Методическая статья

Сотовый Сжатие как Robust, микрофлюидных внутриклеточного Delivery Platform

DOI:

10.3791/50980

⸱

7 ноября 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Быстрое механическая деформация клеток стала перспективный, векторные без метода внутриклеточной доставки макромолекул и наноматериалов. Этот протокол содержит подробные шаги, как использовать систему для широкого спектра приложений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Быстрое механическая деформация клеток стала перспективный, векторные без метода внутриклеточной доставки макромолекул и наноматериалов. Эта технология потенциал показано в решении ранее сложных приложений; включая, доставка в первичных иммунных клеток, перепрограммирования клеток, углеродной нанотрубки, и квантовой поставки точка. Этот вектор свободной Микрожидкостных платформа опирается на механическое разрушение клеточной мембраны, чтобы облегчить доставку цитозольного материала мишени. Здесь мы описываем подробную метод использования для этих микрофлюидных устройств, включая, сборки устройства, клеточного препарата, и работы системы. Этот подход доставка требует краткого оптимизацию типа устройства и условий работы для ранее несообщаемого приложений. Приведенные инструкции распространены на большинстве типов клеток и материалов поставки так как эта система не требует специальных буферов или шаги химическая модификация / сопряжения. Эта работа также обеспечитьсек рекомендации о том, как улучшить производительность устройства и без проблем снимать потенциальные проблемы, связанные к засорению, низкой эффективности доставки и жизнеспособности клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Доставка макромолекул в цитоплазме клеток является важным шагом в лечебных и исследовательских приложений. Наночастиц опосредованной доставки, например, показал потенциал в генной терапии 1,2, в то время как доставка белок является перспективным средством влияя на клеточную функцию как клинические, так и лабораторные 3 4 настройки. Другие материалы, такие как низкомолекулярных препаратов, квантовых точек, или наночастиц золота, представляют интерес в приложениях, начиная от лечения рака 5,6 к внутриклеточной маркировки 7,8, и одной молекулы отслеживания 9.

Клеточной мембраны в значительной степени непроницаемой для макромолекул. Многие существующие методы используют полимерные наночастицы 10,11, липосомы 12 или химические модификации 13 для облегчения мембраны разрушение или эндоцитозного доставку. В этих методах, жизнеспособность эффективность доставки и клетки часто зависят от структуры гое молекула-мишень и тип клеток. Эти методы могут быть эффективными при доставке структурно однородных материалов, таких как нуклеиновые кислоты, но часто плохо подходит для доставки более структурно различных материалов, таких как белки и наноматериалов 14,15 7. Кроме того, разрушение эндосомы механизм, что большинство из этих методов полагаться на зачастую является неэффективным, следовательно оставляя много материала в ловушке пузырьков структур 16. Наконец, методы, которые часто разработанные для использования с установленными клеточных линий не очень хорошо переводятся в первичных клеток.

Способы мембранной порации, такие как электропорации 17,18 и 19 sonoporation, являются привлекательной альтернативой в некоторых применений, однако они, как известно, вызывает низкий уровень жизнеспособности клеток и может быть ограничено расхода материала мишени доставки.

Быстрое механическая деформация клеток, микрофлюидных подход к поставке, недавно demonstrованные свои преимущества по сравнению с современными методами в контексте перепрограммирования клеток 20 и доставки наноматериалов 21. Этот метод основан на механическое разрушение о клеточной мембране, чтобы облегчить доставку цитозольного материалов, присутствующих в окружающей буфера. Система продемонстрировала позволяя потенциал в ранее вызов типов клеток (например, первичные иммунные клетки и стволовые клетки) и материалы (например, антитела и углеродных нанотрубок). При этом общий порядок, чтобы использовать эти устройства для внутриклеточной доставки целевых макромолекул описывается. Процедура распространены на большинстве типов клеток и материалов доставки, однако, рекомендуется, чтобы один проводить кратко оптимизацию условий, как подробно в наших ранее описанной конструкции принципов 20, для любых ранее незарегистрированных приложений. На сегодняшний день, система была успешно использована для доставки РНК, ДНК, наночастиц золота, квантовых точек, углеродных нанотрубок, белкас, а декстран полимеры 20,21.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Хранение

  1. Храните водохранилищ, держатели, уплотнительные кольца и микрожидкостных устройств в 70% этаноле. Используйте контейнер (например, банку или мензурки), который имеет крышку для предотвращения испарения и загрязнения частицами пыли или за пределами. Размещать устройства в одном контейнере (1), резервуары и уплотнительные кольца во втором контейнере (2), и держатели в третьем (3).

Примечание: Использование 70% этанола для хранения является поддержание стерильности. Если только компоненты решения являются этанол и вода (т.е. без денатурирующие агенты), все компоненты системы должны быть полностью совместимы и не будет со временем ухудшаться.

  1. Изменение раствор этанола в контейнерах (2) и (3) перед каждым использованием, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение через экспериментов и минимизации присутствия нежелательных частиц, которые могут вызвать засорение.

2. Эксперимент Подготовка

  1. Место контейнеры (2) и (3) в ультразвуковой ванне FOг 5-10 мин перед каждым использованием. Это помогает удалить любые загрязняющие частицы из предыдущих экспериментов.
  2. Чистый рабочее пространство в шкафу биобезопасности с 70% раствором этанола.
  3. Спрей все материалы (3 контейнеры и пинцеты) с 70% раствором этанола до размещения их внутри шкафа биобезопасности.

3. Сборка

  1. Установите вниз 2-3 низкой вкусненькое салфетки в рабочей зоне.
  2. Снимите пластиковые резервуары от их контейнер с пинцетом и установить их на салфетки, чтобы облегчить испарение раствора этанола из внутренних поверхностей. Аккуратно нажмите резервуаров на поверхности или поток воздуха через них, чтобы облегчить удаление раствора этанола.
  3. Вставьте уплотнительные кольца в их соответствующее гнездо водохранилищ.
  4. Снимите держатель и чипсы из соответствующих контейнеров и позволяют этанол испаряется (~ 1-2 мин).
  5. Используйте пинцет, чтобы поместить требуемый чип лицевой стороной вверх (то есть отверстия для доступа вверх) в держателе. Поднимите держательс чип для eyelevel чтобы убедиться, что чип лежит на плоской поверхности в держателе и при необходимости отрегулировать с помощью пинцета. ВАЖНО: Если устройство не соответствует должным образом в держатель, существует риск, что она сломается во время последующих шагов.
  6. Затем осторожно положите резервуаров на держателе и приведения их в соответствие с клипами. Будьте осторожны, чтобы уплотнительные кольца не выпасть из своих пазов во время этого процесса.
  7. Осторожно надавите на водоемах, пока они не встанут на место. Убедитесь, что обе стороны водохранилищ находятся в безопасности и что чип, кажется, в правильном положении.

4. Подготовка Сотовый

  1. Для прикрепленных клеток (первичные или установленные линии): Пластина клеток 1-2 дня до начала эксперимента таковы, что они являются не более чем на 80% сливной на день эксперимента.
  2. Наведите клеток в суспензии (в ФБР или соответствующего средства массовой информации) и стремиться к операционной концентрации 1,0 × 10 6 клеток / мл до 1,0 х 10 7 челLs / мл. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не наблюдается существенных изменений в производительности поставки из-за концентрации клеток.
  3. Смешайте клетки и желаемой доставки материала в отдельную пробирку для получения желаемой концентрации материала для эксперимента. ВАЖНО: Поскольку описанный способ доставки зависит от диффузии для облегчения доставки, более высокая концентрация материал даст более высокую доставку. Если это возможно, рекомендуется использовать 1 мкМ раствор желаемого материала для начальных испытаний. Эта концентрация может быть титрованию вниз в будущих экспериментов по мере необходимости. Наименьшее отмеченное концентрация использоваться с данным устройством 10 нМ 21.

5. Операция

  1. Внесите смесь клеток и доставки материала в резервуар (текущий дизайн имеет максимальное 150 мкл потенциала). ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство проектов устройств полностью обратимы поэтому направление потока через каналы не имеет значения. Образцы могут быть загружены в любой из двух коллекторов.
  2. Прикрепите трубки давления к заполненное водохранилище и затянуть гайку, чтобы обеспечить надлежащее уплотнение (палец плотно часто бывает достаточно).
  3. Отрегулируйте давление до нужного уровня на регуляторе. Это контролирует скорость, с которой клетки перемещаются через устройство. Обратите внимание, что поток клеток не запускается пока не будет нажата кнопка.

Примечание: В предыдущей работе, азот или сжатый воздух работали одинаково хорошо в качестве газа-носителя.

  1. Поднимите устройство на уровень глаз и ориентировать его так, чтобы жидкость в резервуаре хорошо просматривается. ПРИМЕЧАНИЕ: Отслеживание столба жидкости для отключения системы перед резервуар опорожняется.
  2. Нажмите кнопку для создания давления в резервуар и начать поток клеток.
  3. Когда уровень жидкости составляет примерно 2 мм от дна водоема, быстро превратить регулятор до 0 фунтов на квадратный дюйм, чтобы остановить поток. ВАЖНО: Если не удается остановить поток до резервуар опорожняется, есть риск выброса пробы из Collectioн водохранилища. Также отметим, что если в столбце жидкость не движется с заметной скоростью, или существенно замедлилась по сравнению с его первоначальной скорости потока (например 3x медленнее), установленный устройство, вероятно, забит и его необходимо заменить. Операционная забитый устройство может привести к более высокой клеточной смерти.
  4. Соберите обработанные клетки из соответствующего резервуара и разместить их в нужном коллекция трубки / пластины. ВАЖНО: Не разбавляйте собранные клетки в любых буферов на данном этапе, как же вноситься клетки будут продолжать поглощать материал для до 10 мин 20. После этого окно прошло, развести клетки в нужном СМИ / буфера.
  5. Чтобы собрать больше обработанные клетки или попробовать альтернативные экспериментальные условия, повторите шаги 5,1 - 5,7 по мере необходимости. Напомним, что чипы являются обратимыми, поэтому образцы могут быть установлены в любом пласте. Будьте уверены, чтобы обменять фишки по мере необходимости, если они забивают. Откажитесь забитые устройств.

6. Разборка

  1. Осторожно отсоедините резервуары из главного держателя на расталкивая клип руки.
  2. Поместите каждую часть в соответствующий контейнер для хранения (подробно в разделе 1).
  3. Наведите используемые чипы в отдельной емкости для утилизации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 1 содержит описательную схему микрожидкостных системы доставки. Фигуры 2А-В иллюстрируют типичные результаты лечения HeLa клетки различных конструкций устройств в присутствии флуоресцентно конъюгированного 3 кДа декстрана 20. Если процедура выполняется правильно, производительность системы будет чувствителен к типу устройств и рабочей скорости. Таким образом, следует оптимизировать эти условия для данного приложения перед переходом к более сложных экспериментов. В диа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Некоторые аспекты описанной экспериментальной процедурой (т.е. отличной от микросхем и рабочей скорости факторы), возможно, должны быть оптимизированы в зависимости от типа клеток и доставки материала система применяется. В последующем обсуждении рассматриваются некоторые из наиболее распространенных факторов, чтобы рассмотреть при разработке экспериментов.

Для улучшения доставки сигнала для флуоресцентной меченых соединений, необходимо обратиться источники фоновой флуоресценции. По...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы Армон Sharei, Роберт Лангер, и Klavs Ф. Jensen являются акционерами SQZ биотехнологии компаний, которая производит микрожидкостных устройств, используемых в этой статье.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Т. Шатова за полезные обсуждения экспериментального проектирования и анализа данных. Помощь и экспертиза Г. Паради, личный состав проточной цитометрии ядра на Коха, и сотрудники технической лаборатории микросистем Массачусетского технологического института с благодарностью. Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья грантов RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, и частично Национальный институт рака онкологический центр поддержки (ядро) Гранты Р30-CA14051 и MPP-09Call-Лангер-60.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Держатель устройства и Пластиковый резервуарSQZ BiotechnologiesHolder
LSRFortessa AnalyzerBecton DickinsonN/AПроточная цитометрическая машина, используемая в Koch Institute Core
Facilities Микрофлюидное устройствоSQZ BiotechnologiesCell Squeeze
O-RingsMcMaster9452K311
Система давления для работы аппаратаSQZ BiotechnologiesСистема
Пинцет
Ультразвуковая ванна
давления

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
  2. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
  3. Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
  4. Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  5. Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
  6. Jiang, Z. -X., Zhang, Z. -Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
  7. Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
  8. Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
  9. Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
  10. Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
  12. Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).
  13. Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
  14. Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
  15. Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
  16. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
  17. li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
  18. Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
  19. Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
  20. Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
  21. Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Cell SqueezingMicrofluidic DeliveryIntracellular DeliveryVector Free DeliveryMechanical DisruptionFlow CytometryDevice AssemblyCell PreparationPressure OptimizationClogging Prevention

Похожие статьи