Методическая статья

Анализ скелетных мышц дефектов в личинок данио рерио по двулучепреломления и сенсорный вызывают Побег реагирования Анализы

7.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50925

⸱

13 декабря 2013 г.

 ,  , 
1Division of Genetics and Genomics, Manton Center for Orphan Disease Research, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Рыбка данио-рерио в настоящее время является признанным и мощным инструментом для моделирования мышечных дистрофий, врожденных миопатий и связанных с ними нервно-мышечных заболеваний. Двойное лучепреломление и поведение, вызванное прикосновением, являются двумя распространенными неинвазивными анализами, используемыми для определения степени мышечной дезорганизации и двигательных нарушений эмбрионов рыбок данио во время раннего развития.

Аннотация

Данио-рерио (Danio rerio) стали особенно эффективным инструментом для моделирования заболеваний человека, поражающих скелетные мышцы, включая мышечные дистрофии1-3, врожденные миопатии4,5 и нарушения саркомерной сборки6,7, из-за высокой геномной и структурной сохранности у млекопитающих8. Мышечная дезорганизация и нарушение опорно-двигательного аппарата могут быть быстро оценены у рыбок данио в течение первых нескольких дней после оплодотворения. Два теста, помогающие охарактеризовать дефекты скелетных мышц у рыбок данио-рерио, — это двойное лучепреломление (структурный) и реакция бегства, вызванная прикосновением (поведенческий).

Двойное лучепреломление — это физическое свойство, при котором свет вращается, проходя через упорядоченную материю, такую как псевдокристаллический массив мышечных саркомеров9. Это простой, неинвазивный подход к оценке целостности мышц полупрозрачных личинок данио-рерио на ранних стадиях развития. Рыбки данио-рерио дикого типа с высокоорганизованными скелетными мышцами кажутся очень яркими на темном фоне при визуализации между двумя поляризованными световыми фильтрами, в то время как мышечные мутанты имеют паттерны двойного лучепреломления, специфичные для первичного мышечного расстройства, которое они моделируют. Мышечные дистрофии рыбок данио, заболевания, характеризующиеся дегенерацией миофибры с последующими повторными раундами регенерации, дегенеративные темные пятна в скелетных мышцах под воздействием поляризованного света. Недистрофические миопатии не связаны с некрозом или регенеративными изменениями, но приводят к дезорганизации миоволокон и слабости скелетных мышц. Миопатические рыбки данио-рерио обычно демонстрируют общее снижение двулучепреломления, что отражает дезорганизацию саркомер.

Тест на побег, вызванный осязанием, включает в себя наблюдение за поведением эмбриона при плавании в ответ на тактильную стимуляцию10-12. По сравнению с личинками дикого типа, мутантные личинки часто демонстрируют слабое сокращение побега, за которым следует медленное плавание или другой тип нарушенного движения, который не может продвинуть личинки более чем на короткое расстояние. Преимущество этих анализов заключается в том, что прогрессирование заболевания у одного и того же вида рыб можно наблюдать in vivo в течение нескольких дней, и что большое количество рыб может быть проанализировано за короткое время по сравнению с высшими позвоночными.

Протокол

1. Анализ структуры скелетных мышц in vivo с помощью двулучепреломления

  1. Подготовьте брачные клетки, отделяющие самца (самцов) от самки желаемой линии данио-рерио поздно вечером после кормления.
    1. Отличайте самок по большему животу и легкой сине-белой окраске, а самцов по стройной форме тела и розово-желтым оттенкам.
    2. Успех при парном скрещивании (один кобель и одна самка) может составлять всего около 50%. Для более высокого уровня успеха спаривайте одного самца с 2-3 самками.
  2. Уберите перегородки в садках на следующее утро вскоре после наступления света и позвольте рыбе нереститься без помех.
  3. Собирайте яйца с помощью ситечка, когда на дно резервуара будет отложено достаточное количество оплодотворенных яиц.
  4. Перенесите эмбрионы в глубокую чашку Петри, промыв ситечко рыбьей водой, и верните рыб-родителей в их аквариумы. Поместите посуду с эмбрионами в инкубатор с температурой 28,5 °C.
  5. Очистите нежизнеспособные яйца и мусор позже в тот же день или на следующее утро и верните эмбрионы в инкубатор для дальнейшего роста.
  6. Эмбрионы/личинки достигают соответствующего возраста для наблюдения двойного лучепреломления через 3-7 дней после оплодотворения (dpf), так как результаты, полученные до 3 dpf, могут потенциально страдать от ограниченного контраста. Эмбрионы дикого типа вылупляются из хорионов между 48-60 часами после оплодотворения (HPF), после чего происходит выпрямление оси тела. Поздно вылупившимся эмбрионам дикого типа или мутантным эмбрионам может потребоваться ручная дехорионация.
    1. Острыми щипцами аккуратно сделайте надрыв в хорионе и переверните его вверх ногами, чтобы зародыш выпал наружу.
    2. Дайте дехорионированным эмбрионам выпрямиться перед началом анализа.
    3. Обезболите эмбрион(ов) трикаином (0,04% в рыбьей воде), чтобы помочь их правильному положению.
  7. Установите препарирующий микроскоп с поляризованной линзой, которую можно поворачивать для регулировки угла поляризованного света (рис. 1A).
  8. Поместите дехорионированный, обезболенный эмбрион (эмбрионов) непосредственно поверх второго поляризационного хрусталика вдоль боковой оси тела. Вторая линза должна быть расположена ниже верхней линзы, на предметном столике микроскопа (рис. 1B). Ни в коем случае не используйте пластиковые чашки Петри во время анализа двойного лучепреломления, так как пластик не является подходящей средой для пропускания преломленного света.
  9. Поворачивайте верхнюю линзу с интересующим вас зародышем до тех пор, пока оси поляризации двух линз не будут ориентированы под углом 90° друг от друга, а фон не станет полностью темным.
  10. Оптимальный результат анализа зависит от ориентации рыб между двумя поляризационными линзами. Перемещайте рыб, чтобы убедиться, что они лежат как можно ровнее.
    1. Если рыба изогнута, то только сегменты с такой плоской ориентацией будут пропускать поляризованный свет и проявлять двойное лучепреломление. В таких случаях измерьте двулучепреломление на плоских участках и запишите двулучепреломление соответствующей области у рыб дикого типа (например, сомиты 1-10 как у диких рыб, так и у мутантных рыб).
  11. Наблюдайте за двулучепреломляющим фенотипом рыб.
    1. Рыбы дикого типа с высокоорганизованной скелетной мускулатурой демонстрируют яркое двулучепреломление, так как показатель преломления для света, параллельного миофиламентам, выше, чем поляризованный свет, перпендикулярный этим структурам.
    2. Рыбы с дезорганизованной скелетной мускулатурой, указывающей на недегенеративную миопатию или дефект развития, обычно демонстрируют общее снижение двулучепреломления.
    3. Рыбы с дезорганизованной скелетной мускулатурой, характерной для мышечной дистрофии, обычно демонстрируют пятнистый рисунок двойного лучепреломления, с темными областями, представляющими мышечную дегенерацию среди ярких областей нормальной мышечной архитектуры.
  12. Количественно оценивайте двулучепреломление, получая изображения диких и мутантных рыб в поляризованном свете с теми же настройками экспозиции и увеличения. Сохраняйте изображения в виде файлов .tiff.
    1. Откройте изображения двойного лучепреломления в программе ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
    2. Для каждого изображения выберите область мышц данио-рерио, проведя линию вокруг тела с помощью опции «Выделение многоугольников» на панели инструментов.
    3. Используйте «Установить измерения» в раскрывающемся меню «Анализ», чтобы выбрать необходимую статистику для изображения.
      1. Минимальный выбор требует, чтобы были установлены флажки «Площадь», «Среднее значение серого» и «Минимальное и максимальное значение серого».
      2. Максимальное значение серого >255 указывает на насыщенность пикселей. Поэтому используйте изображения с максимальными значениями серого меньше 255.
    4. Нормализуйте среднюю интенсивность для выбранной области и повторите ту же процедуру количественной оценки для каждого изображения двойного лучепреломления.

2. Анализ поведения при побеге с помощью прикосновения

  1. Установите брачные пары соответствующей линии (линий) данио-рерио и соберите эмбрионы, как описано выше в шагах 1.1-1.5.
  2. Через 2-7 дней после оплодотворения поместите дехорионированные эмбрионы/личинки по отдельности в глубокую чашку Петри или камеры многолуночных планшетов.
  3. Работая только с одним эмбрионом за раз, центрируйте эмбрион в поле зрения стереомикроскопа Nikon SMZ1500 с цифровой камерой SPOT RT3 или аналогичной системой и начните последовательную визуализацию.
    1. Одинаковая частота визуализации должна использоваться как для диких видов, так и для мутантных рыб. Рекомендуется использовать частоту кадров >30 Гц, так как более медленная частота обычно недостаточна для съемки быстрого плавания диких рыб.
  4. Доставляйте механосенсорные стимулы эмбриону, касаясь хвоста булавкой от насекомых.
  5. Остановите визуализацию, когда эмбрион перестал плавать или выплыл из поля зрения.
  6. Преобразуйте последовательные изображения в видеофайл или анализируйте отдельные кадры интервальной съемки в автономном режиме с помощью программного обеспечения SPOT 5.1 Advanced. Подобные программные пакеты включают Open Lab, NIS Elements или свободно доступный ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
  7. Количественно оцените поведение при плавании путем выполнения реакции, вызванной прикосновением, у нескольких эмбрионов.
    1. Это может быть достигнуто путем усреднения расстояния, которое эмбрионы могут проплыть в течение фиксированного промежутка времени, с помощью программного обеспечения или метрической линейки для обозначения начальной и конечной точек плавательного поединка.
      2. Избегайте привыкания
    2. эмбрионов к раздражителю на ощупь с течением времени, выполняя анализ с новым эмбрионом для каждого экспериментального повтора. Поведение в моделях дикого типа и надежных мутантных моделях, как правило, обладает высокой воспроизводимостью.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Двойное лучепреломление может быть использовано в качестве эффективного неинвазивного метода анализа для изучения состояния организации миофибрилл в живых эмбрионах zebrafish. Представлены примеры zebrafish дикого типа, а также zebrafish со сниженной экспрессией генов, критически важных для развития и функционирования скелетных мышц. У zebrafish дикого типа на 5-е сутки после оплодотворения (dpf) скелетные мышцы проявляют выраженное двойное лучепреломление в поляризованном свете благодаря упорядоченному расположению миоф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Первичные нервно-мышечные расстройства традиционно классифицируются как дистрофические или недистрофические процессы. Мышечные дистрофии характеризуются дегенерацией миофибры с последующими повторными циклами регенерации, что в конечном итоге приводит к процессу конечной стадии, типичному для фиброза и замещения жировойтканью. Недистрофические миопатии, напротив, не связаны с некрозом или регенеративными изменениями, но приводят к дезорганизации миоволокон и общей слабости скелетных мышц.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируется.

Благодарности

Мы благодарим Бехзада Могадасзаде за его замечательную помощь в количественной оценке изображений двулучепреломления. Эта работа была профинансирована Ассоциацией мышечной дистрофии США (MDA201302) и Национальным институтом артрита, скелетно-мышечных и кожных заболеваний (R01 AR044345), а также щедрой поддержкой от A Foundation Building Strength, Cure CMD и благотворительного фонда AUism. VAG поддерживается K01 AR062601 от Национального института артрита, опорно-двигательного аппарата и кожных заболеваний, а LLS — F31 NS081928 от Национального института неврологических расстройств и инсульта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Трикейн SigmaA5040
Чашки ПетриFischer Scientific0875711Z
ЩипцыFischer Scientific100189-588
Штифт от насекомыхFischer ScientificS67375
Поляризационные объективыRitz CameraQuantaray Tristar Optics C-PL 72 мм
ИнкубаторFischer Научныйизотемповый инкубатор модели 630D
МикроскопNikon Instruments Inc.SMZ 1500
CameraDiagnostic Instruments Inc.SPOT RT3
Diagnostic Instruments Inc.SPOT 5.1 Продвинутый
Программное обеспечение для визуализации

Ссылки

  1. Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
  2. Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
  3. Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (17), 7092-7097 (2007).
  4. Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5 (2), e1000372(2009).
  5. Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
  6. Ferrante, M. I., Kiff, R. M., Goulding, D. A., Stemple, D. L. Troponin T is essential for sarcomere assembly in zebrafish skeletal muscle. J. Cell Sci. 124 (4), 565-577 (2011).
  7. Hawkins, T. A., et al. The ATPase-dependent chaperoning activity of Hsp90a regulates thick filament formation and integration during skeletal muscle myofibrillogenesis. Development. 135 (6), 1147-1156 (2008).
  8. Barbazuk, W. B., et al. The syntenic relationship of the zebrafish and human genomes. Genome Res. 10 (9), 1351-1358 (2000).
  9. Schapira, G., Dreyfus, J. C., Joly, M. Changes in the flow birefringence of myosin as a result of muscular atrophy. Nature. 170 (4325), 494-495 (1952).
  10. Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. The development and behavioral characteristics of the startle response in zebrafish. Dev. Psychobiol. 7, 47-60 (1974).
  11. Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The Mauthner-initiated startle response in teleost fish. J. Exp. Biol. 66, 65-81 (1977).
  12. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
  13. Hirata, H., et al. Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease. Development. 134 (15), 2771-2781 (2007).
  14. Wallace, G. Q., McNally, E. M. Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies. Annu. Rev. Physiol. 71, 37-57 (2009).
  15. Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
  16. Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (4), 785-788 (2012).
  17. Low, S. E., et al. TRPM7 is required within zebrafish sensory neurons for the activation of touch-evoked escape behaviors. J. Neurosci. 31 (32), 11633-11644 (2011).
  18. Liu, D. W., Westerfield, M. Function of identified motoneurones and co-ordination of primary and secondary motor systems during zebrafish swimming. J. Physiol. 403, 73-89 (1988).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

zebrafishin vivo

Похожие статьи