Методическая статья

Наблюдение и количественная оценка Фибробластовой Фибрин Гель Компактион

5.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50918

⸱

16 января 2014 г.

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Iowa

В этой статье

Краткое содержание

Для наблюдения и анализа фибробластного уплотнения геля и перестройки фибринового волокна в экологически контролируемом биореакторе в течение 48 часов использовались методы обработки во времени и обработки изображений.

Аннотация

Клетки, встроенные в коллагеновые и фибринные гели, прикрепляют и оказывают тяговые силы на волокна геля. Эти силы могут привести к локальной и глобальной реорганизации и перестройке микроструктуры геля. Этот процесс проходит сложным образом, что частично зависит от взаимодействия между расположением клеток, геометрией геля и механическими ограничениями на гель. Чтобы лучше понять, как эти переменные производят глобальные модели выравнивания волокон, мы используем микроскопию дифференциального интерференции (DIC) замедленного действия (DIC) в сочетании с экологически контролируемым биореактором для наблюдения за процессом уплотнения между геометрически распропоискными эксплантами (кластерами фибробластов). Изображения затем анализируются с помощью пользовательского алгоритма обработки изображений для получения карт штамма. Информация, полученная из этого метода может быть использована для зондирования механобиологии различных клеточно-матричных взаимодействий, которая имеет важные последствия для понимания процессов в заживлении ран, развитии болезней и тканевой инженерии приложений.

Введение

Важным инструментом для изучения клеточно-матричных взаимодействий является клеток, населенных коллагеновымгелем 1,2. Гель обеспечивает 3D среду, которая ближе к in vivo характер ткани и лучше подходит для понимания поведения клеток, чем предлагается традиционными 2D культур3. Ранние исследования, в которых фибробласты были однородно распределены в коллагеновый гель обнаружили, что клетки быстро консолидировать коллагеновые волокна и компактныйгель 4,5. Контрактные фибробласты в свободных плавающих гелях затем переходят в состояние добела вскоре после того, как гель полностью достигуплотнения 1,6,7. Фибробласты в гелях, которые ограничены на границах, остаются в активном,синтетическом состоянии 8 и генерируют выравнивание волокон таким образом, в зависимости от геометриигеля и внешних ограничений 5,9. Различия в активности клеток, как представляется, в результате внутреннего напряжения (или его отсутствие), которое развивается, как клетки оказывают силы тяги через интегрны на коллагеновых волокон в гель.

Вариант этого метода включает в себя размещение фибробластов explants(т.е. скопления клеток) на расстоянии друг от друга в коллагеновом геле и наблюдения клеточной матрицы взаимодействия и постепенное развитие волокна выравнивание между explants (иногда называемые связки, как ремни)10-12. Основным преимуществом системы эксплантов является то, что она позволяет упорядочить клетки в простые геометрические узоры, что облегчает визуализацию и зондирование механизмов, лежащих в основе перестройки волокон, управляемых клетками. Эти модели выравнивания - которые зависят главным образом от взаимодействия между силами тяги клетки, spatial распределением клетки, геометрией геля, и механически ограничениями на геле - важны для того чтобы понять потому что они играют центральную роль в глобальной организации ткани, механически функции, и местноймеханической окружающей среде 13.

В области тканевой инженерии, одна стратегия для производства механически функциональных, инженерии тканей включает в себя контроль волокна выравнивание шаблон, который развивается из уплотнения клеток, так что инженерии ткани обладает волокна выравнивание, которое имитирует, что изродной ткани 14,15. Такое выравнивание считается необходимым для инженерных тканей, чтобы повторить сложное механическое поведение местных тканей. Модификация этой стратегии заключается в замене коллагенового геля фибрином гель16. Фибрин гель развивается аналогичная модель выравнивания, как коллагеновый гель во время уплотнения. Со временем фибрин деградирует и заменяется синтезированными клетками ECM, что следует первоначальному шаблону выравнивания фибринового волокна. Полученная конструкция значительно улучшила механические свойства по сравнению с коллагеновым гелем, полученным конструкцией17.

Процесс выравнивания и последующей реконструкции событий в фибриновых гелях проходить в сложной и плохо понятой манере. Чтобы лучше охарактеризовать эти взаимодействия и их влияние на поведение клеток и ЭКМ ремоделирование, мы разработали процедуру, которая основана на методе экспланта. В этом методе фибробласты explants расположены на фибриновом геле в различных геометрических узоров. Гели поддерживаются в экологически контролируемом, микроскоп-установленбиореакторе 18, и процесс уплотнения и перестройки волокна контролируется с помощью контрастной по времени дифференциальной интерференционной микроскопии (DIC). Поля перемещения количественно определены с помощью пользовательских алгоритмов. Данные, полученные в ходе этих экспериментов, имеют широкий спектр последствий для ряда процессов, включая оптимизацию стратегий проектирования тканей, улучшение заживления ран и лечение ремоделирования патологических тканей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка к трафарету

Подготовь трафарет на Парафильме, чтобы сабографить расположение каждого экспланта, следуя желаемойгеометрии (рисунки 1A и 1B). Пространство каждого explant примерно 1-2 мм друг от друга. Это расстояние соответствует идеальному интервалу для генерации выравнивания волокон между эксплантами. Прикрепите трафарет под областью крышки, где образец будет подготовлен лентой.

2. Стерилизация

Тщательно очистить все компоненты биореактора с использованием 70% этанола и стерилизовать в течение 2-3 часов под ультрафиолетовым светом до экспериментов. Если альтернативный сосуд используется вместо биореактора, то следует использовать надлежащие методы стерилизации. Смотрите шаг 4.12 для комментариев по использованию стеклянного дна чашки Петри.

3. Фибрин Гель Подготовка

После того, как компоненты биореактора были стерилизованы, бросить тонкий слой фибринового геля на поверхности стекловолокна. Подробная информация для подготовки фибриногена и тромбина фондовых решений для изготовления 6,6 мг / мл фибрина гели описаны в Сандер и др. 13 Аналогичный протокол Ye et al. 19 для изготовления 3,3 мг/мл фибриновых гелей также можно посмотреть на веб-сайте JoVE.

  1. Приготовьте раствор флуоресцентных микробусов в DMEM с концентрацией 10 миллионов бусин/мл. Бусы будут использоваться для отслеживания смещения геля. Для достижения этой концентрации смешайте 0,017 мл раствора бульона из микроблады и 0,149 мл DMEM в микроцентрифугную трубку.
  2. Sonicate этой подвески в течение 10 минут, чтобы разогнать бисер и гомогенизировать раствор.
  3. Фибриновое решение - В 15 мл c-трубки, смешать 0,22 мл фибриногенного раствора бульона с 0,44 мл 20 мМ HEPES буфера. Добавьте 0,1667 мл DMEM с микробусами, созданными в шаге 3.1.
  4. Тромбин решение - В отдельной 15 мл c-трубки, смешать 0,0328 мл раствора тромбина бульон, 0,131 мл 20 мМ HEPES буфера, и 0,00246 мл 2 M CaCl2.
  5. Тщательно смешайте раствор тромбина (шаг 3.4) с раствором фибриногена (шаг 3.3) путем трубопроводов вверх и вниз 5-10x до тех пор, пока решение равномерно распределено. Избегайте введения пузырьков как можно больше. Чтобы уменьшить количество пузырьков производства, будьте осторожны, чтобы не полностью разрядить пипетку при смешивании.
  6. Добавление тромбина приведет к быстрому раствору геля (30 сек). Pipette смешанный раствор на крышку как можно скорее. Разрешить гель для полимеризации на RT.
  7. Запечатай биореактор, вставьте нагревательные блоки и соедините термокопплятор с температурным контроллером. Инкубировать гель при 37 градусов по Цельсию в течение 15-30 мин.

4. Подготовка клеточного растения

  1. Удалите среду из колбы Т-75, содержащей клетки человеческого дермального фибробласта.
  2. Тщательно промойте поверхность примерно 5 мл фосфатного буферного солевого раствора (PBS) для удаления белков сыворотки. Добавьте 1 мл трипсина-ЭДТА и инкубировать в течение 3 минут, или до тех пор, пока клетки не будут сняты.
  3. После того, как клетки были сняты, спина подвески вниз в центрифуге на 200 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно посовелите гранулы в объеме DMEM, что позволит окончательную концентрацию 20 миллионов клеток/мл.
  4. В то время как клетки вращаются вниз в центрифуге отключить биореактор от нагревательных блоков и термокоуплей. Перенесите биореактор в шкаф биобезопасности и аккуратно снимите крышку, следуя ацептическим методам.
  5. Создавайте экспланты, протяженные 0,3 мкл клеточной подвески на полимеризованный фибриновый гель, следуя шаблону на трафарете. Каждое экспланты должны содержать около 6000 клеток. Убедитесь, что используются советы по микропипейту низкого объема (0,1-10 мкл).
  6. Разрешить ячейки, чтобы поселиться и прикрепить к матрице фибрина в течение 1 часа при 37 градусов по Цельсию.
  7. С биореактором все еще открытым, добавьте приблизительно 5 мл DMEM дополнено с 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота (FBS), 1% пенициллин-стрептомицин, 0.1% амфотерицин B, и 10 мг/мл апротинина непосредственно в камеру биореактора. DMEM является бикарбонат буферизированным и требует 5% CO2 для поддержания нейтрального рН. Так как биореактор не поставляется с CO2, состояние среды в инкубаторе с 5% CO2 в течение 2-3 часов перед использованием. Апротинин является ингибитором серин протеазы, который широко используется для снижения скорости деградации фибрина20.
  8. Запечатать биореактор. Используйте шприц, чтобы доставить дополнительные 5 мл CO2 кондиционированной среды через колючую установку на входе порт. Медленно высовывьте среду и убедитесь, что весь объем биореакторной камеры заполнен. Аккуратно удалите пузырьки, которые образуются в биореакторе.
  9. Поставка свежих, 5% CO2 кондиционированных средних биореактор на протяжении всего эксперимента для того, чтобы сохранить рН, поставлять питательные вещества, и удалить отходы. Настройка шприц насоса с 10 мл или 30 мл шприца заполнены 5% CO2 кондиционированной среды. Подключите шприц непосредственно к входному порту на крышке биореактора с помощью стерильных труб Luer-lock. Удалите мужскую установку и прикрепите трубку к колючей установке на биореакторе (см. рисунок 1C).
  10. Установите скорость перфузии до 0,01 мл/мин. Подключите модифицированные кусочки труб к обоим портам розетки и поместите концы в стакан 100 мл для сбора отходов.
  11. Используйте лабораторный домкрат для настройки высот входных и розетки, чтобы дифференциал давления не развивался в биореакторе (обратитесь к рисунку 1D для справки).
  12. Если биореактор недоступен, приготовьте образцы в 35-мм стеклянных нижних чашках Петри со стеклянными вершинами. Используйте один с размером крышки, который оптимизирован для конкретного набора целей, которые будут использоваться. Образцы, которые готовятся в чашках Петри, следует поддерживать в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
    Примечание: Полистирол деполяризирует свет и будет мешать изображениям DIC, поэтому стеклянные вершины должны быть использованы, если DIC изображения будут проводиться. Фазовая контрастность является подходящим альтернативным методом визуализации. Передача посуды между инкубатором и микроскопом затрудняет регистрацию изображений. Если изображения не зарегистрированы должным образом, то штамм, рассчитанный в разделе 6, не будет точным.

5. Промежуток времени изображения

  1. После того, как образец был подготовлен, запечатать биореактор, восстановить нагревательные блоки и термокоупли, и установить температуру биореактора до 37 градусов по Цельсию.
  2. Установите биореактор на микроскоп установленной моторизованной сцене. Распоить цель 20X DIC под вид-портом. Более низкая цель увеличения приемлема, особенно если нет точной моторизованной ступени. Убедитесь, что поляризатор, анализатор и призма все на месте. Кроме того, образцы также могут быть изображены с помощью фазового контраста.
  3. Откройте программное обеспечение для визуализации.
  4. Сосредоточьте цель на области между тремя эксплантами.
  5. Сохраните координаты (x, y и z) этого местоположения в программном обеспечении для визуализации.
  6. Для того, чтобы изображение всей области между и вокруг explants выбрать возможность приобрести большое изображение и указать размер области. Это позволит получить несколько изображений вокруг указанной области и создать кафельное изображение, которое представляет большую область выборки.
  7. Установите время экспозиции и интенсивность света до самых низких значений, чтобы избежать смерти клеток, вызванной фототоксичности, обеспечивая при этом достаточное разрешение для различеть клетки, микробусы и фибриновые волокна.

6. Отслеживание деформации

Для получения подробной информации и инструкций по отслеживанию штаммапрограммного обеспечения ( Рисунок 2) используется см. Raghupathy и др. 21 Алгоритм — это пользовательский код MATLAB, который можно загрузить с http://www.license.umn.edu/default.aspx. Обратите внимание, что изображения DIC часто имеют достаточно текстуры для отслеживания напряжения. Микробусы включены в качестве проверки на расчетных полях деформации. Если отслеживание напряжения будет сделано, крайне важно, чтобы полученные изображения были сделаны в том же месте, чтобы изображения были зарегистрированы. Незарегистрированные изображения будут производить ложные штаммы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ткань ремоделирования является сложным процессом, который обусловлен частично взаимных физических взаимодействий между клетками и окружающей матрицы. Клетки реорганизуют окружающие волокна и создают напряжение в волоконной сети. Выравнивание волокон и механической среды, в свою очередь, контролирует поведение клеток, так что клетки и матрицы глобально реорганизуются для производства реконструированной ткани. В этом эксперименте клетки эксплантов, первоначально круглые в морфологии, начали распространяться в гель и придер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол был разработан с целью наблюдения и количественной оценки механики, участвуют в клеточной ремоделирования ECM. Такие процессы лежат в основе ряда биологических явлений и имеют важныепоследствия для инженерных тканей 2,22,уменьшая шрам 1,23, и понимание патологическихтканей ремоделирования 12,24. Использование замедленной микроскопии DIC позволяет решить и количественно смещения и выравнивания фибринов волокон, что происходит в результате силы тяги клеток. Наблюдаемая здесь р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не заявлен.

Благодарности

Мы благодарим Джорджа Джудиче и Стивена Элиасона за пожертвование человеческих кожных фибробластов и Рамеша Рагупатии за помощь в алгоритме отслеживания штаммов. Поддержку этой работе оказал Департамент образования США по оказанию помощи выпускникам в областях национальной стипендии (GAANN P200A120071).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Sigma-AldrichF8630
Sigma-AldrichT4648
Gibco11965-092
Gibco15140-122
Sigma-AldrichA2942
Sigma-AldrichH0887
Sigma-Aldrich223506
Gibco25200-056
Invitrogen3000
LonzaDE14-701F
Молекулярные зондыF8858
GIBCOA10483-01
GIBCO11430-030
Fisher-ScientificSS264-1
Sigma-AldrichA3428-25MG
Биореактор BiotenseADMET
Ti-Eclipe МикроскопNikon
# 0 35 мм Чашка Петри со стеклянным дномMatTekP35G-0-20-C
# 0 35 мм Чашка Петри со стеклянной столешницейMatTekP35GTOP-0-20-C
Пластиковые фитинги Люэра, трубки из ПВХ с концами ЛюэраCole-Parmer30600-65

Ссылки

  1. Grinnell, F., Petroll WM, Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).
  2. Sander, E. A., Barocas, V. H. Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics. , Springer. New York. (2008).
  3. Pedersen JA,, Swartz MA, Mechanobiology in the third dimension. Ann. Biomed. Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
  4. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).
  5. Guidry, C., Grinnell, F. Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts. J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).
  6. Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels. J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).
  7. Rosenfeldt, H., Grinnell, F. Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices. J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).
  8. Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity. J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).
  9. Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis. Nature. 290, 249-251 (1981).
  10. Stopak, D., Harris AK, Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
  11. Sawhney, R. K., Howard, J. Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels. J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).
  12. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).
  13. Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).
  14. Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).
  15. Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. Tissue-engineered valves with commissural alignment. Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).
  16. Robinson PS,, Robinson PS, Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets. Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).
  17. Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent. J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).
  18. Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).
  19. Ye KY,, Sulli van KE,, Black LD, Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering. J. Vis. Exp. (55), (2011).
  20. Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).
  21. Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs. J. Biomech. Eng. 133, (2011).
  22. Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).
  23. Gabbiani, G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases. J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).
  24. PaszeK, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  25. Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions. Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).
  26. Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
  27. Wakatsuki, T., Kolodney MS,, Zahalak GI,, Elson EL, Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).
  28. De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels. ASME Summer Bioengineering Conference, 2013 Jun 26-29, Sunriver, OR, , (2013).
  29. Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels. J. Biomech. Eng. 135, (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи