Количественная оценка миграции нейтрофилов человека во культурный мочевого эпителия

Краткое содержание

Мы разработали модель в пробирке, который имитирует важный компонент острой воспалительной реакции во время инфекции мочевого пузыря с уропатогенных кишечной палочки. Transuroepithelial миграции нейтрофилов анализ позволяет количественно оценить человеческие миграции нейтрофилов через эпителий мочевого пузыря, культивировали на проницаемыми опор, в ответ на бактериальной инфекции или хемоаттрактант веществ.

Аннотация

Вербовка иммунных клеток от периферии к месту воспаления является важным шагом в врожденного иммунного ответа на любой поверхности слизистой оболочки. Во время инфекции мочевого пузыря, полиморфноядерных лейкоцитов (ПМН; нейтрофилы) мигрируют из крови и пройдите через эпителий мочевого пузыря. Неспособность решить инфекции в отсутствие нейтрофильного ответ демонстрирует важность ПМН в защиту мочевого пузыря. Для облегчения колонизацию эпителия пузыря, уропатогенных кишечной палочки (УПЭК), возбудителем большинства инфекций мочевыводящих путей (ИМП), смочить острую воспалительную реакцию, используя различные частично определенных механизмов. Для дальнейшего исследования взаимосвязи между хостом и бактериальным патогеном, мы разработали модель в пробирке этого аспекта врожденного иммунного ответа к УПЭК. В transuroepithelial нейтрофилов анализа миграции, вариация на камеры Бойдена, культивируют epith мочевого пузыряelial клетки выращивают до слияния на нижней стороне проницаемой поддержки. PMN изолированы от венозной крови человека и применяются к базолатеральной стороне слоев эпителиальных клеток мочевого пузыря. PMN миграция, представляющая соответствующие физиологически базолатеральной к апикальной-направление в ответ на бактериальной инфекции или хемоаттрактант молекул перечисленных помощью гемоцитометра. Эта модель может быть использована для исследования взаимодействия между УПЭК и эукариотических клеток, а также допросить молекулярные требования к обхода эпителия мочевого пузыря по ПМН. Transuroepithelial миграции нейтрофилов модель будет углубить наше понимание начальной воспалительной реакции на УПЭК в мочевом пузыре.

Введение

Движение клеток по всему организму, часто на большие расстояния, требуется для роста и развития, заживления ран и иммунного ответа. Миграция клеток является сложным и требует координации различных процессов, в том числе сигнальных каскадов и перестройка компонентов цитоскелета. Клетки могут двигаться случайным образом (хемокинез), а также к определенных химических градиентов (хемотаксиса). Многие методы были разработаны для изучения миграции клеток в пробирке. Самый старый и наиболее распространенный метод, камера Бойден, состоит из вертикального двухпалатной системы, где хемоаттрактант вещество помещается в нижнюю камеру и клеток, представляющих интерес размещены в верхней камере ^1. Движение клеток через проницаемый фильтр с порами определенного размера, отделяя две камеры контролируется. Дополнительные методы были разработаны, чтобы исследовать миграцию клеток, в том числе камеры Zigmond ² и камерой Dunn^3. Эти коллективные подходы дали значительно углубить понимание движения различных типов клеток.

В дополнение к опрашивая основные принципы хемокинез и хемотаксис, двухкамерные анализы способствовали исследование миграции клеток через компонентами внеклеточного матрикса, и оба эндотелиальных и эпителиальных слоев клеток. Преимущество двухкамерных систем по сравнению с другими методами является то, что пористая мембрана может быть покрыта белков, таких как коллаген или фибриногена и миграции клеток через внеклеточного матрикса, как барьер может быть оценена. Кроме того, культивируемые клеточные линии могут быть выращены и дифференцированы на проницаемых опор. Чтобы исследовать движение клеток через барьер эндотелиальных, культивируемые эндотелиальные клетки высевают и выращивают в верхний резервуар проницаемых опор. Подвижные клетки, такие как клетки иммунной системы, будут добавлены в верхний резервуар и миграции в нижний резервуар через анэндотелиальных барьер в физиологическом направлении верхушечный-на-базолатеральная наблюдается. Эта модель была неоценима в понимании экстравазацию иммунных клеток из крови. В отличие от трансэндотелиальной миграцию, движение клеток через эпителиальный барьер обычно происходит в базолатеральной к апикальной-направлении. Для моделирования этих событий в пробирке, исследователи семян и растут культивируемых эпителиальных клеток на нижней проницаемых опор. Подвижных клеток добавляют в верхний резервуар и миграции через эпителиальный барьер, представляющий базолатеральной к апикальной направлении, находится под контролем. Такие модели трансэпителиальной миграции внесли значительный вклад в наше понимание воспалительных реакций в слизистых поверхностях, особенно легких и кишки ^4,5.

В противоположность этому, оборот иммунных клеток через эпителий мочевых путей получила гораздо меньше внимания. Чтобы углубить наше understandiнг врожденных иммунных реакций в мочевых путях во время инфекции с уропатогенных кишечной палочки (УПЭК), мы разработали анализ в пробирке, transuroepithelial миграции нейтрофилов анализ, который позволяет исследовать полиморфноядерных лейкоцитов (ПМН; нейтрофилов) движение через эпителия мочевого пузыря барьер ^{6 -8.} Как и с другими двухкамерных моделей трансэпителиальной миграции, культивированные эпителиальных клеток мочевого пузыря человека выращивают на нижней стороне проницаемой поддержки и образуют сливные эпителиальных слоев. Нейтрофилы человека, выделенные из венозной крови, применяются к базолатеральной стороне эпителиального пласта и миграции через эпителий в физиологически соответствующего базолатеральной к апикальной-направлении количественно в ответ на инфицирование различных штаммов Е. палочки или присутствие хемоаттрактант молекул. Многие исследования были сосредоточены на движения нейтрофилов, как хемокинез и хемотаксис, в отсутствие дополнительных типов клеток. Transuroepithelial миграции нейтрофилов анализ является предпочтительным, поскольку он учитывает сложные взаимодействия между эпителиальных клеток мочевого пузыря и иммунных клеток во время инфекции. Это послушный модель в пробирке имеет потенциал, чтобы разрешить детальное исследование иммунного ответа на uroepithelial поверхностей.

Протокол

1. Культивирование 5637 эпителиальных клеток мочевого пузыря

Выполните следующие шаги в ламинарного потока ткани капот культуры, приготовленной с УФ-облучения и протереть 70% этанола.

1. Подготовка RPMI-1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) [называют RPMI +], фильтр стерилизуют, используя 0,22 мкм размер пор фильтра с, и тепло до 37 ° C в водяной бане.
2. Оттепель криопробирку из 5637 клеток (American Type Culture Collection НТВ-9; происходит от рака мочевого пузыря) в водяной бане при 37 °. Быстро передавать размороженные клетки в тканевой культуральной колбы 75 см ^2, содержащей 20 мл RPMI +.
3. Инкубируйте колбы при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ пока клетки, примерно 95% сливной (~ 6 × 10 ⁶ клеток на колбу), 4 дней.
4. Для субкультуры 5637 клеток:
   1. Извлеките носитель из колбы. Вымойте клетки с 10 мл Дульбекко фосфатным буфером Салине (DPBS) при комнатной температуре.
   2. Добавить 6 мл теплой (37 ° С) 0,05% трипсина, 0,02% ЭДТА в колбу, и инкубируют при 37 ° С с 5% CO ₂ в течение 15 мин.
   3. Передача клеток в 15 мл коническую пробирку, и гранулу центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин. Снимите трипсин / ЭДТА решение.
   4. Ресуспендируют клеток в 6 мл RPMI + (10 ⁶ клеток / мл) и передачи 1 мл (10 ⁶ клеток) к новому 75 см ² колбу, содержащую 20 мл RPMI +.
5. Повторите шаг 1,4 к субкультура клетки каждые 4 дня или когда клетки достигают 95% слияния.

2. Сеялки и растущий 5637 Ячейки проницаемых Поддерживает

Выполните следующие шаги в капот культуры ткани с помощью асептической техники. Для получения оптимальных результатов используйте 5637 клеток, которые подверглись менее 10 субкультур.

1. Использование стерильного пинцета, инвертировать проницаемые опоры в стерильной 25 мм культуры глубоких тканей блюдо.
Trypsinize 75 см ² колбу 5637 клеток на 95% слияния в соответствии с шагами 1.4.1-1.4.3.
2. Использование 1000 мкл пипетки осторожно ресуспендирования клеток в ~ 2 мл RPMI + до концентрации 3 × 10 ⁶ клеток / мл, определяемых в расчете клетки с помощью гемоцитометра.
3. Применить 50 мкл клеточной суспензии (1,5 х 10 ⁵ клеток) к каждому проницаемой поддержки, не касаясь мембрану. Поместите крышку на блюдо и осторожно поместите блюдо при 37 ° С с 5% CO ₂ в течение не более 16 часов.
4. Использование стерильного пинцета, право проницаемые опоры в 24-луночный планшет, содержащий 0,6 мл RPMI + на лунку. Добавить 0,1 мл RPMI + в верхний резервуар каждой проницаемой поддержки. Инкубируют при 37 ° С с 5% CO _2.
5. Замените среду каждые 2 дня. Во-первых, аспирации среды из верхнего резервуара с последующим нижним резервуаром, а затем применить свежий RPMI + в обратном порядке, в нижний резервуар (0,6 мл) и затем верхний Reservoir (0,1 мл).
6. Через семь дней после посева проницаемые опоры с 5637 клеток, оценивать слияния клеток. Заполните верхний резервуар с RPMI + (~ 0,35 мл). Клетки достаточно сливающийся, когда среда не в равновесие между верхним и нижним резервуарами.

3. Приготовление бактериального инокулята

1. С помощью асептической техники, добавляют 20 мл соответствующей культуральной жидкости в колбу на 250 мл с крышкой. Используйте Лурия-Бертани (LB) бульон для Е. палочки культур и добавить антибиотики в бульон при необходимости.
2. Используя стерильный инокуляционную петлю, привить бульон с бактериями из глицерина складе или разводов пластины. Для штаммов УПЭК, инкубировать бактериальной культуры при 37 ° С в течение примерно 16 ч, без встряхивания (содействовать производство типа 1 пили).
3. Передача бактериальной культуры в центрифужную пробирку. Гранул бактерий центрифугированием при 8000 х г в течение 10 мин.
4. Слейте супернатантИ ресуспендируют в PBS бактерий к OD ₆₀₀ = 1,000, что соответствует ~ 10 ⁹ КОЕ / мл.
   1. Для генерации убитых нагреванием бактерий стимул, инкубировать аликвоту (например, ~ 1,5 × 10 ⁸ КОЕ в 150 мкл) ресуспендировали бактерий при 55 ° С в течение 30 мин. Пластинчатый аликвоту убитых нагреванием суспензии бактерий для подтверждения смерти.
5. Непосредственно перед использованием разбавить ресуспендировали бактерии (живые или убитых нагреванием) в 10 раз до 10 ⁸ КОЕ / мл в теплой бессывороточной среде RPMI [называют RPMI-] в пробирке.

4. Выделение нейтрофилов человека из периферической крови

Сбор крови от взрослых добровольцев требует предварительного рассмотрения и согласования с этическими комитетами. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты и правильно распоряжаться опасных материалов, чтобы избежать контакта с человеческой кровью.

1. Примерно 25 мл венозной крови от здорового взрослого Volunteer должны быть вовлечены в 3 стерильных гепарина содержащих сбора крови труб натрия сотрудниками подготовку в кровопускания.
   1. Плотно оберните резиновую жгут вокруг плеча, выше локтя.
   2. Лечить сайт въезд, локтевой ямки, с помощью стерильного 70% спиртом протереть.
   3. Прикрепите пластиковый держатель трубки для крылатого системы бабочка иглы.
   4. Вставьте иглу в локтевой вены под углом 30 ° или менее, скос вверх. Игла проколол вену, когда рывок крови появляется в пластиковой трубки.
   5. Вставьте пробирку для сбора крови в держатель пластиковой трубки. Когда первый комплект камера заполнена, замените второй пробирку. Повторите с третьей трубкой.
   6. Когда третий комплект камера примерно наполовину, снимите жгут.
   7. Накройте место прокола стерильным ватным тампоном и медленно извлеките иглу из вены. Наденьте защитный щит над иглой и место, которое япа биологической контейнер для острых предметов.
   8. Надавите на месте прокола. Накройте месте прокола и ватным тампоном с клеевой повязка.
   9. Аккуратно переверните пробирки для сбора крови, чтобы рассеять гепарин.

Выполните следующие шаги в капот культуры ткани с помощью асептической техники.

2. Использование 10 мл пипетку осторожно переносить кровь в свежем, стерильные 50 мл коническую пробирку. Добавить эквивалентный объем 3% (вес / объем) декстран в 0,9% NaCl и перемешивают при инверсии. Инкубируйте пробирку вертикально при комнатной температуре в течение 20 мин.
3. Без нарушения нижний слой, тщательно аспирации верхний слой и перенести его на новый 50 мл коническую трубку. Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин. Удалите супернатант.
4. Ресуспендируют осадок клеток в объеме 0,9% NaCl эквивалент исходного объема крови.
5. Слой 10 мл раствора центрифугирования плотности под клеточной суспензии, составляя за собой интерфейс между двумя фазами. Центрифуга при 400 х г в течение 30 мин, без тормоза. Удалите супернатант.
6. Для лизиса оставшихся эритроцитов, ресуспендируют осадок клеток в 10 мл холодной 0,2% NaCl. Инкубировать в течение 30 сек, а затем быстро добавляют 10 мл холодной 1,6% NaCl для восстановления изотоничности.
7. Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 6 мин. Удалите супернатант.
8. Повторите шаги 4.6-4.7, пока осадок клеток не появится, чтобы быть свободным от красных кровяных клеток, как правило, 3 раундов лизиса.
9. Использование 1000 мкл пипетки, ресуспендируют осадок клеток, в первую очередь ПМН, в теплой (37 ° С) в среде RPMI-концентрации 10 ⁷ клеток / мл, определяемой клеток подсчет с помощью гемоцитометра. Хранить клетки при 37 ° С до использования. Как правило, ПМН жизнеспособность и чистота> 99% по оценке трипанового синего и визуализации ядерной морфологии после окрашивания, соответственно.

5. Transuroepithelial миграции нейтрофилов Каксказать

Выполните следующие шаги в капот культуры ткани с помощью асептической техники. Используйте только проницаемые опоры подшипников сливные 5637 слоев клеток, как определено на этапе 2.7. 24-луночные планшеты, содержащие RPMI-, могут быть получены заранее и выдерживают при 37 ° С с 5% CO ₂ до использования.

1. Алиготе 1 мл согреть RPMI-на лунку в 24-луночный планшет, приготовьте 3 скважины на проницаемой поддержки.
2. Аспирируйте среды из верхних и нижних резервуаров проницаемых опор.
3. Использование стерильного пинцета, передавать проницаемые опоры в 24-луночный планшет, полученного на стадии 5.1. Промыть проницаемой поддерживает три раза путем переноса опоры от скважины к скважине.
4. Если бактериального инокулята должен быть использован, инвертировать проницаемые опоры в стерильной культуре 25 мм глубоких тканей блюдо. Если хемоаттрактант (например, N-формил-Met-Leu-Phe (fMLF) или IL-8) должен быть использован, перейти к этапу 5.6.
5. Для экспериментов с живой или убитой BactПерс стимулы, привить апикальной стороне каждой проницаемой поддержки с 60 мкл RPMI-(макет инфекция) или с бактериальной посевного (6 х 10 ⁶ КОЕ), полученного на стадии 3.5. Поместите крышку на блюдо и инкубировать при 37 ° С с 5% CO ₂ в течение 1 часа.
6. Добавить 0,6 мл RPMI-на лунку в 24-луночный низкой монтажной пластине; подготовить один за хорошо проницаемой поддержки. Подготовьте 3 лунки, содержащие 0,5 мл RPMI-перечислить вход ПМН.
   1. Если хемоаттрактант используется вместо бактерий, добавьте хемоаттрактант в 0,6 мл RPMI-в 24-луночный планшет, полученного на стадии 5.6.
7. Справа проницаемые опоры в 24-а с низким уровнем монтажной пластине.
8. Добавить 0,1 мл ПМН (10 ⁶ ПМН), полученного на стадии 4.9, в верхний резервуар (базолатеральная сторона) каждого проницаемой поддержки. Добавить 100 мкл ПМН непосредственно в лунки, содержащие 500 мкл RPMI-. Инкубируют при 37 ° С с 5% CO ₂ в течение 1 часа.
9. Использование стерильного пинцета, мягко очиститьМембрана из проницаемого по отношению к поддержке край колодца, чтобы удалить дополнительный ПМН от апикальной стороне, а затем утилизировать поддержки.
10. Сбор ПМН, осторожно очищая дно каждой лунки с кончика пипетки 1000 мкл, и передавать PMN суспензий в микроцентрифужные пробирки.
11. Перечислять ПМН помощью гемоцитометра.
12. Для расчета общего количества ПМН в нижний резервуар, умножьте количество ПМН в 1 мм ² (100 NL) на 6000. Данные могут быть представлены в виде процента от входного PMN, или как число PMN нормализованы до 10 входного ⁶ PMN.

Результаты

Transuroepithelial миграции нейтрофилов анализ позволяет количественно оценить человеческие PMN миграции через культивируемых слоев мочевого пузыря эпителиальных клеток в ответ на различные стимулы (рис. 1б). В то время как протокол является простым, существует ряд переменных, которые могут влиять PMN миграцию и, следовательно, влияют на воспроизводимость этого анализа. Должны быть приняты меры при подготовке проницаемые опоры и ПМН, чтобы уменьшить изменчивость между техническими и биологических повтор...

Обсуждение

Использование культурный клеточной линии эпителиальной мочевого пузыря и Свежевыделенные человека ПМН, мы создали модель в пробирке transuroepithelial миграции нейтрофилов. Эта модель сыграла важную роль в начинают препарировать сложности врожденного иммунного ответа во время инфекции мочевыводящих путей (ИМП), чрезвычайно общей бактериальной инфекции обычно вызванного УПЭК ^9. Во время инфекции мочевого пузыря, или цистит, вербовка ПМН на просвет мочевого пузыря имеет важное значение для бактериально...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Вставки Transwell (т.е.  проницаемые опоры)	Corning	3472	6,5 мм, 3 μ m пора, мембранный вкладыш из полиэстера
BD Vacutainer Tubes	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	16 мм x 100 мм x 10 мл зеленые колпачки пробирки, содержащие гепарин натрия
BD Safety-Lok Набор для сбора крови и инфузии	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 г x 0,75 в игле x 12 в трубке
BD Vacutainer одноразового использования, нештабелируемый держатель	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	От Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS раствор для центрифугирования	плотности GE Healthcare	17-1440-02
Сверхнизкие крепежные пластины	Corning	3473	24-луночное, прозрачное плоское дно
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	Восстановлен в ДМСО до 10 мМ
рекомбинантного человеческого CXCL8/IL-8	R& D Systems	208-IL	восстановлен в PBS до 100 мкм; г/мл