Методическая статья

Выделение сотовых липидные капли: Два Методы очистки Начиная с дрожжевых клеток и правам плаценты

DOI:

10.3791/50981

⸱

1 апреля 2014 г.

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Tennessee

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Два метода для выделения капель сотовой липидов от 1) дрожжевые клетки и 2) человека плаценты представлены. Центральное обеих процедур центрифугирования в градиенте плотности, где в результате плавающий слой, содержащий капельки могут быть легко визуализированы на глаз, экстрагировали и количественно с помощью Вестерн-блот-анализа для чистоты.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Липидных капель динамические органеллы, которые можно найти в большинстве эукариотических и некоторых прокариотических клеток. Конструктивно капли состоят из сердцевины нейтральных липидов, окруженных фосфолипидного монослоя. Одним из наиболее полезных методов в определении роли клеточных капель был протеомических идентификация связанные белки, которые могут быть изолированы вместе с капель. Здесь два метода описаны изолировать липидные капли и их связанные белки из двух широких эукариот: дрожжей деления и плацентарные ворсинчатые клеток человека. Хотя оба метода имеют различия, основным методом - градиент плотности центрифугирования - является общим для обоих препаратов. Это показывает широкую применимость представленных методов изоляции капель.

В первом протоколе, дрожжевые клетки преобразуются в сферопластов ферментативным расщеплением их клеточных стенок. Полученные сферопласты то Гентлы лизируют в свободно облегающие гомогенизатора. Ficoll добавляется в лизате, чтобы обеспечить градиент плотности, и полученную смесь центрифугируют в три раза. После первого спина, капли липидов локализованы к белому плавающий слой из центрифужные пробирки вместе с эндоплазматический ретикулум (ER), плазматической мембране и вакуоли. Два последующих спины используются для удаления этих трех других органелл. Результатом является слой, который имеет только капли и связанные белки.

Во второй схеме, плацентарные ворсинчатые клетки выделяют из человеческой плаценты срок ферментативным расщеплением трипсином и ДНКазой I. Клетки гомогенизируют в свободно облегающие гомогенизатора. Низкая скорость и средней скорости центрифугирования шаги используются для удаления неразрушенных клеток, продукты распада клеток, ядер и митохондрий. Сахароза добавляется в гомогенате, чтобы обеспечить градиент плотности и центрифугируют, чтобы отделить липидных капель с другой CELLULAг фракции.

Чистоту липидных капелек в обоих протоколов подтверждена с помощью Вестерн-блот-анализа. Капли фракции из обоих Preps подходят для последующей протеомного и липидомных анализа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Капли Сотовый липидов являются динамическими органеллы, которые служат несколько функций в клетках. Они концентраторы для хранения нейтральных липидов, которые могут быть конвертированы в энергию или используемых для синтеза фосфолипидов. Капли играют центральную роль в физиологических и патологических состояний, включая атеросклероз, ожирение и связанные с метаболическими заболеваниями, а также инфекционные заболевания 1,2. Кроме того, они интригуют источники биодизельного топлива.

Много информации на клеточном роли липидных капель, была получена из протеомного и липидомных анализа капель очищенных от широкомасштабных организмов 3. Эти организмы включили бактерий 4,5, дрожжи 6-11, растения 12,13, нематоды 14, и летит 15,16. Учитывая интерес в роли липидных капелек в метаболических заболеваний человека, капли были также выделены из культивируемых клеток животного иНимал тканей. Культивируемые клеточные линии были включены 3T3-L1 адипоцитах 17, яичника китайского хомячка (CHO) клетки K2 18, человеческие hepatocyes 19,20 и эпителиальные клеточные линии 21. Животных тканей, из которого капли были выделены включали мыши скелетных мышц, печени 22 23 и молочных желез 23. Как упоминалось выше, цель большинстве исследований изоляции капель является выполнение протеомного анализа на связанных факторов и липидомных анализа на нейтральный и фосфолипидов.

Поскольку нейтральные липиды - самая многочисленная составляющая липидных капель - менее плотная, чем большинство других сотовых материалов, изоляция капель традиционно выполняется с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Этот метод является центральным обоих Preps представленных здесь. Предыдущие методы 6,24 объединены и изменены в визуального представления изоляции капель из культивируемых деления дрожжевых клетоки noncultured человеческие клетки получены из плацентарной ткани. Цель состоит в том, чтобы показать широкой применимости этого метода, выбирая два совершенно разных типов клеток в качестве исходных точек для выделения капель. Эта техника должна быть полезной для тех, кто желает, чтобы изолировать капли от большинства организмов.

Протокол 1 описывается изоляция липидных капель с делящихся дрожжей, Schizosaccharomyces РотЬе, который был использован в качестве модели для наблюдения образование капель при эукариотической деления клеток 25. Подающая надежды дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE широко используется в качестве модельного организма для изучения липидного капель биологию. Протокол 1 применим как организмов и различия в подготовке выделены.

Протокол 2 описывается изоляция липидные капли от плацентарных ворсинок клеток, которые в свою очередь полученного из человеческой плаценты срок.Коллекция срочных плаценты дает уникальную возможность безопасно и этично получить 200-250 г легкодоступной ткани человека 26, который содержит значительное количество липидных капель. Это в отличие от большинства изоляции липидов капли работы в высших эукариот, где капельки происходят из культивируемых клеток. В этих исследованиях, жирные кислоты часто добавляют в культуры для содействия синтез нейтральных липидов и, следовательно, роста капель. Это в отличие от работы здесь, где липидные капли образуются при нативных условиях в плацентарной ткани.

В чистоты липида фракций капель определяются с использованием органелл маркерные антитела, с помощью анализа вестерн-блоттинга. Эти два протокола даст липидов капель фракций, которые подходят для последующей протеомного и липидомных анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изоляция липидные капли от (деления) клеток дрожжей

Выделение капель от популярного модельного организма почкующихся дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE почти идентичен следующему протоколу 6. Различия в подготовке отмечены.

1. Растущие клетки дрожжей

  1. Подготовьте СМИ. Объедините 36 г YE5S порошка на литр дН 2 O в стеклянных бутылках или колбы с культурой. Будут необходимы около 2 л массовой информации. Автоклав СМИ при 121 ° С в течение 20 мин. Разрешить СМИ остыть до комнатной температуры. Для S. CEREVISIAE заменить YE5S с YPD.
  2. Поместите 10-20 мл охлажденных YE5S СМИ в колбу культуры на 250 мл, используя стерильные методы. Инокуляции среды с небольшим количеством дрожжевых клеток из чашки с агаром с использованием стерильного деревянную палочку или его эквивалент. Пусть клетки растут до желаемой оптической плотности при 30 ° С Измерьте оптическую плотность придлина волны 595 нм с использованием спектрофотометра.
  3. Положите оставшиеся средства массовой информации в 2.8 л колбах. Используйте не более 1 л СМИ за 2,8 л колбу для обеспечения надлежащего перемешивания в процессе роста клеток в дрожащей инкубатора. Конечный выход влажных клеток должно быть около 10 г, чтобы иметь возможность приобрести достаточно липидные капли для протеомики и липидомных анализа.
  4. Введем клетки от шага 1.2 в 2.8 л колб, каждый из которых 1 л СМИ, которые были подготовлены на стадии 1.1.
  5. Расти клетки к желаемой плотности при 30 ° С
  6. Убедитесь в том, что клетки имеют липидные капли. Резервный 1 мл клеток. Измерение оптической плотности (OD) образца. Добавить 0,1 мл 100 мМ запаса BODIPY 493/503 в этаноле на ОД клеток в образце. Поместите 3 мкл образца между предметное стекло и покровным стеклом. Визуализация под флуоресцентным микроскопом с GFP фильтром (рис. 1А).
  7. Гранул клеток, начиная с шага 1.5 в 4 & #176; C при 3800 мкг в течение 10 мин. Работа в пакетном режиме в зависимости от мощности центрифужных пробирок.
  8. Вылейте СМИ YE5S и промыть клетки с буфером EMM + 600 мм сорбита. Сорбит обеспечивает осмотическое поддержку.
  9. Передача клеток в стерильную 50 мл центрифужную пробирку и осаждения клеток при 4 ° С при 2000 х г в течение 10 мин. Удалить супернатант. Взвесьте влажные клетки. Ресуспендируют клеток в 2 мл (EMM + 600 мМ сорбита) буфера на грамм клеток.

2. Преобразование деления дрожжевых клеток в сферопластов и последующего лизиса

  1. Добавить 5 мг каждая из 1) дрожжи литическую фермента и 2) дрожжи лизиса ферменты из Trichoderma harzianum на грамм влажных клеток, которые были взвешены в шаге 1.9. Для S. CEREVISIAE увеличить эти ферменты с таким же количеством Zymolyase.
  2. Инкубируйте клетки при 30 ° С при осторожном встряхивании при 100 оборотах в минуту в течение 60 мин.
  3. Убедитесь в том, что сферопласты имеют липидный дрoplets. Повторяя шаг 1.6 (рис. 1В).

3. Плотность центрифугирования в градиенте

  1. Гранул сферопластов центрифугированием при 4 ° С при 2000 х г в течение 5 мин.
  2. Осторожно удалите супернатант, используя пластиковую передачи пипетки.
  3. Аккуратно ресуспендирования осаждали сферопластов ледяной 10 мМ Трис-HCl, 600 мМ сорбита и 200 мкМ ЭДТА. Имейте в виду, что сферопласты очень хрупкие.
  4. Гранул сферопластов снова с теми же настройками, как в пункте 3.1. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют Сферопласты с помощью пластиковой пипетки передачи в 12% Ficoll, 10 мМ Трис-HCl, и 200 мкМ EDTA в концентрации 2 мл / г клеток.
  5. Передача ресуспендировали сферопластов в стеклянный гомогенизатор и осторожно гомогенизируют на льду, 20-30 ударов с свободной одежде пестиком в стеклянном гомогенизаторе.
  6. Трансфер лизированных сферопластов в центрифужные пробирки и наложения с таким же В.О.Луме 12% Ficoll, 10 мМ Трис-HCl, и 200 мкМ ЭДТА буфере. Выберите количество центрифужные пробирки использовать таким образом, чтобы каждая трубка составляет около две трети.
  7. Центрифуга при 4 ° С при 100000 х г в течение 1,5 ч в роторе SW28 или его эквивалент. Разрешить ротор к берегу до остановки (ротор замедления = 0).
  8. Аккуратно перенести верхнюю плавающую белый слой (рис. 2а), в котором содержатся капельки, на новый центрифуге трубки (ы), используя либо пипетки или согнутую пипетки Пастера. Добавить достаточный объем 12% Ficoll, 10 мМ Трис-HCl, и 200 мкМ ЭДТА буфер для образца так, что оно заполняет примерно одну треть от центрифужную пробирку.
  9. Добавьте эквивалентный объем 8% Ficoll, 10 мМ Трис-HCl, и 200 мкМ EDTA буфера к верхней части образца (ов) в новой центрифужную пробирку (ов). После добавления этого буфера трубы должна быть около двух третей полных.
  10. Центрифуга при 4 ° С при 100000 х г в течение 1 ч в роторе SW28 или его эквивалент. Разрешить ротор к берегу до остановки (гOTOR замедления = 0).
  11. Аккуратно перенести верхнюю плавающую белый слой (рис. 2б), которое будет содержать капельки, на новый центрифуге трубки (ы), используя либо пипетки или согнутую пипетки Пастера. Добавить 600 мМ сорбита, 8% Ficoll, 10 мМ Трис-HCl, и 200 мкМ ЭДТА буфер для образца так, что оно заполняет примерно одну треть от центрифужную пробирку.
  12. Добавьте эквивалентный объем 250 мМ сорбитол, 10 мМ Трис-HCl, и 200 мкМ ЭДТА в верхней части образца (ов) в новой центрифужную пробирку (ов). После добавления этого буфера трубы должна быть около двух третей полных.
  13. Центрифуга при 4 ° С при 100000 х г в течение 1 ч в роторе SW28 или его эквивалент. Разрешить ротор к берегу до остановки (ротор замедления = 0).
  14. Трансфер топ белый слой (рис. 2, в), который должен содержать только липидные капли и связанные белки, чтобы диализа, и Диализировать O / N в 10 мМ Трис-HCl и 200 мкМ ЭДТА буфере устранить Ficoll.
2. Изоляция липидные капли от плаценты человека ворсинок клеток

Плаценты были собраны от здоровых женщин с одноплодной беременности подвергались плановым кесарево сечение раздел до начала спонтанной родов в срок. Субъекты дали письменное информированное согласие для сбора их плаценты. Сбор, и последующее использование, из плаценты проводили с одобрения из Университета Теннесси и Университета Теннесси Высшей школы медицины в Ноксвилл Institutional Review Board (# 8757B и # 3338, соответственно).

1. Изоляция плацентарных ворсинчатых клетки человека

Часть 1 протокола является модификацией ранее опубликованного протокола по Петров и др. 26.

Подготовьте следующие решения:

  • NaCl (1 л): растворить 9 г NaCl (M 58,4 г / моль) в дН 2 O с получением 1 л раствора. Фильтр стерилизуют (0,2; Мкм мембрана).
  • Сбалансированный солевой раствор 10x Хэнка (10x HBSS) (1 л): 4 г КСl (М 74.5 г / моль); 0,6 г KH 2 PO 4 (М 136,086 г / моль); 80 г NaCl (М 58.44 г / моль); Na 2 HPO 4 (M 141,96 г / моль), 10 г D-глюкозы (M 180,16 г / моль). Растворите каждой из составляющих в дН 2 O, получая 1 л раствора. Фильтр стерилизуют (0,2 мкм мембраны).
  • Фермент пищеварение буфер (0,6 мл): объединить 70 мл 10x HBSS с 3,3 мл 7,5% Na Biscarbonate, 17,5 мл 1 М HEPES, и 266,1 мл дН 2 O; фильтр стерилизуют (0,2 мкм мембрана). Хранить при 4 ° С.
  • ДНКазы I: непосредственно перед использованием, добавить 5 мл стерильной 0,9% NaCl к ампуле ДНКазы. Держать на льду до использования или магазине при температуре -20 ° С.
  1. Подготовка плаценты для вскрытия
    1. Получение человеческой плаценты и процесс как можно ближе к времени доставки насколько это возможно. Использование герметичном сосуде, такие как охладитель для транспортировки через плаценту. Всегда будьте осторожны, когда рукалин человека биологические материалы.
    2. В биологическом капотом безопасности, передать через плаценту в стерильную автоклавируемый контейнер и тщательно мыть кровь из плаценты и мембран с использованием стерильного 0,9% NaCl (физиологический раствор) решение. Откажитесь кровавый физиологический раствор в 1 л стакан как жидких биологических отходов.
    3. Поместите плаценту на стерильной области, с гладкой поверхностью подшипника пуповину вверх. С острыми, тонкой точечных ножницами и пинцетом удалить плодных оболочек и пуповины.
    4. Переверните плаценту над тем, что материнская поверхность (шероховатая поверхность) вверх. Удалить лежащего на базальной пластинки ткани, около 3 мм от поверхности.
  2. Пройдя через плаценту
    1. Проанализируйте один семядолей в то время, избегая хорионический пластину. Сбор ворсинок ткани в 250 мл химический стакан с раствором.
    2. Промыть ткань несколько раз в отдельном химическом стакане с 0,9% NaCl, вращая щипцами, с использованием 1 л лабораторный стакан для жидких отходов.
    3. Трансфер один семядолей в то время, к 150 мм чашки Петри. Держите щипцами и очистить ткань с лезвием бритвы с судов на чашку Петри. Поместите Царапины ткани в отдельном стакане, содержащем 0,9% NaCl. Повторите эти действия для всех тканей штук.
    4. Трансфер небольшую часть ткани в клеточной диссоциации сито и промыть 0,9% раствором NaCl широко пока элюат не станет ясно. Повторите эти действия для всех тканей.
    5. После промывки Царапины ткани в клеточной диссоциации сито, слить его лишней жидкости и веса.
      В этой точке ткань может храниться O / N в стерильной колбе Эрленмейера при 4 ° С в DMEM.
  3. Переваривание ферментом плацентарной ткани
    1. Подготовьте ткани пищеварения смесь: 100 мл предварительно нагретого буфера для разведения фермента, 1 мл ДНКазы I и 20 мл 2,5% 10x трипсина.
    2. Разделите ткани, передавая 60 г от общего собранной ткани (обычно около 250-300 г) в 500 мл стерильной колбе Эрленмейера.
    3. Добавьте ткани обрабатываемой смеси в колбу Эрленмейера, содержащую ткани, и инкубируют при 37 ° С в шейкере в течение 45 мин при 150 оборотах в минуту.
  4. Сбор разложенных клетки
    1. После первого 45 мин диссоциации, установите пищеварения колбы при наклоне до ткань не оседает.
    2. Сбор супернатант, стараясь не собирать недиссоциированного ткани. Добавить равное количество HBSS в собранной супернатанта и передавать в стерильные 15 мл центрифужные пробирки. Для дополнительными порциями недиссоциированной ткани, повторите процедуру, начиная с шага 3.2 с недиссоциированной ткани.
    3. Центрифуга гомогената при 4 ° С при 1000 х г в течение 15 мин.
    4. Для каждой партии, после центрифугирования, аспирации супернатант, не нарушая гранул. Плацентарный ворсинчатые клетки преимущественно в белом части гранулы, перекрывающих эритроциты.
    5. Перенесите ворсинчатых клетки (белые части гранул) к улerile 50 мл коническую центрифужную пробирку и держать на льду.
    6. После сбора клеток из всех трех этапов пищеварения, Суспензию фильтруют с использованием 100 мкм фильтр Nylon клеток, вставленный в верхней части стерильной 50 мл коническую центрифужную пробирку. Если фильтрация суспензии клеток замедляется, поднять вверх на фильтре обратить вакуум внутри трубки.
    7. Центрифуга при 4 ° С при 1000 х г в течение 10 мин. Осторожно снимите супернатант, не нарушая гранул.

2. Гомогенизация плацентарных ворсинчатых клетки

  1. Перед началом процесса изоляции, готовят 50 мл гипотонического лизиса среды (HLM), содержащей 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4 и 1 мМ ЭДТА. Добавить ингибиторы протеазы в СВУ непосредственно перед использованием и держите среду на льду.
  2. В биологическом капотом безопасности, добавить 4-кратного объема осадка клеток ледяной СВУ к клеткам. Аккуратно и тщательно ресуспендирования клеток с помощью пипетки клетки вверхD-вниз с помощью 10 мл пипетки.
  3. Инкубируют суспендированных клеток на льду в течение 10 мин.
  4. Передача клеток в гомогенизаторе Даунса, который должен быть на льду. Медленно гомогенизации клеток путем применения 20-25 нежные удары с свободно облегающие пестиком гомогенизатора.
  5. Центрифуга клеточный лизат при 4 ° С при 3000 х г в течение 10 мин, чтобы удалить неразрушенные клетки, клеточного дебриса и ядер.
  6. Сбор супернатант и трансфер в SW28 трубки (или альтернативы, которые могут быть центрифугировали при 25000 х г). Центрифуга при 4 ° С при 25000 мкг в течение 20 мин для устранения митохондрии.

3. Изоляция липидные капли ультрацентрифугированием

  1. Подготовка 50 мл 100 мМ карбоната натрия (M 106 г / моль) буфер (рН 11,5) и 50 мл 60% сахарозы (вес / вес) раствора. Добавить ингибиторы протеазы в натриево-карбонатном буфере непосредственно перед использованием и хранить на льду.
  2. Сбор супернатант с шага 2.6 в 50 мл трубки центрифуги, отрегулируйтедо 20% сахарозы и передачи в нижней части ультрацентрифужную пробирку для роторе SW28, или его эквивалент. Наложение плотность регулировать супернатант с ~ 10 мл охлажденного льдом буфера 100 мМ карбоната натрия (рН 11,5) и 0,5-1 мл охлажденного льдом HLM, чтобы заполнить трубки.
  3. Центрифуга при 4 ° С в 130000 х г в течение 45 мин с использованием SW28 Бакет ротор. Разрешить ротор к берегу до остановки (ротор замедления = 0).
  4. Сбор плавающий слой, регулировать до 10% сахарозы и передачи в нижней части 13,2 мл ультрацентрифужную пробирку на роторе SW41Ti, или его эквивалент. Наложение плотность надосадочной жидкости регулируется с примерно 5 мл охлажденного льдом буфера 100 мМ карбоната натрия (рН 11,5) и 0,5 мл охлажденного льдом СВУ.
  5. Центрифуга при 4 ° С в 274 000 мкг в течение 60 мин с использованием SW41Ti размахивая ротор ведро. Разрешить ротор к берегу до остановки (ротор замедления = 0), чтобы минимизировать разрушение липидной капли слоя.
  6. Осторожно собрать верхний плавающий слой (рис. 2D), содержащийлипидные капли с пипеткой 1 мл и повторите шаг 3.4.
  7. Центрифуга при 4 ° С в 274 000 мкг в течение 30 мин с использованием SW41Ti размахивая ротор ведро. Разрешить ротор к берегу до остановки (ротор замедления = 0).
  8. Осторожно собрать верхнюю белого цвета с плавающей слой, содержащий липидов капли с изогнутой пипетки Пастера в трех 1,5 мл пробирки, содержащие 100 мкл СВУ.

Капли Характеризуя липидной фракции (протоколы 1 и 2)

Восстановление и чистота липидов капельной фракции может быть проверена путем вестерн-блота в сочетании с световой или электронной микроскопии. Кроме того, аликвоты после различных стадий центрифугирования могут быть собраны и сохранены для определения эффективности очистки. В Западной блоттинга, это более уместно сравнить объем липидной капельной фракции, которая представляет собой эквивалент всей клеточного лизата, чем сравнение липидные капли в другие мембранных фракций по т.он основа общего содержания белка 24.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Если градиент плотности центрифугирования работало как ожидалось, плавающий слой должен содержать липидные капли и быть исчерпаны других органелл всей прогрессии спинов высокоскоростных.

Для протокола 1, западные Кляксы проводились с маркеров антител к липидных капель (Erg6p), и органелл, которые были найдены, чтобы взаимодействовать с липидные капли в дрожжах, ER (Dpm1p), митохондрии (Por1p), плазматическая мембрана (Pma1p) и вакуоли (Vma1p).

Равные объемы плава...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги в рамках этого протокола

Убедитесь, чтобы быть совместимыми с сред и плотности клеток в процессе роста культивируемых клеток. Клеточные капли липидов являются уникальными в том, что их соответствующие белки сильно зависит от среды, в которой клетки культивируют 17. Таким образом, средства массовой информации, в которых выращиваются клетки и плотность клеток следует тщательно контролировать до лизиса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Американская Ассоциация Сердца награждения 13SDG14500046 к PD, устойчивое энергетическое образования и исследовательского центра Award (Университет Теннесси) с БП, и Врачей медицинского образования и исследований Фонда (Университет Теннесси) награда JM The Авторы выражают благодарность Caroline Leplante (Йельский университет) для протокола для преобразования деления дрожжей сферопластов; Эрик Т. Boder (Университет Теннесси) за использование дрожащими инкубаторов, настольной центрифуге и аналитического оборудования иммуноблота; и Центр Экологическая биотехнология (Университет Теннесси) для использования их ультра-центрифуги; Гюнтер Даум для дрожжевых антител (Грац ун-т технологии, Австрия.); личный состав кафедры акушерства и гинекологии (Университет Теннесси Medical Center) для оказания технической помощи .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Protocol 1
1. Выращивание дрожжевых клеток и превращение в сферопласты
Эдинбургская минимальная среда (EMM)Sunrise Science Products2005
Экстракт дрожжей с 5 добавками (YE5S)Sunrise Science Products2011YE5S среда с 225 мг/мл каждой добавки: аденини, гистидин, лейцин, лизин, урацил. Эквивалентом для почковающихся дрожжей будет YPD.
Порошок YPDSunrise Science Products1875Для S. cerevisiae
SorbitolFisher ScientificBP439
Дрожжевой литический ферментMP Biomedicals215352610
лизирующие ферменты из Trichoderma harzianumSigma-AldrichL1412
Zymolayse-20TSunrise Science ProductsN0766391Для S. cerevisiae
BODIPY 493/503InvitrogenD-3922
Предметные стекла для микроскопаFisher Scientific12-544-7
Крышка для микроскопаСтекло Fisher Scientific12-542-B
Пластиковая переводная пипеткаFisher Scientific137115AM
1 л стеклянная бутылка
Колба
2,8 л колба
<прочная>2. Выделение липидных капель дрожжей
Трис-HClFisher ScientificBP153
EDTAFisher ScientificBP120
Ficoll 400Fisher ScientificBP525
12-14k Spectra/Por диализная мембранаSpectrumLabs132680
Коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТАRoche Diagnostics11873580001раздражающий
гомогенизатор Dounce Sigma-AldrichD9938
25 мм x 89 мм (для SW28)Beckman-Coulter355642
12-14k Мембрана для диализаSpectrumLabs132680
Шейкер с регулируемой температуройBrunswick ScientificC25KC
Thermo Sorvall Legend XTR центрифугаThermo-Scientific75004521
Ротор центрифуги с качающимся ковшомThermo-Scientific75003607
Fiberlite* F15-6x100Y Ротор с фиксированным угломнаклона Thermo-Scientific75003698
Ультрацентрифуга LB-MBeckman-Coulter
SW28 Ротор ультрацентрифугиBeckman-Coulter342204
Протокол 2
<сильный>1. Выделение ворсинчатых клеток плаценты
Одноразовые пеленкиFisher Scientific23666062
Автоклавируемая сковорода (контейнер), 3 лFisher Scientific1336110
Тонкие ножницы, острые-острые, прямыеFine Science Tools1406011
London ЩипцыFine Science Tools1108002
Dumont #7b щипцыТонкие научные инструменты1127020
бритвенные лезвияFisher ScientificS65921
Экранная чашка для CD-1Fisher ScientificS1145
40 меш ситоFisher ScientificS0770
Красители для клеток Fisherbrand 100 μ mFisher Scientific22363549
150 мм ЧашкиПетри Fisher ScientificNC9054771
NaClFisher ScientificS642
KClFisher ScientificP333
KH2PO4Fisher ScientificP386
Na2HPO 4Fisher ScientificS374
D-глюкозаFisher ScientificD16
HEPESFisher ScientificBP310
2,5% трипсин 10xИнвитроген15090046
ДНКаза I степени II, из поджелудочной железы крупного рогатого скотаRoche Applied Science10104159001
растворбикарбоната натрияSigma-AldrichS8761
500 мл колбы
250 мл Стаканы
15 мл Центрифужные пробирки
10 мл Серологические пипетки
50 мл Центрифужные пробирки
DMEMInvitrogen11965084
<сильный>2. Выделение липидных капель из ворсинчатых плацентарных клеток
Трис-HClFisher ScientificBP153
EDTAFisher ScientificBP120
D-сахарозыFisher ScientificBP220
Sodium Carbonate Fisher ScientificBP357
Коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТАRoche Diagnostics11873580001раздражающим
гомогенизатором Dounce Sigma-AldrichD9938
Ультрацентрифужные пробирки 25 мм x 89 мм (для SW28)Beckman-Coulter355642
Ультрапрозрачные центрифужные пробирки 14 мм x 89 мм (для SW41)Beckman-Coulter344059
Одноразовые боросиликатные стеклянные пипеткиПастера FisherScientific 1367820C
Биологическая защитная капюшон Thermo-Scientific
Водяная баняFisher Scientific
Шейкер с регулируемой температуройНью-Брансуик ScientificC25KC
Thermo Sorvall Legend XTR центрифугаThermo-Scientific75004521
Качающееся ведро Ротор центрифугиThermo-Scientific75003607
ультрацентрифуга LB-MBeckman-Coulter
342204
SW41 Ti Ротор ультрацентрифугиBeckman-Coulter331336
Western blot
IRDye 680 Goat Anti-rabbit IgGLI-COR926-68071разведение 1:15,000
IRDye 800CW Коза Anti-Mouse IgGLI-COR926-32210разведение 1:5,000
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris гелиInvitrogenNP0341
Первичные антитела для протокола 1
Erg6pподарок от доктора Г. ДаумаГрацского технологического университета, Австрияразведение 1:5,000
Dpm1pAbcamab1136864 μ г/мл
Por1pв подарок от д-ра Г.Даума Грацского технологического университета, Австрияразведение 1:5,000
Pma1pподарок от д-ра Г.Даума Грацского технологического университета, Австрияразведение 1:10,000
Vma1p (анти-ATP6V1A)Abcamab1137450.5 μ g/ml
Primary антитела к Протоколу 2
Perilipin 2 (anti-ADFP)Abcamab523552 μ г/мл
CalnexinCell Signaling Technology2679разведение 1:1,000
GM130Biorbytorb40533разведение 1:25
COX IVCell Signaling Technology4850разведение 1:1,000
MEK1Biorbytorb38775разведение 1:50
250 млПробирки для ультрацентрифуги New Эрленмейера Ротор ультрацентрифуги SW28 Ротор ультрацентрифуги Beckman-Coulter

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
  2. Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
  3. Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
  4. Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
  5. Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
  6. Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
  7. Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
  8. Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
  9. Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
  10. Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
  11. Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
  12. Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
  13. Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
  14. Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
  15. Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
  16. Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
  17. Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
  18. Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
  19. Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
  20. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
  21. Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
  22. Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
  23. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
  24. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
  25. Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
  26. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
  27. Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
  28. Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
  29. Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
  30. Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
  31. Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
  32. Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
  33. Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
  34. Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
  35. Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
  36. Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
  37. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Lipid Droplet IsolationDensity Gradient CentrifugationYeast SpheroplastsPlacental Villus CellsFicoll GradientSucrose GradientWestern Blot AnalysisFluorescence MicroscopyProteomic AnalysisLipidomic Analysis

Похожие статьи