Быстрое механическая деформация клеток стала перспективный, векторные без метода внутриклеточной доставки макромолекул и наноматериалов. Этот протокол содержит подробные шаги, как использовать систему для широкого спектра приложений.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Сотовый Сжатие как Robust, микрофлюидных внутриклеточного Delivery Platform
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Быстрое механическая деформация клеток стала перспективный, векторные без метода внутриклеточной доставки макромолекул и наноматериалов. Эта технология потенциал показано в решении ранее сложных приложений; включая, доставка в первичных иммунных клеток, перепрограммирования клеток, углеродной нанотрубки, и квантовой поставки точка. Этот вектор свободной Микрожидкостных платформа опирается на механическое разрушение клеточной мембраны, чтобы облегчить доставку цитозольного материала мишени. Здесь мы описываем подробную метод использования для этих микрофлюидных устройств, включая, сборки устройства, клеточного препарата, и работы системы. Этот подход доставка требует краткого оптимизацию типа устройства и условий работы для ранее несообщаемого приложений. Приведенные инструкции распространены на большинстве типов клеток и материалов поставки так как эта система не требует специальных буферов или шаги химическая модификация / сопряжения. Эта работа также обеспечитьсек рекомендации о том, как улучшить производительность устройства и без проблем снимать потенциальные проблемы, связанные к засорению, низкой эффективности доставки и жизнеспособности клеток.
Введение
Доставка макромолекул в цитоплазме клеток является важным шагом в лечебных и исследовательских приложений. Наночастиц опосредованной доставки, например, показал потенциал в генной терапии 1,2, в то время как доставка белок является перспективным средством влияя на клеточную функцию как клинические, так и лабораторные 3 4 настройки. Другие материалы, такие как низкомолекулярных препаратов, квантовых точек, или наночастиц золота, представляют интерес в приложениях, начиная от лечения рака 5,6 к внутриклеточной маркировки 7,8, и одной молекулы отслеживания 9.
Клеточной мембраны в значите....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Хранение
- Храните водохранилищ, держатели, уплотнительные кольца и микрожидкостных устройств в 70% этаноле. Используйте контейнер (например, банку или мензурки), который имеет крышку для предотвращения испарения и загрязнения частицами пыли или за пределами. Размещать устройства в одном контейнере (1), резервуары и уплотнительные кольца во втором контейнере (2), и держатели в третьем (3).
Примечание: Использование 70% этанола для хранения является поддержание стерильности. Если только компоненты решения являются этанол и вода (т.е. без денатурирующие агенты), все компоненты системы должны быть полность....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1 содержит описательную схему микрожидкостных системы доставки. Фигуры 2А-В иллюстрируют типичные результаты лечения HeLa клетки различных конструкций устройств в присутствии флуоресцентно конъюгированного 3 кДа декстрана 20. Если процедура выполняется правильно, производительность системы будет чувствителен к типу устройств и рабочей скорости. Таким образом, следует оптимизировать эти условия для данного приложения перед переходом к более сложных экспериментов. В диа.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Некоторые аспекты описанной экспериментальной процедурой (т.е. отличной от микросхем и рабочей скорости факторы), возможно, должны быть оптимизированы в зависимости от типа клеток и доставки материала система применяется. В последующем обсуждении рассматриваются некоторые из наиболее распространенных факторов, чтобы рассмотреть при разработке экспериментов.
Для улучшения доставки сигнала для флуоресцентной меченых соединений, необходимо обратиться источники фоновой флуоресценции. По.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы Армон Sharei, Роберт Лангер, и Klavs Ф. Jensen являются акционерами SQZ биотехнологии компаний, которая производит микрожидкостных устройств, используемых в этой статье.
Благодарности
Мы благодарим Т. Шатова за полезные обсуждения экспериментального проектирования и анализа данных. Помощь и экспертиза Г. Паради, личный состав проточной цитометрии ядра на Коха, и сотрудники технической лаборатории микросистем Массачусетского технологического института с благодарностью. Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья грантов RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, и частично Национальный институт рака онкологический центр поддержки (ядро) Гранты Р30-CA14051 и MPP-09Call-Лангер-60.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Держатель устройства и Пластиковый резервуар | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Проточная цитометрическая машина, используемая в Koch Institute Core |
| Facilities Микрофлюидное устройство | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Система давления для работы аппарата | SQZ Biotechnologies | Система | |
| Пинцет | |||
| Ультразвуковая ванна |
Ссылки
- Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
