Submillisecond конформационные изменения в белках решены фототермического отклонения луча

Краткое содержание

Здесь мы сообщаем применение методики отклонения фототермическая луча в сочетании с в клетке соединения кальция, DM-nitrophen, для отслеживания микросекундные и миллисекундные динамику и энергетику структурных изменений, связанных с ассоциацией кальция в нейронной датчика кальция, Переработка регуляторный элемент антагонистов модулятор .

Аннотация

Отклонение Фототермическая луч вместе с фото-акустической калориметрии и термического решетки принадлежит к семейству фототермических методов, которые контролируют Время-профиля громкости и энтальпии изменения света, индуцированные конформационные изменения в белках на микросекунды до миллисекунды временные рамки, которые не доступны в режиме обычного стоп -потока инструменты. Кроме того, поскольку общий изменения объема и / или энтальпии зондируются, эти методы могут быть применены к белков и других биомакромолекул, которые не имеют флуорофор и этикетку или хромофора. Для мониторинга динамики и энергетику структурных изменений, связанных с Са ^{2 +} привязка к кальция преобразователей, таких нейронных датчиков кальция, в клетке соединения кальция, DM-nitrophen, используется для фото-триггера быстрой (τ <20 мкс) увеличение свободного кальция концентрации и связанное с ним объема и энтальпии зондируются используя технику отклонения фототермическая луча.

Введение

Фототермические методы, такие как фотоакустического калориметрии, прогиб фототермическая пучка (PDB), и переходных решетки в сочетании с наносекундного лазерного возбуждения представляют собой мощную альтернативу переходных оптических спектроскопии для временным разрешением исследований короткоживущих промежуточных ^1,2. В отличие от оптических методов, таких как нестационарного поглощения и ИК-спектроскопии, что наблюдение за временной профиль изменения поглощения в окружающем хромофора; фототермические методы обнаружить временную зависимость изменений тепло / объем и, следовательно, являются ценными инструментами для исследования временных профилей оптиче....

Протокол

1. Примеры Подготовка

1. Провести подготовку образца и все образцы манипуляций в темной комнате, чтобы предотвратить нежелательную uncaging.
2. Растворения DM-nitrophen ((1 - (2-нитро-4 ,5-диметоксифенил) - N, N, N ', N'-тетракис [(окси-карбонил)-метил] -1,2-этандиамин) в 50 мМ HEPES буфер, 100 мМ KCl, рН 7,0 до конечной концентрации 400 мкМ (ε _{350 нм} = 4330 М ^-1 см ^{-1 9).}
3. Добавить CaCl ₂ от маточного раствора 0,1 М для достижения желательного соотношения [Ca ^{2 +]:} [DM-nitrophen]. Для белков с _Уб для Ca ^{2 +} ассоциации более 10 мкм, отношение [Ca

Результаты

Типичный пример PBD следы для Ca ^{2 +} фото-релизе от Ca ^{2 +} DM-nitrophen показано на рисунке 3. Быстрый фаза соответствует фото-расщепления Ca ^{2 +} DM-nitrophen и Ca ^{2 +} освобождения, тогда как медленная фаза отражает Са ^{2 +} привязка к nonphotolysed клетке. Участок из PBD амплитуды выборки для быстрой и медленной фазы масштабированного амплитуде эталонного соединения в виде функции температуры зависело фактора [C _р ρ / (DN / ТД)] коэффициен.......

Обсуждение

Физический принцип фототермических методов является то, что фото-возбужденная молекула рассеивает избыточную энергию через колебательной релаксации в основное состояние, в результате чего теплового нагрева окружающего ^1,12 растворителя. Для растворителей, таких как вода, это производит быстрое расширение объема _{(ΔV-е место).} Возбужденного состояния молекулы могут также вступает в фотохимические процессы, которые приводят к нетепловыми изменения объема (ΔV _nonth) из-за разрыва связи / фор.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1-(4,5-диметокси-2-нитрофенил)-1,2-диаминоэтан-N,N,N',N' -Tetraacetic Acid Life	Technologies	D-6814	DM-nitrophen, соединение кальция в клетке, хранить исходные растворы в темноте для предотвращения фотодиссоциации
4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота, N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N′ -(2-этансульфоновая кислота)	Sigma Adrich	0909C	HEPES буфер
Феррицианид калия (III)	Sigma Aldrich	702587	эталонное соединение для измерений PBD
хромат натрия	Sigma Aldrich	307831	эталонное соединение для измерений PBD
He-ne Laser Diode 5 мВт 635 нм	Edmund Optics	54-179	использование в качестве зондирующего луча для измерений PBD
Осциллограф,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 МГц полоса пропускания
Nd:YAG лазером	Continuum	ML II	для измерений PBD
M355; лазерное зеркало Nd:YAG	Edmund Optics	47-324	лазерное зеркало для лазерной линии 355 нм
M1 и M2; Лазерное диодное зеркало	Edmund Optics	43-532	visilbe лазерное плоское зеркало, диапазон длин волн 300-700 нм
P1 и P2; Ирисовая диафрагма	Edmund Optics	62-649	штифтовое отверстие для формирования зонда и пучков
L1; би-выпуклая линза	Thorlabs	LB1844	линза для фокусировки пучка зонда на детекторе, EFL 50 мм, диапазон длин волн 350-2 000 нм
DM, дихроичное зеркало	Thorlabs	DMLP505	длиннопроходное дихроичное зеркало с длиной волны отсечки 505 нм
F1; Краевой фильтр	Andower	500FH90-25	длинночастотный фильтр с длиной волны среза 500 нм
Терморегулируемый держатель кюветы	Quantum Northwest	FLASH 300

с