентифицированных соединений5,12-15. Этот анализ подходит для HTS из-за его простоты, потенциала автоматизации, низкой стоимости материалов и возможности одновременного скрининга нескольких соединений (см. ссылку16; Caglič et al., представлено; Bompiani et al., в стадии подготовки). В дополнение к HTS, этот анализ может быть использован для сравнения относительной активности соединений путем определения значения IC50 (концентрация, необходимая для ингибирования 50% активности BoNT/A LC) соединения. Анализ может быть выполнен вручную в формате 96 лунок (раздел «Ручной скрининг» в тексте протокола) или может быть автоматизирован в формате 384 лунок для HTS (раздел «Автоматизированная операция» в тексте протокола).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ручной скрининг или определение IC50

Этот протокол может быть использован для определения относительной активности соединения (значение IC50) путем подготовки серии разведения соединения, или для ручного скрининга низкомолекулярных ингибиторов в одной концентрации.

1. Приготовление буферов, реагентов и необходимых инструментов

  1. Приготовьте 50 мл пробирного буфера (40 мМ HEPES, pH 7,4 и 0,01% Tween-20) и простерилизуйте фильтром. Буфер может храниться при комнатной температуре (RT) в течение нескольких месяцев.
  2. Приготовьте 70 нМ рабочее разведение рекомбинантного ботулинического нейротоксина/легкой цепи А (LC/A (1-425))17 в буфере для анализа, осторожно зажгите его и храните на льду. Для тестирования каждого соединения требуется не менее 120 мкл рабочего разбавления LC/A.
  3. Приготовьте рабочее разведение субстрата BoNT/A LC на основе 7 мкМ FRET в буфере для анализа, содержащем 10% ДМСО. Первоначально разведите 5 мМ стоковый раствор субстрата в соответствующем объеме 100% ДМСО, затем медленно (по каплям) добавьте буфер для анализа, осторожно перемешивая. Заверните в фольгу и храните на льду. Для испытания каждого соединения требуется не менее 130 мкл разбавления подложки.
  4. Сконфигурируйте считыватель флуоресцентных микротитров для встряхивания пластины со средней скоростью в течение 10 секунд, а затем контролируйте флуоресценцию на длинах волн возбуждения и излучения 490 нм и 523 нм соответственно каждые 5 минут (кинетический режим) в течение 90 минут в RT. Обратите внимание, что образование продукта (т.е. увеличение флуоресценции) является линейным на протяжении всего этого периода времени (рис. 1A).

2. Приготовление серий разбавлений соединений

  1. Определите диапазон концентраций соединений (т.е. количество разведений в ряду разведения и коэффициент разведения); диапазон концентраций выбирается на основе ожидаемого значения IC50 для обеспечения оптимального подгонки кривой. Для соединений с неизвестным IC50 используйте неразбавленный составной материал в качестве самой высокой концентрации соединения.
  2. Наклейте на пробирки соответствующее название соединения и концентрацию.
  3. Добавьте 100% ДМСО во все пробирки, чтобы подготовить их к составному серийному разведению. Рекомендуется минимум 2 мкл конечного объема разбавления, где используется 1 мкл каждой концентрации на лунку в пробирной пластине. Например, стандартная серия разбавления 1:3 требует смешивания 2 л соединения с 4 л ДМСО на пробирку.
  4. Готовьте серийные разведения соединений и вихря или тщательно перемешивайте вручную между каждым разведением; меняйте наконечники пипеток между каждым разведением. Для стандартной серии разведения 1:3 добавьте 2 мкл неразбавленного соединения к 4 мкл ДМСО в первой пробирке серии разведения и хорошо перемешайте. С помощью нового наконечника для дозатора удалите 2 мкл первого разведения и добавьте до 4 мкл ДМСО во второй пробирке; Хорошо перемешайте. Повторите для остальных разведений. Обязательно хорошо перемешайте составные разведения, чтобы убедиться в точности концентрации соединения.
  5. Накройте составные пробирки крышками и отложите в сторону на RT.

3. Подготовка пластин и пятнистость (Таблица 1)

  1. Получите плоскодонный, непрозрачный, черный 96-луночный планшет. Рекомендуемая конфигурация планшетов приведена в таблице 1, где каждая серия разбавления соединений отформатирована в виде рядов 96-луночного планшета. Вручную дозируйте 1 мкл соответствующего растворенного раствора непосредственно на дно каждой соответствующей лунки (лунки 1-9). Дозируйте 1 мкл испытуемого соединения в высшей концентрации в лунку 11 (контроль собственной флуоресценции соединения).
  2. Вручную дозируйте 1 мкл известного мощного ингибитора в лунку 12 (положительный контроль) и 1 мкл 100% ДМСО в лунку 10 (отрицательный контроль).
  3. С помощью автоматизированного пипеттора дозируйте 79 мкл буфера для анализа на сторону лунок 1-10 и 12 (комбинированные разведения и положительный контроль) и 89 мкл на сторону лунки 11 (контроль собственной флуоресценции соединения). Убедитесь, что наконечник не прикасается ко дну колодца, где присутствует соединение, чтобы не загрязнить колодцы перекрестно.
  4. Сделайте вихревой нагрузку рабочего разбавления LC/A и с помощью автоматической дозатора добавьте 10 мкл в боковую часть каждой лунки, за исключением лунки 11 (контроль собственной флуоресценции соединения). Аккуратно постучите по пластине, чтобы убедиться, что весь добавленный фермент ушел на дно лунки.
  5. Аккуратно перемешайте, накройте крышкой и инкубируйте тарелку в течение 5 минут при RT. Эта инкубация обеспечивает стадию предварительного равновесия для связывания соединений с LC/A перед добавлением субстрата.

4. Добавление субстрата и измерение флуоресценции

    Аккуратно нанесите
  1. подложку BoNT/A LC и с помощью автоматической пипетки добавьте 10 мкл субстрата на другую сторону каждой лунки. Обязательно добавляйте субстрат на ту сторону лунки, которая противоположна той, где фермент был добавлен ранее.
  2. Осторожно постучите по пластине, чтобы перемешать реагенты, немедленно поместите в считыватель планшетов и начните измерение флуоресценции с настройками, ранее указанными в шаге 1.4.
  3. Скорости ферментов рассчитываются по наклону линии, образованной путем построения графика зависимости единицы относительной флуоресценции (RFU) от времени в течение линейного периода реакции.

Таблица 1.Предлагаемая схема расположения пробирной пластины.

Ну #Описание скважинысоединениеБуфер для анализасубстратЛКДмсо
1Комбинированная доза 11 μл79 мкл10 мкл10 мкл ---
2Комбинированная доза 21 μл79 мкл10 мкл10 мкл---
3Комбинированная доза 31 μл79 мкл10 мкл10 мкл---
4Комбинированная доза 41 μл79 мкл10 мкл10 мкл---
5Комбинированная доза 51 μл79 мкл10 мкл10 мкл---
6Доза соединения 61 μл79 мкл10 мкл10 мкл---
7Комбинированная доза 71 μл79 мкл10 мкл10 мкл---
8Комбинированная доза 81 μл79 мкл10 мкл10 мкл---
9Комбинированная доза 91 μл79 мкл10 мкл10 мкл---
10Отрицательное управление
(100% активность LC)		---79 мкл10 мкл10 мкл1 μл
11Комбинированный контроль собственной флуоресценции1 μл89 мкл10 мкл------
12Положительное управление
(0% активности ЛК)		1 μл79 мкл10 мкл10 мкл---

Автоматизированная работа для высокопроизводительного грохочения

5. Приготовление буферов, реагентов, составных планшетов, штрих-кодов и необходимых инструментов

  1. Разморозьте герметичные столовые пластины при комнатной температуре не менее 1 часа.
  2. Приготовьте 500 мл (или более, в зависимости от количества просеиваемых соединений) буфера для анализа (40 мМ HEPES, pH 7,4 и 0,01% Tween-20) и простерилизуйте фильтром. Отфильтрованный буфер для анализа может храниться в RT в течение нескольких месяцев.
  3. Приготовьте рабочее разведение рекомбинантного BoNT/A LC (1-425) с концентрацией 8,75 нМ в буфере для анализа, вихре и храните на льду. На каждую лунку в малообъемной 384-луночной пластине требуется 8 мкл. Приготовьте 10-15% избыток, или примерно 3,7 мл или каждый малообъемный 384-луночный планшет.
  4. Приготовьте рабочее разведение субстрата BoNT/A LC на основе 3,5 мкМ FRET в буфере для анализа, содержащем 10% ДМСО. Первоначально разбавьте 5 мМ стоковый раствор субстрата непосредственно в соответствующем объеме 100% ДМСО, затем медленно (по каплям) добавьте буфер для анализа, осторожно перемешивая. Заверните в фольгу и храните на льду. На каждую лунку в малообъемном 384-луночном планшете требуется 2 мкл. Приготовьте излишек на 10-15%, или примерно по 1 мл на каждый малообъемный 384-луночный планшет.
  5. Подготовьте штрихкоды для каждой черной 384-луночной микротитровальной пластины малого объема [пробирная пластина] и приклейте этикетку непосредственно к той стороне пластины, где сканер штрих-кода может ее считывать; убедитесь, что этикетка не выходит за пределы пластины, иначе это может помешать работе с пластинами и их укладке. Сложите тарелки в нумерованном порядке и отложите в сторону. Накройте верхнюю пластину. Обратите внимание, что этот шаг является необязательным, но облегчает отслеживание результатов для соответствующих соединений при использовании нескольких планшетов.
  6. Центрифугируйте размороженные, запечатанные составные пластины при температуре 200 x g в течение 30 секунд при RT. Осторожно снимите пломбу пластины, обязательно удалите остатки клея и накройте пластину чистой пластиковой крышкой, чтобы предотвратить испарение. Обратите внимание, что если на поверхности пластины присутствует клей, он может помешать автоматическому переносу крышки и укладке тарелок. Поместите накрытую тарелку в оболочку, прикрепленную к обработчику жидкости. Не держите пластины открытыми, иначе произойдет испарение.
  7. Сконфигурируйте многослойный считыватель флуоресцентных микротитровальных планшетов для считывания флуоресценции каждого анализного планшета на длинах волн возбуждения и излучения 490 нм и 523 нм, соответственно, каждые 30 мин (кинетический режим) в течение 3–6 циклов в режиме ОТ.

6. Подготовка инструмента для штифтов

  1. Визуально осмотрите инструмент с 384 головками на предмет любых отклонений, включая деформацию, осколки или крупный мусор.
  2. Заполните три отдельных лотка примерно 1 дюймом 100% метанола (класса ВЭЖХ), 100% изопропанола (класса ВЭЖХ) и раствором для очистки штифтового инструмента, разведенным в сверхчистой воде.
  3. Наполните станцию очистки на манипуляторе для жидкостей 100% ДМСО.
  4. Сложите в лоток 2-3 листа чистой новой промокательной бумаги. Важно откалибровать робота по оси z таким образом, чтобы контакты соприкасались с промокательной бумагой, но не прокалывали ее.
  5. Закрепите крепление вентилятора к рабочей зоне для сушки штифтов после мытья.
  6. Прикрепите инструмент для штифтов к роботизированной руке манипулятора для обработки жидкости и предварительно очистите штифты, окунув их в ДМСО, высушив на промокательной бумаге, замочив в 2 минуты в чистящем растворе, высушив на промокательной бумаге, окунув в изопропанол, высушив на промокательной бумаге, окунув в метанол, высушив на промокательной бумаге и, наконец, высушив на вентиляторе.

7. Приготовление диспенсера для жидкостей малого объема

  1. Подсоедините к дозатору жидкости кассету малого объема (1-10 мкл) и подсоедините сливной трубопровод к соответствующему сосуду.
  2. Визуально осмотрите дозирующие форсунки кассеты и убедитесь, что они не деформированы, не порваны и не заблокированы. Важно содержать каналы и форсунки в чистоте, так как осадки или мусор влияют на распределение жидкости.
  3. Заправьте каналы, пропустив 30 мл сверхчистой воды, 30 мл 70% этанола, затем 30 мл сверхчистой воды снова непосредственно в резервуар для отходов.
  4. Поместите пластину для анализа на 384 лунки малого объема в дозатор жидкости и добавьте известный объем воды в каждую лунку. Осмотрите визуально, чтобы убедиться, что каждая скважина получает правильный объем и что между скважинами нет разливов или раствора.
  5. Загрунтуйте трубки воздухом примерно на 5 секунд, чтобы удалить воду и просушить каналы.

8. Нанесение легкой цепи BoNT/A в пробирную пластину

  1. Погрузите линию забора жидкости в рабочий раствор BoNT/A LC, заправьте воздух для удаления воздуха и подайте по 8 мкл в каждую лунку малообъемной 384-луночной пробирной пластины. Обратите внимание, что пластины могут быть вручную размещены в рабочей зоне манипулятора для работы с жидкостями или автоматически позиционироваться и укладываться с помощью прикрепленной пластины.
  2. Накройте каждую тарелку чистой пластиковой крышкой и сложите в другую колонну тарелку отеля, прикрепленную к манипулятору для жидкости. Не держите пластины открытыми, иначе произойдет испарение.
  3. Очистите дозатор жидкости, снова запустив 30 мл сверхчистой воды, 30 мл 70% этанола и 30 мл сверхчистой воды непосредственно в емкость для отходов.
  4. Загрунтуйте трубки воздухом примерно на 5 секунд, чтобы просушить каналы.

9. Штамповка составов в пробирную пластину

  1. Назначьте участки на платформе для обработки жидкостей для составных планшетов, пробирных пластин и контейнеров с моющими растворами.
  2. Запрограммируйте манипулятор на размещение составных пластин и пробирных пластин в обозначенных местах и снятие крышек пластин перед штамповкой.
  3. Внесите 50 нл соединения непосредственно в пробирную пластину, содержащую 8 мкл BoNT/A LC. При калибровке программы штамповки убедитесь, что штифты погружены в воду, но не поцарапайте дно пробной пластины. Следует отметить, что добавление соединений в 100% ДМСО может создать локальную зону денатурации фермента по мере его диспергирования. В связи с этим следует проявлять осторожность при оценке уровня денатурации фермента путем сравнения только ДМСО в контрольной группе без лечения (т.е. фермента без добавления ДМСО).
  4. Очистите булавки после каждой пластины, окунув в ДМСО, высушив на промокательной бумаге, окунув в изопропанол, высушив на промокательной бумаге, окунув в метанол, высушив на промокательной бумаге и, наконец, высушив на вентиляторе.
  5. После того, как соединения были проштампованы в пробирной пластине с ферментом, отдельно уложите стоковые составные пластины и пробирные пластины. Накройте верхнюю пробирную пластину в стопке, чтобы предотвратить испарение, и отложите в сторону. Обязательно инкубируйте ЛК с соединениями не менее 5 мин при РТ; Более длительное время инкубации может быть использовано при штамповке большого количества пластин.

10. Нанесение субстрата в пробирную пластину

  1. Погрузите всасывающую линию манипулятора жидкости в рабочий раствор для подложки BoNT/A LC и защитите от света. Проверьте дозирующие форсунки, чтобы убедиться, что они сухие и не заблокированы. Загрунтуйте каналы, чтобы удалить все пузырьки воздуха.
  2. Разложите пробирные пластины и выдайте 2 мкл рабочего разбавления субстрата в каждую лунку. Убедитесь, что субстрат подается непосредственно в каждую лунку. Сложите пластины и положите одну пустую пластину для анализа поверх первой пластины и одну пустую пластину под нижнюю пластину в стопке, чтобы предотвратить испарение во время чтения и повторного складывания в считывателе пластин.

11. Измерения флуоресценции

  1. Немедленно загрузите стопку пробирных пластин в считыватель флуоресцентных пластин.
  2. Начните измерение флуоресценции с настройками, ранее указанными в шаге 5.7. Скорость анализа для каждого соединения рассчитывается на основе графика единицы относительной флуоресценции (RFU) с течением времени. Обратите внимание, что важно включить отрицательный контроль (ДМСО) для получения растормаживаемой скорости; Положительный контроль с известным ингибитором также может быть добавлен к каждой пластине. Репрезентативный вывод из одной точки времени показан на рисунке 2.

12. Очистка

  1. Запечатайте каждую пластину составного материала уплотнением из фольги с помощью ролика и храните при температуре -80 °C.
  2. После прочтения каждой пробирной пластины утилизируйте пластины, любые оставшиеся разведения LC/A или субстрата в биологически опасных отходах.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ BoNT/A LC на основе FRET может быть выполнен вручную с низкой пропускной способностью для характеристики известных ингибиторов или скрининга небольших библиотек; в качестве альтернативы, протокол может быть уменьшен и автоматизирован для высокопроизводительного скрининга (HTS) с большими библиотеками с целью идентификации новых ингибиторов BoNT/A LC. Независимо от выбранного подхода, увеличение флуоресценции должно наблюдаться с течением времени при инкубации BoNT/A LC с субстратом (на рисунке 1A ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь анализ BoNT/A LC на основе FRET представляет собой привлекательный метод идентификации и характеристики малых молекул, которые модулируют активность BoNT/A LC. Благодаря тому, что анализ основан на растворе, этот протокол поддается высокопроизводительному скринингу, описанному в разделе «Автоматизированная эксплуатация» Текста протокола. Z-фактор часто используется для определения пригодности анализа для кампаний HTS. Определяемый как Z = 1 – 3 (σp + σn)/(μp - μ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом от Национального института здравоохранения (AI082190 до T.J.D.) и Калифорнийского института регенеративной медицины (TB1-01186 и CL1-00502).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HEPESTeknovaH1021
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
Метанол (класс ВЭЖХ)Sigma-Aldrich34860
Изопропанол (класс ВЭЖХ)Sigma-Aldrich650447
96-луночная черная пробирная пластинаCostar3915
384-луночная Малообъемная черная пробирная пластинаGreiner788076
SNAPtide FITC/DabcylSubstrate List Biological Laboratories521FRET-based BoNT/A LC
раствор для очистки штифтовсубстрата V& P ScientificVP 110
Безворсовая промокательная бумагаV& P ScientificVP 540DB
Biomek Seal and Sample Крышки из алюминиевой фольгиBeckman Coulter538619

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schantz, E. J., Johnson, E. A. Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine. Microbiol. Rev. 56, 80-99 (1992).
  2. Sloop, R. R., Cole, B. A., Escutin, R. O. Human response to botulinum toxin injection: type B compared with type A. Neurology. 49, 189-194 (1997).
  3. Willis, B., Eubanks, L. M., Dickerson, T. J., Janda, K. D. The strange case of the botulinum neurotoxin: using chemistry and biology to modulate the most deadly poison. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47, 8360-8379 (2008).
  4. Tacket, C. O., Shandera, W. X., Mann, J. M., Hargrett, N. T., Blake, P. A. Equine antitoxin use and other factors that predict outcome in type A foodborne botulism. Am. J. Med. 76, 794-798 (1984).
  5. Capek, P., et al. Enhancing the Pharmacokinetic Properties of Botulinum Neurotoxin Serotype A Protease Inhibitors Through Rational Design. ACS Chem. Neurosci. 2, 288-293 (2011).
  6. Schmidt, J. J., Bostian, K. A. Proteolysis of synthetic peptides by type A botulinum neurotoxin. J. Protein Chem. 14, 703-708 (1995).
  7. Schmidt, J. J., Bostian, K. A. Endoproteinase activity of type A botulinum neurotoxin: substrate requirements and activation by serum albumin. J. Protein Chem. 16, 19-26 (1997).
  8. Schmidt, J. J., Stafford, R. G., Bostian, K. A. Type A botulinum neurotoxin proteolytic activity: development of competitive inhibitors and implications for substrate specificity at the S1' binding subsite. FEBS Lett. 435, 61-64 (1998).
  9. Schmidt, J. J., Stafford, R. G., Millard, C. B. High-throughput assays for botulinum neurotoxin proteolytic activity: serotypes A, B, D, and F. Anal. Biochem.. 296, 130-137 (2001).
  10. Schmidt, J. J., Stafford, R. G. Fluorigenic substrates for the protease activities of botulinum neurotoxins serotypes A, B, and F. Appl. Environ. Microbiol. 69, 297-303 (2003).
  11. Pellett, S. Progress in cell based assays for botulinum neurotoxin detection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 257-285 (2013).
  12. Boldt, G. E., et al. Synthesis, characterization and development of a high-throughput methodology for the discovery of botulinum neurotoxin a inhibitors. J. Comb. Chem. 8, 513-521 (2006).
  13. Henkel, J. S., et al. Catalytic properties of botulinum neurotoxin subtypes A3 and A4. Biochemistry. 48, 2522-2528 (2009).
  14. Joshi, S. G. Detection of biologically active botulinum neurotoxin--A in serum using high-throughput FRET-assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 65, 8-12 (2012).
  15. Smith, G. R., et al. Reexamining hydroxamate inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A: extending towards the beta-exosite. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 3754-3757 (2012).
  16. Eubanks, L. M., et al. An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2602-2607 (2007).
  17. Baldwin, M. R., Bradshaw, M., Johnson, E. A., Barbieri, J. T. The C-terminus of botulinum neurotoxin type A light chain contributes to solubility, catalysis, and stability. Protein Expr. Purif. 37, 187-195 (2004).
  18. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  19. Capkova, K., Hixon, M. S., McAllister, L. A., Janda, K. D. Toward the discovery of potent inhibitors of botulinum neurotoxin A: development of a robust LC MS based assay operational from low to subnanomolar enzyme concentrations. Chem. Commun. , 3525-3527 (2008).
  20. Pires-Alves, M., Ho, M., Aberle, K. K., Janda, K. D., Wilson, B. A. Tandem fluorescent proteins as enhanced FRET-based substrates for botulinum neurotoxin activity. Toxicon. 53, 392-399 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Botulinum Neurotoxin Light ChainFRET based AssayHigh throughput ScreeningCompound Dilution SeriesFluorescence Plate ReaderEnzyme Inhibition KineticsIC50 DeterminationAutomated Liquid HandlingSubstrate Hydrolysis MeasurementInhibitor Potency Comparison

Related Articles