Внутримямфотовая инъекция узлов биоразлагаемых полимерных частиц

Лимфатические узлы (LNs) являются командных центров иммунной системы. На этом иммунологическом участке антиген, представляя клетки, премьер наивные лимфоциты против конкретных иностранных антигенов для активации клеточных и гуморальных иммунных реакций. Таким образом, ЛП стали привлекательной мишенью для доставки вакцин и иммунотерапии. К сожалению, большинство стратегий вакцины приводят к неэффективной, преходящей доставке антигена и адъювантов в лимфоидную^{ткань 1.} Таким образом, подходы, направленные на улучшение ориентации и удержания компонентов вакцины в ЛП, могут оказать значительное воздействие на эффективность и дей силу новых вакцин.

Одной из стратегий для обхода проблемы LN ориентации, которая продемонстрировала большой интерес к новым клиническим испытаниям является прямой,внутри-LN (i.LN.)^{инъекции 2-4}. В этих испытаниях использовались ультразвуковые рекомендации для доставки вакцин в LNs в качестве простой амбулаторной процедуры. По сравнению с традиционными периферийных маршрутов инъекций, этот подход привел к значительной дозы щадящей и повышение эффективности в терапевтических контекстах,^{включая аллергию и рак 2-4}. В этих исследованиях использовалась инъекция растворимых вакцин (т.е. без биоматериала), которые были быстро очищены лимфатическим дренажем. Таким образом, несколько инъекций или циклов нескольких инъекций были введены для достижения этих впечатляющих терапевтических эффектов. Улучшение удержания в ЛН может повысить взаимодействие между антигеном и / или адъювантных и иммунных клеток, дальнейшее улучшение потенции иммунных клеток грунтовки. Этот потенциал подтверждается недавними исследованиями, которые показывают, кинетика антигена и адъювантных доставки играют решающую роль в определении конкретного иммунного^{ответа генерируется 5-7}. Кроме того, локализация и минимизация доз лекарств и вакцин может уменьшить или устранить системные последствия, такие как хроническое воспаление.

Биоматериалы были изучены широко для повышения потенции и эффективности вакцин^1,8,9. Инкапсуляция или асорпция на носителях биоматериала может физически оградить груз от деградации и преодолеть ограничения на слугот. Еще одной примечательной особенностью носителей биоматериала, таких как полимерные микро- или наночастицы, является возможность совместной загрузки нескольких классов грузов и, впоследствии, высвобождения этих грузов через контролируемые промежутки времени. Однако значительным ограничением, которое по-прежнему препятствует биоматериальным вакцинам и иммунотерапии in vivo, является неэффективная ориентация на иммунные клетки и ограниченный оборот лимфатических узлов. Например, периферические инъекции биоматериальных вакцин по обычным маршрутам(например, внутридермальные, внутримышечные), как правило, демонстрируют плохое таргетирование ЛН, при этом до 99% инъекционного материала остается в месте^{инъекции 4,10}. Совсем недавно, размер носителей биоматериалной вакцины был настроен для улучшения преференциального оборота или дренажа этих вакцин в LNs через^{интерстициальный поток 8,10}. Эти достижения привели к усилению клеточной и гуморальной иммунной реакции, подчеркивая важность ориентации и разработки среды ЛН для новых вакцин.

В настоящем документе представлен протокол вакцинации, который сочетает в себе липидно-стабилизированные частицы полимера и i.LN. доставки для создания контролируемых^{складов вакцины релиз 5,11}. Опираясь на последние исследования с использованием хирургических методов для i.LN. у^{мышей 6,7,12,13}, мы разработали быструю, нехирургическую стратегию для инъекций биоматериалов вакцин у мелких^{животных 5}. Сочетание i.LN. доставки с носителями биоматериалной вакцины мощно расширенный CD8 Т-клеток ответ в течение 7 дней после одной инъекции контролируемых депо вакцины^{релиз 5}. Также был получен сильныйюмористический ответ (т.е. титеры антител); оба усовершенствования были связаны с увеличением удержания компонентов вакцины в лимфатических узлах, которые были опосредовано контролируемым высвобождением из носителей биоматериала. Интересно, что размер частиц вакцины изменил судьбу этих материалов один раз в LNs: наномасштабные частицы показали повышенное прямое поглощение клетками, в то время как более крупные микрочастицы оставались во внеклеточной среде LN и выпустили груз (например, адъювант), который был взят на себя LN-резидентов антигена^{представления клеток 5}. Эти данные свидетельствуют о двух путях, которые могут быть использованы для новых вакцин, контролируя размер биоматериалов, введенных i.LN.

В этой статье биоразлагаемые липидно-стабилизированные полимерные частицы (микро- и наномасштабные) синтезируются с использованием модифицированной стратегии^{двойной эмульсии 5,11}. Свойства частиц характеризуются лазерной дифракцией и микроскопией. Эти частицы затем вводятся непосредственно в паховой LNs определены нехирургически с помощью общего, нетоксического красителя^{трассировщика 14}. Постинкурсный анализ LNs с помощью гистологии или цитометрии потока может быть использован для проверки распределения частиц в среде LN, а также для мониторинга клеточного поглощения и удержания частиц с течением времени. Для протоколов с подробным описанием гистологической обработки и цитометрии потока читатели ссылаются на последние статьи JoVE и^{журнальные отчеты 15-22}. Типичные результаты демонстрируют локальные LN ориентации этих складов, которые могут быть использованы для достижения мощных, эффективных иммунных реакций или адаптировать иммунитет для целевых патогенов.

Все исследования на животных в этом протоколе были завершены в соответствии с федеральными, государственными и местными руководящими принципами, а также с использованием протоколов, рассмотренных и утвержденных Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Университета Мэриленда (IACUC).

1. Синтез липидно-стабилизированных микро- и наночастиц

1. В 7 мл стеклянного флакона (ы), объединить DOPC, DSPE-PEG, и DOTAP липидов в 60:20:20 молярное соотношение для подготовки мастер липидной смеси.
   1. Для синтеза одного образца: Передача 242,9 мл, 287,4 мл и 71,9 мл, DOPC, DSPE-PEG и DOTAP соответственно, во флакон с использованием 2 мл стеклянных серологических пипеток.
   2. Для синтеза нескольких образцов: Умножьте каждый липидный объем выше на количество образцов и объединить в один флакон, а затем передать равные aliquots этой липидной смеси во флаконы, соответствующие каждому образцу, которые будут подготовлены.
   3. Сухие липиды под нежным потоком азотного газа в течение 10 минут, или поместить в вакуумную печь на ночь.
2. В одном, пустом 20 мл стеклянного флакона растворяйте 80 мг PLGA в 5 мл дихлорметана для каждого образца частицы для генерации раствора полимерного бульона 16 мг/мл.
3. Добавьте 5 мл полимерного раствора во флакон (ы), содержащий сушеные липиды, крышку и вихрь в течение 30 сек.
4. Для синтеза микрочастиц:
   1. Начните sonicating органической фазы, содержащей полимер, липиды и другие водорастворимые грузы на льду при 12 Вт с помощью sonicator.
   2. Создайте эмульсию воды в масле (w/o), используя пипетку, чтобы добавить 500 мкл дистиллированной H₂O, или H₂O, содержащей 1 мг пептида, белка или другого водорастворимого груза.
   3. Продолжить sonicating в течение 30 сек на 12 Вт на льду, мягко качая флакон вверх и вниз и из стороны в сторону вокруг sonicator отзыв для обеспечения полной эмульсификации.
   4. Создайте эмульсию воды в масле (w/o/w), наливая эмульсию w/o в 40 мл H₂O в стакане 150 мл.
   5. Гомогенизировать в течение 3 минут при 16000 об/мин с помощью цифрового гомогенизатора.
   6. Добавить магнитный бар перемешать, передать стакан на тарелку перемешать, и позволяют w/o/w эмульсии перемешать на ночь, чтобы удалить избыток растворителя.
5. Для синтеза наночастиц:
   1. Начните sonicating органической фазы, содержащей полимер, липиды и другие водорастворимые грузы на льду при 14 Вт.
   2. Создайте эмульсию w/o, используя пипетку, чтобы добавить 500 мкл дистиллированного H₂O, или H₂O, содержащего 1 мг пептида, белка или другого водорастворимого груза.
   3. Продолжить sonicating в течение 30 сек на 14 Вт на льду.
   4. Создайте эмульсию w/o/w, наливая эмульсию w/o до 40 мл H₂O в стакане 150 мл и соникируя в течение 5 минут при 16 Вт на льду. Аккуратно рок флакон вверх и вниз и из стороны в сторону вокруг sonicator отзыв для обеспечения полной эмульсификации.
   5. Добавить магнитный бар перемешать, передать колбу на пластину перемешать и позволить w/o/w эмульсии перемешать на ночь, чтобы удалить избыток растворителя.
6. На следующее утро мыть и собирать частицы:
   1. Налейте эмульсию через 40 мкм нейлоновой сетки клетки ситечко в 50 мл конической трубки.
   2. Частицы центрифуги в течение 5 мин при 5000 х г для микрочастиц или 5 мин при 24 000 х г для наночастиц.
   3. Декант супернатант и мыть частицы путем повторного перерасхода в 1 мл H₂O.
   4. Перенесите подвесные частицы в трубку микроцентрифуга 1,5 мл.
   5. Центрифуга в течение 5 мин при 5000 х г для микрочастиц или 5 мин при 24500 х г для наночастиц.
   6. Вымойте частицы в два раза больше, удалив супернатант, повторное затухание в 1 мл H₂O, и центрифугирование, как в шаге 1.6.5. После мытья приостанавливайте частицы в 1 мл H₂O для немедленного использования или лиофилизируйте для длительного хранения.

2. Измерение урожайности синтеза

1. Предварительно пустой 20 мл стеклянного флакона. Добавьте 100 мкл суспензии частиц к предварительно выпивному флакону после того, как труба вверх и вниз с помощью микропипетта перемешать.
2. Лиофилизируют частицы или высыхают под нежным потоком азота.
3. Взвесь флакон, содержащий сушеный полимер. Определите выход частицы во флаконе, вычитая первоначальный вес флакона из массы флакона, содержащего высушенные частицы.
4. Определите общий выход частиц путем умножения массы частиц во флаконе фактором разбавления. Чтобы определить процентную урожайность, разделите массу частиц на максимальную теоретическую входную массу и умножьте на 100%.

3. Определение размера частицы

1. Очистите поставляемую стеклянную фракционные ячейки в стиле кюветта, заполнив деионизированной водой и вытирая тампоном с ватным наконечником. Перенесите 10 мл дистиллированной H₂O в очищенную фракционной ячейку, добавьте магнитный микро-бар и загрузите фракционные клетки в клеточное крепление анализатора размера частицы.
2. Отрегулируйте скорость магнитного перемешивания в анализаторе частиц для достижения полного смешивания в фракционо-клеточной клетке и закройте дверь отсека.
3. Выровняйте лазеры к фракционо-ми камере с помощью программного интерфейса инструмента.
4. Используйте интерфейс программного обеспечения инструмента для записи базового чтения с фракционные ячейки, содержащие только дистиллированной H₂O.
5. Pipette оригинальные частицы подвески вверх и вниз с микропайптью, чтобы смешать.
6. Пипетт 10 мкл суспензии частиц (обычно примерно 0,5 мг) в дробную клетку. Убедитесь, что объем образца частиц, добавленных в ячейку, достаточен для генерации силы сигнала в соответствующем диапазоне, как указано на программном интерфейсе прибора. Фактическая масса требуемых частиц зависит от процентной урожайности и оптических свойств образца частицы.
7. Закройте дверь отсека анализатора размера частиц и измерьте размер частицы с помощью рефракционного индекса 1.60 для PLGA.
8. Используйте программный интерфейс для расчета диаметра частиц на основе числа.

4. Визуализация частиц

1. Пипетка частицы подвески вверх и вниз с micropipette смешивать. Разбавить суспензию частиц до 1 мг/мл в деионизированной воде.
2. Подготовьте слайд микроскопа, добавив 3 мкл разбавленной суспензии частиц и монтажа крышки под углом 45 ", чтобы избежать образования пузыря. Поместите слайд на сцену микроскопа и изображение с помощью соответствующих наборов фильтров для каждого флуоресцентного груза.

5. Подготовка мышей для i.LN. инъекция

1. Подготовка раствора для красителя трассировщика:
   1. Приготовьте 0,1% (ж/в) раствор трассера красителя путем растворения 10 мг порошка красителя с 10 мл дистиллированной H2O.
   2. Стерилизовать раствор красителя в стеклянный флакон с помощью фильтра шприца 0,2 мкм.
2. За день до инъекции, анестезировать мышь с помощью изофлурана в соответствии с IACUC утвержденных животных протокола. Для оценки глубины анестезии, выполнить тест на рефлекторный протязить ногой и контролировать частоту дыхания, чтобы обеспечить частоту дыхания около 100-140 вдохов в минуту.
3. Бритье волос у основания хвоста и задней части с помощью клиперов в то время как мышь анестезируется. Удалите волосы с брюшной стороны животного и боковой вокруг спинной стороны чуть выше сустава задней ноги (бедра).
4. Инъекционный следоитр краситель.
   1. Для каждой инъекции красителя используйте микропипюту для переноса 10 мкл раствора красителя в микроцентрифугную трубку и аспирировать все 10 мкл в иглу 31G, прикрепленную к шприцу 1 мл.
   2. Ввись 10 мкл раствора красителя подкожно с каждой стороны хвостовой базы, где волосы были обрезаны, перезарядки между инъекциями.
5. Удалите оставшиеся волосы, применяя мягкий крем для депиляатора с помощью ватных тампонов. Обязательно покрыть область между задним бедром и животом.
6. Разрешить депиляативный крем инкубировать на коже в течение 3 мин. После инкубации, мокрая рука в перчатках с теплым H₂O и осторожно руб депиляции крем в кожу.
7. Немедленно удалите крем для депиляния, смачивая руку в перчатках с теплой H₂O и потирая хвост базы и заднего. Повторяйте до тех пор, пока избыток депилятора удаляется, убедившись, что держать руку мокрой, чтобы избежать раздражения.
8. Удалите остаточное депилятуру с мыши, смачивая мягкую ткань или бумажное полотенце теплым H₂O и одним движением вытирая нижнюю часть мыши. Избегайте движения трения, чтобы предотвратить ссадины или повреждения кожи мыши.
9. Разрешить мыши, чтобы восстановить под тепловой лампой и вернуться к проведению.

6. i.LN. Инъекция частиц

1. На следующий день, анестезировать мышь с помощью изофлурана в соответствии с IACUC утвержденных животных протокола.
2. Изучите мышь, чтобы подтвердить дренаж красителя трассировщика в каждый паховой лимфатический узел. Лимфатический узел должен быть виден как темное пятно возле заднего бедра и живота.
3. Подготовка раствора для инъекций частиц:
   1. Частицы resuspend в дистиллированной H₂O при желаемой концентрации инъекций. Для каждой инъекции используйте микропипюту для переноса 10 мкл раствора частиц в микроцентрифугную трубку.
   2. Аспирировать все 10 мкл в 31G инсулин иглы прилагается к 1 мл шприца.
4. Доза инъекционных частиц:
   1. После визуализации LN, затянуть кожу вокруг LN с помощью большого пальца, указательного пальца и среднего пальца, чтобы вытащить насмешки кожи и позволяют контролируемое размещение объема инъекций.
   2. Подойди к ЛН с помощью иглы под углом 90 градусов к коже и проникнете в кожу над окрашенным ЛН на глубину 1 мм.
   3. Медленно введать весь объем. Во время инъекции, наблюдать объем LN через кожу, чтобы подтвердить инъекцию видимым увеличением LN.
5. Позвольте мыши восстановиться под тепловой лампой и вернуться к удерживаю или провести дополнительное тестирование.

Для соответствующих методов анализа(например, гистология, цитометрия потока) см. статьи 265, 1743 и 3054 и текущие протоколы в иммунологии, главы 5 и 21^15-22.

Ожидаемые результаты протоколов, представленных в этой рукописи, можно разделить на три категории: синтез частиц, подготовка животных и инъекция частиц.

На рисунке 1 изображен синтез и характеристика биоразлагаемых полимерных частиц, стабилизированных амфифилическими липидами. Результаты протокола синтеза эмульсии/растворителя испарения(рисунок 1A) могутбыть качественно оценены путем визуального осмотра полученных окончательных эмульсий; партии частиц должны быть однородными, стабильными эмульгации с непрозрачным внешним видом. Осложнения включают эмульсии, что крем или flocculate, часто из-за неправильного хранения липидных стабилизаторов. Чтобы избежать этой нестабильности, липиды должны храниться при -80 градусов по Цельсию в обезвоженном состоянии или в герметичном флаконе, очищенном азотом. Количественная оценка синтеза частиц может быть выполнена с помощью лазерной дифракции или динамического рассеяния света для анализа распределения размеров(рисунок 1B). Ожидаемые результаты включают плотно распределенные, мономодальные размеры частиц, что указывает на единую популяцию частиц. Параметры синтеза, описанные в этой рукописи, генерируют среднее число дистрибутивов, сосредоточенное примерно на 100 нм или 3 мкм для наночастиц и микрочастиц, соответственно. Дальнейшая качественная оценка синтеза частиц может быть достигнута путем изменения вышеуказанного протокола для включения нескольких классов флуоресцентных грузов. На рисунке 1С,микроскопические изображения микрочастиц, загруженных флуоресцентным пептидом (FITC, зеленый), липофилиновый краситель (DiD, красный) и изображение наложения (желтый) подтверждают создание частиц в пределах желаемого диапазона размеров и инкапсуляцию пептида в объеме частицы.

Первые две группы рисунка 2 подводят итоги ожидаемой подготовки животных к стратегии инъекций i.LN., описанной в настоящем документе. Методология включает в себя маркировку паховых LNs периферической инъекции нетоксического трассировщика для определения местоположения для последующего инъекции частиц i.LN. (рисунок 2A)5. Как отмечается, дренаж трассировщика красителя после подкожной инъекции на хвостовой базе позволит визуализировать паховойLNs (рисунок 2B)5. Прием одобренных кремов для депиляции может представлять опасность для мышей. Таким образом, следует позаботиться о том, чтобы тщательно удалить все кремы, применяемые, уделяя особое внимание лапам и брюшной стороне мышей. Депилятура должна быть удалена с помощью мокрой, мягкой ткани или мокрого бумажного полотенца в одном, гладком движении. Избегайте трения, чтобы удалить крем, так как это может привести к ссадины на открытой коже мышей.

Подтверждение локальной доставки в паховой ЛН может быть оценено с помощью наблюдения или гистологии. Объем LN можно контролировать визуально во время инъекции в качестве индикатора успешной инъекции. Ожидаемые результаты включают эффективное распределение грузов по всей структуре LN, без значительной утечки в соседние ткани или клетки. Кроме того, по мере того как впрыскиваемая жидкость вытесняет/разбавляет трассировщик в ЛН, концентрация красителя/окраска должна стать менее интенсивной после инъекции. Наблюдение за тканью должно выявить нетронутыми, но увеличенный LN из-за инъекции жидкости. Потенциальные проблемы включают в себя введение слишком быстро или отсутствует LN, оба из которых могут вызвать элюционирование объема в окружающих подкожной ткани. Эти нежелательные исходы могут быть подтверждены некропсией или гистологией, где суспензия частиц будет наблюдаться распространение на клетки и ткани, удаленные от узлов, направленных на инъекцию. В отличие от этого, ожидаемым результатом будет выявление увеличенного пахового ЛН из-за сдерживания частиц в структуре ЛН. Гистологическая обработка подакцизных LNs может окончательно подтвердить доставку груза в лимфоидную ткань, как показано на рисунках 2C и 2D. Обратите внимание, что частицы на рисунке 2 включают флуоресцентный груз, чтобы обеспечить визуализацию груза во время инъекций, а также во время гистологической обработки и флуоресцентной микроскопии.

Рисунок 1. Синтез и характеристика липидных стабилизированных частиц. A)Схематическая диаграмма, описывающая синтез липидно-стабилизированных частиц, подготовленных эмульсией/растворителем испарения. B) Распределение размеров микрочастиц (твердая линия, диаметр 2,8 мкм) и наночастиц (dashed line, диаметр 113 нм). C)Флуоресцентные микроскопические изображения частиц, нагруженных флуоресцентно помеченным пептидом и флуоресцентным красителем частиц. Этикетки: пептид (зеленый) и частицы (красный). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.

Рисунок 2. i.LN. Инъекция и распределение биоразлагаемых частиц в пределах ЛН. A)Методология для инъекций i.LN. B) Визуализация LNs в мыши через кожу (верхнее изображение) и после некропсии (нижнее изображение)5. C)гистологическое окрашивание ЛН, подтверждающее осаждение и распределение флуоресцентно помеченных полимерных микрочастиц (частиц, зеленый; Т-клетки, красные; В-клетки, синие). D)Флуоресцентно помеченные наночастицы (50 нм, левое изображение) и микрочастицы (6 мкм, правое изображение) в LNs 24 часа после инъекции. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. 

Производственные затраты и плата за доступ к этой статье были частично спонсированы HORIBA, Ltd.