Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Определение белок-белковых взаимодействие в

13.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50968

⸱

5 декабря 2013 г.

 ,  ,  , 
1Neuroscience Center of Excellence, Louisiana State University Health Sciences Center

В этой статье

Краткое содержание

Drosophila славится своей мощной генетической манипуляции, но не для его пригодности углубленного биохимического анализа. Здесь мы представляем процедуру TAP основе для выявления взаимодействующих партнеров любого интересующего белка с лету мозга. Эта процедура может потенциально привести к новым бульварам исследования.

Аннотация

Генетические экраны, проведенные с использованием дрозофилы (плодовой мухи) сделали многочисленные вехой открытия в заранее биологических наук. Тем не менее, использование биохимических экранов, направленных на расширение знаний, полученных от генетического анализа была изучена лишь недавно. Здесь мы опишем метод, чтобы очистить белковый комплекс, который ассоциируется с любого интересующего белка от взрослых мух голов. Этот метод использует системы дрозофилы GAL4/UAS выразить приманки белка, слитого с тегом Тандем Affinity Очистка (ТАР) в лету нейронов в естественных условиях, а затем реализует два раунда очистки с использованием процедуры TAP похожий на тот, первоначально закрепленной в дрожжи 1, чтобы очистить взаимодействующих белкового комплекса. В конце этой процедуры, смесь нескольких белковых комплексов получается, молекулярная идентичность может быть определена путем масс-спектрометрии. Проверка кандидата белков выиграют от гesource и простота выполнения с потерей функции исследования в мух. Аналогичные подходы могут быть применены к другим мухи тканей. Мы считаем, что сочетание генетических манипуляций и этого протеомного подхода в лету модельной системы имеет огромный потенциал для решения фундаментальных проблем в области нейробиологии и за ее пределами.

Введение

Определение молекулярных путей и сетей, которые опосредуют особую биологический процесс является одним из конечных целей биомедицинских исследований. Fly генетики значительной степени зависят от форвардных генетики, особенно модификатора генетические экраны (как энхансерные и экраны супрессоры), выявить факторы, которые работают вместе, параллельно с или до или после интересующего гена. Тем не менее, вперед генетика экраны зачастую не в состоянии идентифицировать существенные гены, которые, когда мутировал, вызвать летальность на ранних стадиях развития, или гены с функциональной избыточности и компенсации которого потеря функции только вызывают тонкие дефекты, которые трудно забить. Одним из способов преодоления этой трудности является для выявления прямых белок-белковых взаимодействий. На протяжении более чем десяти лет, растущий список биохимическими методами, в том числе дрожжей двухгибридной фагов, химической сшивки, со-IP, Tandem аффинной очистки (TAP) и др. были использованы для исследования белок-белковых взаимодействий. Каждый из этих подходов имеет свой собственный набор сильных и слабых сторон в отношении чувствительности и специфичности. Среди них, метод TAP позволяет для обнаружения физического взаимодействия в ближней физиологических условиях, сохраняет специфику и последовательности 2 и включает в себя возможность расширения до высокой пропускной анализирует 3,4.

Метод TAP был первоначально разработан в дрожжах путем Rigautand коллегами 1. В этом методе, представляющий интерес белок экспрессируется с краном тега. TAP тег таит два независимых сродством-связывающие домены: белок доменов, который связывается с IgG и калмодулин-связывающий домен. Две области отделены друг от друга TEV (табак) травления Вирус сайта расщепления. Такое сочетание позволяет два независимых раунда сродства очисток, чтобы значительно уменьшить неспецифические привязки и обогатить конкретных привязок 1. Для этого, например, метод ТАР является очень мощным метод определить в естественных условиях взаимодействия данного белка, хотя гиперэкспрессией экзогенного белка может сделать его более склонны связывать с белками, которые обычно не комплекс с эндогенным коллегой. С момента своего развития, метод ТАР был применен во многих других системах, в том числе клеточных культур на основе систем 5,6 и других в естественных условиях модельных систем 6-9. Здесь мы опишем адаптации метода TAP у дрозофилы. Сначала генерировать pUAST-NTAP и pUAST-CTAP векторы для облегчения клонирования и слияние ТАР тега или к N-или C-конце гена. UAS-TAP-меченый трансген затем выразили в нервной системе под контролем нейронов водителя GAL4 10. Далее, большое количество взрослых мух головок будут собраны, которые имеют высокое содержание нервных клеток и их легко отделить от других частей тела после замораживания на основе различия в размерах. Взрослые руководители гомогенизируют и очистили бу последовательные центрифугирования и супернатант подлежит процедуре TAP, описанным ниже.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Создать БАС-тук-тегами Трансгенные Мухи

  1. Создать pUAST-тук-тегами конструкции ДНК.
    1. Решают, какая сторона (N-или С-конец) белка приманки TAP тег должен быть слит с, на основе структуры / функции белка. См. обсуждение для более подробной информации.
    2. Субклонировани кодирующей области кДНК гена интереса в нескольких сайтах клонирования (MCS) векторов pUAST-NTAP или pUAST-CTAP генерировать N-или С-концевой-метками UAS-TAP трансгены, соответственно. См. рисунок 1 для подробными картами и используемых сайтов рестрикции и рамок считывания.
  2. Создать БАС-тук-тегами трансгенных мух.
    1. Генерация трансгенных мух в соответствии со стандартными протоколами с использованием P-элемент опосредованного вставку 11. Количество впрыска услуг являются коммерчески доступными.
    2. Cross нейронов драйвер GAL4 (т.е. BG380-GAL4) для каждого отдельного трансгенной линии и определить уровни экспрессии белкакаждой строки методом вестерн-блоттинга (с пероксидазой анти-антителом пероксидазы) и / или (с иммунным окрашиванием анти-антителом TAP). В общем, трансгенной линии с уровнем белка выражение, близкое к эндогенного белка рекомендуется для процедур TAP. См. обсуждение для более подробной информации.
    3. PerformGAL4/UAS-based спасательных эксперименты, чтобы подтвердить функциональность TAP-меченый трансгенов, если с потерей функции мутанты генов, представляющих интерес доступны. Выберите трансген, которые могут существенно спасти мутантные фенотипы для следующих экспериментов TAP.

2. Подготовка образцов для процедуры TAP

  1. Создать лету запас, который несет как нейронный драйвер GAL4 (например BG380-Gal4) и выбранный TAP-меченый трансген в целях облегчения расширение образцов мухи. Соберите F1 потомство водителя GAL4 и УАС-трансген крестом в редких случаях, когда указанное сочетание вызывает выживания и роста недостаток.
  2. Соберите образцы малого масштаба и оптимизации лизиса условие растворения TAP-меченый белок.
    1. Сделать серию лизиса буферов, используя комбинацию из неионогенных моющих средств NP-40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%) и Triton X-100 (0,05-0,5%). См. Таблицу 1 и обсуждение для получения дополнительной информации.
    2. На вершине слой CO2, используйте # 5 щипцы препарировать 20 взрослых головы от TAP трансгена, выражающей мух и собирать их в 1,5 мл трубки, чтобы проверить каждое условие лизис буфера.
    3. Добавить 100 мкл тестирование буфер для лизиса к трубе и гомогенизации головы поглаживая вверх и вниз с пластиковой пестиком, затем добавить еще 100 ул тестирования буфер.
    4. Вращайте головой лизата на 21 500 мкг в течение 10 мин (4 ° C), и отделить супернатант и осадок после центрифугирования. Добавьте 25 ул 2x SDS загрузки буфера к осадку и 10 мкл 4x SDS буфера для загрузки до 30 мкл супернатанта соответственно.
    5. Отварить два образца в течение 5 мин и анализировать их бокСтороны с помощью SDS-PAGE и последующего Вестерн-блот с PAP антитела. Определение растворимости отношением уровней TAP-белка в надосадочной жидкости против таблетки.
  3. Подготовка образца в крупном масштабе
    1. Развернуть и собирать взрослых мух.
      1. Развернуть акции neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene в бутылках и флип бутылки каждые 3 дня до накопительных 250 бутылок используются для коллекции.
      2. Соберите 1-3 дней для взрослых летит в 50 мл конические пробирки, положить трубку в жидком азоте сразу глубокой заморозки мухи. Храните мух в -80 ° C морозильник. Следует отметить, что объем мух не должна превышать 2/3 от 50 мл пробирку.
    2. Сбор летать головы (выполнить этот шаг на вершине пудрой сухого льда).
      1. Выньте prechilled сита и ступку и пестик от -80 ° C морозильник и положить их на сухом льду, в идеале в большом ведерке со льдом. Стек два США Стандартный сита с № 25 по гое верхней и № 40 в нижней части.
      2. Возьмите замороженные мух, и бросить их в жидком азоте и мух в там в течение приблизительно 10 мин. Vortex трясите трубы энергично ломать головы, ноги и крылья из тел.
      3. Вылейте смесь в верхнее сито, а затем встряхнуть сита энергично, удерживая обе сита вместе. После просеивания, тела будет оставаться на верхнее сито, летать руководители будут сохранены на нижней сито, и ноги, крылья, и другой мусор упадет на сухом льду. Отделите одну сита и осторожно перенести лету головы холодной раствора.
    3. Гомогенизируют лету головы
      1. В верхней части сухого льда, шлифуют головки с ступке пестиком и к порошкообразных частиц, а затем перенести порошка в 15 мл стеклянный Даунса тканевую мельницу, которая была prechilled на льду.
      2. Измерьте веса мясорубку до и после образец глава выливали в него, а затем подсчитать, сколько с головкой SAMPле весит. В общей сложности 6-15 граммов мух головок будет достаточно для каждого отвода эксперимента регулировочного соответственно до уровней экспрессии белка. Добавить 15 мл ледяной буфере для гомогенизации (лизис буфера оптимизированы в шаге 2.2) в порошок, а затем ход с большим зазором пестиком, пока это не легко для пестиком, чтобы пойти вверх и вниз. Держите стекла дробилку на льду во все времена.
    4. Подготовка супернатант для TAP
      1. Передача гомогената в высокоскоростном центрифужную пробирку и спина в течение 20 мин при 50000 х г ~ (4 ° С). Передача супернатант в новую высокоскоростной центрифуге трубки и повторите центрифугирования еще раз.
      2. Передача супернатант в ультрацентрифужную пробирку и выполнить 40 мин ~ 250 000 XG спина для дальнейшего очистить супернатант. Верхний слой готов к процедурам очистки тандем сродства после ультрацентрифугированием.

3. TAP Очистка

В следующих разделах были получены из лаборатории ПТК Seraphin protocol 12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )

  1. Выполните IgG шарик аффинной очистки
    1. Подготовка IgG на сефарозе шарик в то время как образцы центрифугируют. Вымойте 400 мкл IgG 3x шарик в 15 мл трубки Сокол с 10 мл холодной IgG промывочного буфера. Для каждого мытья, рок трубку осторожно в течение 2 мин, а затем спин вниз бисером на 1000 мкг в течение еще 2 мин. В конце третьей промывки, удаления буфера и оставить только шарики в трубке.
    2. Тщательно передачи очищенный супернатант (~ 15 мл) в 15 мл пробирку, содержащую шарики IgG. Инкубируйте бисером и мозг лизата смесь при температуре 4 ° С на nutator в течение 2 часов.
    3. Настройка чистый и пустой микро колонки около 15 мл общий объем в холодной комнате. Загрузите шарик смесь IgG на стабильно заливки смеси в колонне; стараюсь не ловушка любойпузырьки воздуха внутри колонны. Разрешить шарики, чтобы обосноваться в столбце и буфером медленно стекать самотеком.
    4. Промывают колонку тщательно с 10 мл холодного промывочного буфера IgG в конце концов из лизата мозга текла через колонку урегулированы IgG. Повторите мыть 2 раза. Примечание: никогда не позволяйте шарик сухой в воздухе.
  2. Выполните TEV расщепление
    1. После третьей промывки, промывки колонки снова 10 мл TEV буфера расщепления. Этот шаг готовит шарик IgG, что sequestrates приманки комплекс для TEV декольте.
    2. Непосредственно перед последней капли TEV буфера составляет около капать из, положить крышку в нижней части колонны, чтобы блокировать поток, добавьте 1,3 мл буфера, содержащего TEV 130 единиц TEV фермента на колонку, и затем надежно ограничить верхнюю столбец. Убедитесь, что колонка запечатан хорошо на обоих концах.
    3. Поворот колонку при 18 ° С в течение 2 часов, чтобы позволить фермент TEV в отщепления пептида в TEV сайт и отпустить белковый комплекс бееле оставив белка Доменное пептид, связанный с бисером в IgG сефарозе.
  3. Выполните кальмодулином шарик аффинной очистки
    1. Подготовка шарики кальмодулина в то время как IgG гранулы инкубировали с ферментом TEV. Промыть 200 мкл кальмодулина шарики в 15 мл трубки 3x Falcon, каждый раз с 10 мл холодного буфера связывания кальмодулина. Для каждого мытья, аккуратно раскачивать трубку в течение 2 мин на nutator, а затем спин вниз бисером на 1000 мкг в течение 2 мин. В конце третьей промывки, вынуть все буфера и оставить только шарики в трубке.
    2. В конце инкубации TEV (шаг 3.2.3), вернуть колонку IgG назад в холодной комнате и установить его прямо вверх. Пусть шарики урегулировать в течение 10 мин.
    3. Снимите верхнюю крышку, а затем нижнюю крышку, а затем собрать мл TEV продукт расщепления 1,3 в 15 мл трубки Сокол. Дайте воде стечь буфер полностью. Добавить дополнительный буфер 200 мкл TEV в колонну вытолкнуть мертвый объем колонки, собирают енизким в той же пробирке.
    4. Добавить 4,5 мл кальмодулина обязательные буфер и 4,5 мкл 1 М CaCl 2 в 1,5 мл TEV продукта расщепления собранной выше. CaCl 2 служит для титрования ЭДТА в буфере ТэВ. Передача смеси 6 мл на пробирку, содержащую шарики кальмодулина и поворачивать трубу в 4 ° С на nutator в течение 1 часа.
    5. Установите другой чистый и пустой микро колонку с примерно 10 мл общего объема в холодном помещении. Загрузите шарик смеси кальмодулином в колонну и позволить ей стечь самотеком.
    6. Когда весь раствор текла через колонку урегулированы кальмодулина, промывки колонки два раза, каждый с 10 мл холодного буфера связывания кальмодулина. Примечание: не беспокоить бусинки кальмодулином и попытаться сохранить поверхность шариков как можно более плоскими во время стирки.
  4. Элюции приманки комплекс из колонки кальмодулином.
    Сразу после мытья, элюируют колонку кальмодулином с пятью фракциями 200 мкл холодного Calmoduлин элюирования буфера. Для каждой фракции, осторожно добавить 200 мкл буфера для элюции в колонке и сбора элюата с заметно 1,5 мл пробирку Эппендорфа. Повторите эту 4x.
  5. Анализ белкового комплекса в ДСН-ПААГ
    1. Возьмем небольшую аликвоту из каждого из пяти фракций (примерно 30 мкл) и добавляют SDS буфера для загрузки. Отварить образцы в течение 5 мин и загрузить образцы бок о бок с белковыми молекулярных маркеров в градиентом (4-15%) SDS-PAGE гель.
    2. После того, как образцы были полностью решены в геле, остановить и электрофореза гель окрашивают с любыми G-250 на основе чувствительных коллоидных методы окрашивания Кумасси, таких как "голубой" серебра окрашивания 13. Окрашивание серебром является обязательным, но не является предпочтительным, поскольку он не полностью совместим с последующим масс-спектрометрического анализа. Хранить остальную часть элюата в -80 ° C морозильник для дальнейшего анализа, таких как масс-спектрометрии для раскрытия молекулярные личности очищенного белкового комплекса. Seэ обсуждение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь мы показываем, наши усилия в выявлении Highwire-взаимодействующих белков в летучей мозга. Highwire (HIW) и его позвоночных и беспозвоночных гомологов огромные убиквитин лигазы, которые регулируют развитие и ремонт нервной системы 14. Они имеют ряд высоко консервативных функциональных областей. Тем не менее, их молекулярные действия не совсем понятно. Работа, проделанная в червя, летать и мышь привело к текущей рабочей модели, которая HIW функционирует как лигазы E3 и как лесов белка, чтобы облегчить фор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод Тандем аффинной очистки (ТАР) предлагает двойной протокол очистки, который позволяет выделение и обогащение белковых комплексов через два независимых стадий очистки близость. Конструкция TAP тега не ограничивается тем, что представлено в данном протоколе, других белковых связывающие домены и мотивы, также применимы, если условия буферные соответствующим образом скорректированы. Хорошим примером других тегов TAP является GS-TAP тег, сочетание белка G и стрептавидин-связывающий мотив, разработанный группой Джулио Su...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим EUROSARF для отправки нам дрожжи TAP плазмиды экспрессии. Мы также благодарны за редакционной помощи Райан Labadens. Эта работа была поддержана грантом NIH / NINDS (R01NS070962) к CW

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стандартное испытательное сито США No 25Fisher Scientific04-881-18
Стандартное испытательное сито США No 40Fisher Scientific04-881-21
  Контес Dounce Тканевые Измельчители 15 млKimble Chase885300-0015
Гефарозные бусины IgGАптека17-0969-01
Эконом-колонна 0,7 см x 20 смBio-Rad737-4721
Эконо-колонна 0,5 см x 15 смBio-Rad737-4716
Кальмодулиновые бусиныСтратаген214303
Coors Ступка и пестикCoorsTek60311
AcTEVInvitrogen12575-015
Коктейль ингибиторов протеазыRoche11836153001
Смесь ингибиторов протеазыSigmaP8340
Смесь ингибиторов протеазы

Ссылки

  1. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  2. Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
  3. Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
  4. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  5. Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
  6. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
  7. Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
  8. Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
  9. Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
  10. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  11. Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
  12. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  13. Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
  14. Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
  15. Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
  16. Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16(2007).
  17. Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
  18. Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
  19. Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
  20. Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643(2012).
  21. Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
  22. Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. Shotgun proteomics in neuroscience. Neuron. 63, 12-26 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Система GAL4/UASочистка иммуноглобулина Gрасщепление TEV-протеазойочистка кальмодулинамасс-спектрометриялизат голов мухультрацентрифугирование
Определение белок-белковых взаимодействие в
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.