Формирование упорядоченных биомолекулярных структур по самосборки коротких пептидов

Summary

Эта статья описывает формирование высокоупорядоченных на основе пептидов структур по стихийного процесса самосборки. Метод использует имеющиеся в продаже пептиды и общего лабораторного оборудования. Этот метод может быть применен к большому разнообразию пептидов и может привести к обнаружению новых основе пептидов сборок.

Abstract

В природе, сложные функциональные структуры образованы самосборки биомолекул в мягких условиях. Понимание силы, которые управляют самосборки и имитировать этот процесс в пробирке будет привести к значительным достижениям в области материаловедения и нанотехнологий. Среди доступных биологический строительных блоков, пептиды имеют ряд преимуществ, как они представляют значительную разнообразие, их синтез в больших масштабах проста, и они могут быть легко изменены с биологических и химических образований ^1,2. Несколько классов, предназначенных пептидов, таких как циклические пептиды, амфифильные пептиды и конъюгаты пептида самосборке в упорядоченные структуры в растворе. Homoaromatic дипептиды, представляют собой класс коротких самособирающихся пептидов, которые содержат всю молекулярную информацию, необходимую для формирования упорядоченные структуры, такие как нанотрубки, сфер и фибрилл ^3-8. Большое разнообразие этих пептидов является коммерчески доступным. 9 Протоколы представленные здесь могут быть адаптированы к другим классам пептидов или биологическая строительных блоков и потенциально может привести к открытию новых пептидных структур на основе и лучше контролировать их сборки.

Introduction

Природа формы заказаны и функциональных структур в процессе биомолекулярной самостоятельной сборки. Понимание силы, которые управляют этой стихийный процесс может привести к способности имитировать самосборки в пробирке и, следовательно, к значительному прогрессу в области материаловедения ^10,11. Пептиды, в частности, весьма перспективны в качестве биомолекул строительного блока, так как они представляют большой структурное разнообразие, простоту химического синтеза, и может быть легко функционализированных биологических и химических образований. Поле пептидной самосборки был впервые Гадири и его коллег, которые продемонстрировали самосборки пептидных нанотрубок циклических пептидов с чередующимися D-и L-аминокислоты ^12. Другие успешные подходы к проектированию пептидных сборок включают линейные bolaamphiphile пептиды ^5, амфифилы (AP) ^6, несопряженные самодополнительных ионные пептиды ^13, поверхностно-как пептиды 4,14, и диблочный copolypeptides ^15.

В последнее время подход включает самосборки коротких ароматических пептидов, называется homoaromatic дипептиды. Эти пептиды содержат только две аминокислоты с ароматический характер (например Phe-Phe, трет-бутилдикарбоната (Boc)-Phe-Phe) ^7,8,16-21. Структуры, образованные этими homoaromatic пептидов включают трубчатые структуры, сферы, листообразных узлов и волокон ^{6,8,15,21-32.} Волокна в некоторых случаях генерировать фибрилл сетку, который дает гидрогель ^33-37. Эти сборки были использованы для применений биодатчиков, доставки лекарств, молекулярной электроники и т.д.. ^38-45

Эта статья описывает экспериментальные шаги, необходимые для того, чтобы начать спонтанное самосборки homoaromatic пептидов. Кроме того, он представляет процесс пептида coassembly. Этот процесс включает в самосборки более чем одного типа пептидамономер.

Наша демонстрация включает coassembly двух коммерчески доступных пептидов: дифенилаланин пептид (NH _{2-Phe-Phe-COOH)} и его Вос-защищенный аналог (Boc-Phe-Phe-OH). Каждый из пептидов объединяющаяся в надмолекулярной структурой: дифенилаланин пептидные форм трубчатые сборками и Вос-Phe-Phe-OH пептидные объединяющаяся в либо сфер или волокон в зависимости от растворителя ^7,17,46. Мы смешал два пептида в определенных соотношениях и характеризуется приведенных сборок с помощью электронной микроскопии, силовой микроскопии и ИК-спектроскопии. Методы продемонстрировали формирование структуры на основе пептидов, которая состоит из сферических элементов с диаметром в несколько микрон (1-4 мкм), которые соединены удлиненных сборок с диаметром несколько сотен нанометров (~ 300-800 нм) . Сборки напоминают бисером строк в их морфологии, а сферические структуры, кажется, с резьбой наудлиненные сборки. Поэтому мы назвали эти сборки "биомолекулярные ожерелья". В "биомолекулярные ожерелья" может служить в качестве нового биоматериала, как доставки лекарств агента или в качестве каркаса для электронных приложений. Кроме того, процесс, который приводит к самосборке пептидов могут быть использованы с другими классами пептидов и биомолекул. Это может привести к лучшему пониманию сил, участвующих в самостоятельной сборки и формирования новых упорядоченных структур.

Protocol

1. Самосборка Homoaromatic дипептидов

1. Взвесить желаемый пептид в лиофилизированной форме (например, NH _{2-Phe-Phe-OH,} Boc-Phe-Phe-COOH) и Подготовка исходного раствора путем растворения пептида в 1,1,1,3,3,3-гексафтор -2-пропанол (HFP) до соответствующей концентрации (например, 100 мг / мл для NH _2-Phe-Phe-OH и Boc-Phe-Phe-COOH) ^7,17,46.
2. Смешайте раствор с помощью вихря и место на скамейке, пока пептид полностью не растворится и раствор кажется очевидным (несколько минут).
3. Развести маточного раствора пептида, в подходящем растворителе, до соответствующей концентрации (например, 2 мг / мл NH _2-Phe-Phe-OH в тройной дистиллированной воде (TDW) для формирования нанотрубок; добавлением 2 мкл пептида Исходный раствор до 98 мкл TDW, 5 мг / мл Вос-Phe-Phe-COOH в этаноле для формирования сферических структур).
4. Держите раствора при комнатной температуре в течение 24ч.
5. Для того чтобы избежать любого preaggregation, готовят свежие растворы для каждого эксперимента.

2. Coassembly о двух Homoaromatic дипептидов

1. Готовят раствор 50%-ного этанола путем смешивания равных объемов TDW и абсолютного этанола. Используйте вихрь смешивать два решения.
2. Взвесить 2 мг пептида NH _2-Phe-Phe-OH и 1 мг пептида Boc-Phe-Phe-OH. Растворить каждого пептида в HFP до концентрации 100 мг / мл.
3. Смешайте пептиды растворы с использованием вихрь и разместить их на скамейке, пока пептиды не полностью растворяются и решения кажутся понятными.
4. Смесь пептидов растворы в желаемом соотношении. В этом конкретном эксперименте смесь 10 мкл пептида NH _2-Phe-Phe-OH с 6 мкл пептида Boc-Phe-Phe-OH (до конечной соотношении 5:03 соответственно). В связи с высокой волатильностью растворителя HFP, рекомендуется подготовить большое количество этого раствора (на лугул 10 мкл).
5. Используйте вихрь смешивать смешанные пептиды маточного раствора.
6. Развести смешанные пептиды исходного раствора с 50%-ным этанолом до желаемой конечной концентрации. В этом конкретном эксперименте, чтобы получить конечную концентрацию 5 мг / мл в течение NH _2-Phe-Phe-OH и 3 мг / мл в течение Boc-Phe-Phe-OH соответственно, добавляют 8 мкл смешанного раствора пептидов до 92 мкл 50% раствора этанола. Используйте пипетку, чтобы мягко перемешать раствор.
7. Хранить раствор при комнатной температуре в течение 24 часов.
8. Следует отметить, что в связи с высоко летучей природы растворителя, эксперименты чувствительны к небольшим изменениям концентрации пептидов. Поэтому свежие растворы должны быть готовы для каждого эксперимента.

3. Характеристика из самоорганизующихся структур с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM)

1. Через 24 ч инкубации наносить каплю 10 мкл раствора пептидов на стеклянной бухтыг скольжения и сухой при комнатной температуре.
2. Пальто образец на стекло с тонким слоем золота (несколько нанометров) с использованием покрыти распылением в течение 90 сек.
3. Изображение сборки с использованием СЭМ работает на 10-20 кВ.

4. Характеристика из самоорганизующихся структур с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)

1. Поместите каплю 10 мкл пептидов раствора на 200 меш медную сетку, покрытой углеродом и стабилизированной опоры полимерной пленки.
2. После 1 мин удалить лишнюю жидкость с использованием фильтровальной бумаги.
3. Приготовьте раствор 2% уранилацетатом в TDW. Фильтр решение с помощью блока фильтров 0,22 мкм.
4. Чтобы окрасить образец (отрицательный окрашивания), поместите каплю 10 мкл уранилацетатом решения по сетке.
5. После 30 сек удалить лишнюю жидкость с помощью фильтровальной бумаги. Следует отметить, что, хотя отрицательный окрашивание повышает контрастность изображений, это не является необходимым во всех случаях.
6. Изображение образец на гоэ сетки с помощью ПЭМ, работающих на 120 кВ.

5. Трехмерная Характеристика Ассамблей атомно-силовой микроскопии (АСМ)

1. Подготовка пробы для анализа АСМ с использованием процедуры, описанной в пункте 3.1.
2. Проанализируйте пробу на стекле с помощью инструмента АСМ работает в режиме переменного тока. Использование кремниевых кантилеверов с пружины 3 н / м и резонансной частотой 75 кГц.
3. Начните путем сканирования большую площадь сетки, чтобы найти желаемую структуру. Тогда сосредоточиться на конкретной меньшей площади и сканирования (размер сканирования составляла 2,5 мкм х 2,5 мкм для изображения, включенные в этой рукописи).

6. Характеристика вторичной структуры по ИК-Фурье

1. Нанесите каплю 30 мкл раствора пептидов к окну CaF _2.
2. Разрешить решение сохнуть при комнатной температуре.
3. Адсорбция воды в спектре ИК в 1650 см ^-1.Этот пик в центре амидной группы I пептидной связи. Это также типичная пик α-спиральные структуры пептидов и белков ^47. Для того чтобы преодолеть эту проблему и избежать сигнал воды, обмен водорода к дейтерия должна быть выполнена. Поместите каплю оксида дейтерия (D ₂ O) на высушенного образца пептида. Падение должно быть достаточно большим, чтобы полностью покрыть пептида депозит на окне.
4. Разрешить образец сушить под вакуумом.
5. Повторите шаги 6.3 и 6.4 2x для обеспечения максимального обмена водорода к дейтерия. Сохранить образец под вакуумом до ее анализа.
6. Запишите спектры ИК-Фурье с использованием дейтерированного триглицинсульфата (DTGS) детектора. Система FT-ИК-спектр включает генератор продувочного газа, чтобы предотвратить влажности в среде образца. Для образцов коротких пептидов, то лучше для сканирования образца 2000 х при разрешении 4 см ^-1. Пропускание минимальные значения могут быть определены таким образомftware поставляется вместе с прибором.

Results

Эта статья описывает способ формирования упорядоченных структур в нано-и микронных масштабах по самосборки пептидов. Для того чтобы продемонстрировать это простой процесс, мы представляем и охарактеризовать coassembly двух простых ароматических пептидов (рис. 1). Один из пептидов является NH _2-Phe-Phe-OH (дифенилаланин) пептид, который может самосборке в водном растворе в полых трубчатых структур нанометровых размеров с ^7. Другой пептид является его Вос-защищенный аналог, Boc-Phe-P...

Discussion

Таким образом, эта статья демонстрирует легкость, в котором на основе пептидов сборки могут быть сформированы в пробирке. Процесс включает в себя коммерчески доступные пептиды и растворители, и это происходит спонтанно в условиях окружающей среды, при добавлении полярном растворителе в пробирке. Очень важно использовать HFP качестве растворителя пептидов, из-за низкой растворимости пептидов в других органических растворителей. Кроме того, из-за высокой летучести HFP необходимо готовить свежий исходный раствор д...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NH2-Phe-Phe-OH	Bachem	G-2925.0001
Boc-Phe-Phe-OH	Bachem	A-3205.0005
1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол	Sigma-Aldrich	52512-100ML
Этанол абсолютный (обезвоженный) AR стерильный	Bio-Lab Ltd.	52555	Смешивание с TDW для приготовления 50% раствора
уранилацетата	Sigma-Aldrich	73943	Для негативного окрашивания. Есть возможность работать и без него.
Стеклянная крышка	Мариенфельд Лабораторная посуда	110590
TEM сетки	Электронная микроскопия науки	FCF200-Cu-50	Формвар/Углерод 200 меш, Cu
Количественная фильтровальная бумага	Ватман	1001055
оксид дейтерия (D<суб>2O)	Sigma-Aldrich	151882-100G	99,9 атом % D
CaF<суб>2 окно	PIKE Technologies	160-1212	окно 25 мм х 2 мм. Для ИК-Фурье измерений
АСМ-наконечники	NanoScience Instruments	CFMR	Aspire зонды, фильтрующие блоки CFMR-25
	Millipore	SLGV033RS	Millex-GV, 0,22 μ m, PVDF, 33 мм, гамма стерилизованный
SEM FEI			Quanta 200 ESEM
TEM	FEI		Tecnai T12 G2 Spirit
AFM	JPK Instruments		A JPK NanoWizard3
FT-IR	Thermo Fisher Scientific		Nicolet 6700 усовершенствованный золотой спектрометр
FT-IR Purge	Parker		BALSTON FT-IR Генератор продувочного газа модель 75-52
Программное обеспечение OMNIC (Nicolet)	Thermo Nicolet Corporation		Для анализа ИК-Фурье спектров
Вихревой смеситель	Wisd Лабораторное оборудование		ViseMix VM
Weight	Mettler Toledo		NewClassic MS
Sputter Coater	Polaron		SC7640 Sputter Coater