Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Визуализация эндоплазматической сети субдоменов в культивируемых клетках

13.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50985

⸱

18 февраля 2014 г.

 ,  ,  , 
1Fondazione Filarete, 2Department of Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan, 3Neuroscience Institute, National Research Council (CNR), 4Department of Health Science, "Magna Graecia" University of Catanzaro

В этой статье

Краткое содержание

Описаны подходы изображений мы используем, чтобы исследовать распределение и мобильность трансфектированных флуоресцентных белков резидентов в эндоплазматической сети (ER) с помощью конфокальной микроскопии живых клеток. Мы также ультраструктурно проанализировать влияние их экспрессии на архитектуру этого субклеточной отсека.

Аннотация

Липиды и белки в клетках эукариот постоянно обмениваются клеточных отсеках, хотя они сохраняют свою особую состав и функции, несмотря на интенсивный interorganelle молекулярной трафика. Методы, описанные в этой статье, являются мощным средством изучения белков и липидов мобильность и торговлей в естественных условиях и в их физиологической среде. Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) и потери флуоресценции в фотообесцвечивания (Flip) широко используются методы проживанию ячейки изображения для изучения внутриклеточных торговлей через экзо-эндоцитотический пути, локализация образование белковых комплексов, и белка непрерывность между органелл или субкомпартментов в липидных микродоменов, все из которых могут наблюдаться при физиологических и патологических состояний. Ограничения этих подходов в основном за счет использования флуоресцентного слитых белков, и их потенциальные недостатки включают артефактом над-экспрессионов в клетках и возможность различий в складывания и локализации меченых и нативных белков. Наконец, как предел разрешения оптической микроскопии (около 200 нм) не позволяет исследование тонкой структуры ER или конкретных субкомпартментов которые могут происходят в клетках в условиях стресса (то есть гипоксия, введение лекарственного средства, по-выражение трансмембранного белки ER-резидентов) или при патологических состояниях, мы объединяем живых клеток изображений культивируемых трансфекции клеток с Ультраструктурные анализирует на основе просвечивающей электронной микроскопии.

Введение

Открытие зеленого флуоресцентного белка (GFP) и ее спектральных вариантов, и параллельного развития флуоресцентной микроскопии, открыли совершенно новые возможности для исследования поведения белка в клетках. Такие методы, как флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания (FRAP) и потери флуоресценции в фотообесцвечивания (Flip), которые являются возможным из-за внутренней емкости флуорофорами погасить их флуоресценции при интенсивном освещении, основаны на конфокальной микроскопии живых клеток и использование трансфецировали флуоресцентные белки слияния 1-3. Они широко используются для оценки не только локализацию белков, но и их мобильность и везикулярного транспорта, который может выявить важные подсказки, касающиеся их функции 4.

Уникальной особенностью эукариотических клеток является наличие внутриклеточных компартментах, имеющих определенные липидные и белковые композиции. Хотя органеллы физически изолированныйе изд, они должны взаимодействовать друг с другом и совместно молекулярные компоненты для поддержания клеточного гомеостаза. Секреторный путь гарантирует, что белки и липиды, синтезированные в ЭР достичь правильной конечного пункта назначения, в которых они осуществляют свои функции. Внутриклеточных органелл также может быть связано с тем, динамических контактных сайтов, которые позволяют молекулы (липиды), которые будут непосредственно обмениваются отсеков. Более того, многие белки в собранном в больших гетеромерных комплексов или связаны с конкретными видами липидных (липидного плоты / микродоменов), чтобы стать функционально активный или перевозиться к месту назначения. Все эти биологические аспекты значительно влиять на кинетические свойства белков, и поэтому может быть соответствующим образом исследованы с помощью методов, описанных ниже.

Наша группа широко используется FRAP и FLIP в сочетании с электронной микроскопии для изучения архитектуры ЭР и его различных субдомены. ER является первой станцией секреторного пути и играет ключевую роль в белков и липидов сортировки 5. Это очень динамичный органеллы которого отличается поддоменов отразить его много различных функций (то есть белков и липидов биосинтеза и торговлей людьми, белок складывающиеся, Са 2 + хранения и выпуска, и ксенобиотиков метаболизма). Однако, хотя они морфологически, пространственно и функционально различны, эти домены являются непрерывными друг с другом, и их относительное содержание может быть изменено в клетках при физиологических и патологических состояний. Самый известный и обычно пространственно разделенные домены ER являются ядерная оболочка, а гладкая и грубая ER, однако, мы и другие показали, что есть ER структуры с более сложной архитектурой и трехмерной организации в различных типах клеток и тканей в физиологических условиях, которые также могут быть вызваны с помощью стрессовые стимулы, такие как гипоксия, препаратавведения или более-выражение ER-резидентом трансмембранных белков 2,6 (и ссылки в ней).

Мы также недавно продемонстрировали наличие таких структур в клеточных моделей заболеваний человека 1,7. Возникнув от уложенных цистерн гладкого ЭР, им дали коллективное имя организованной гладкой эндоплазматической сети (Осер) в 2003 году 6, хотя они также известны как karmellae, ламелями, и кристаллоидным ER на основе их архитектуры, которая, как и их размер, может варьироваться. После того как клетки трансфицируют GFP, слитый с цитозольной области хвост-якорь (ТП) ER-резидентом белки (г EGFP-ER), слабо димеризации тенденция GFP в транс резко изменяет организацию и структуру ЭР. FRAP и FLIP эксперименты показали, что г EGFP-ER может свободно диффундировать в OSERs, и тот факт, что она движется от ретикулярной ER к Осер и наоборот </ EM> указывает, что агрегаты непрерывного с окружающей ретикулярной ER. Ультраструктурный анализ позволил нам сопоставить данные флуоресценции с подробным описанием Осер архитектуры и организации на наноуровне: Бюро входят всегда состоят из стопок в паре цистерн гладкого ЭР, но может иметь различные формы пространственной организации, такие, как регулярно устраиваются синусоидальной массивы или оборотов, или шестиугольные "кристаллоидные" трубчатые массивы. Эти перестройки приводят к кубических морфологии 8, которые, как они были найдены в клетках в физиологических условиях 9 и следующих напряжений, таких как гипоксия 10, медикаментозного лечения 11 и рак 9, могут иметь значительный потенциал в качестве ультраструктурных маркеров.

После этого первого демонстрации с использованием гибридных белков GFP, мы использовали эксперименты изображений для анализа распространения ER доменов в ответ на фармакологического лечения 12, Ассесс тенденция флуоресцентных белков в oligomerise в клетках 13, а также расследовать роль мутанта, ALS-связанного белка ТА в формировании внутриклеточных агрегатов ER происхождения, которые могут иметь отношение к его патогенности 1,8. Было высказано предположение, что формирование внутриклеточных агрегатов (что имеет место во многих нейродегенеративных заболеваний 14) может быть защитный механизм, предназначенный для предотвращения взаимодействия между токсичных мутантных белков и окружающих компонентов клетки 15.

Далее следует описание комбинации оптических и электронных методов микроскопии для исследования конструкций, чей С-концевой гидрофобные домены вставляются в мембрану ЭР, а также анализ их динамического поведения и последствий их чрезмерной экспрессии на домене ER архитектура в культивируемых клетках (см. рисунок 1 для блок-схему экспериментального протокола).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Плазмиды, Культура клеток, и Трансфекцию с ER флуоресцентных белков

  1. Плазмида, которую используют в данном исследовании, состоит из расширенной версией GFP слитый на его С-конца к хвостовой области ER изоформы цитохрома крысы B (5) (сокращенно здесь как B (5)) через линкерную последовательность. В регионе хвост содержит всю последовательность (Pro94-Asp134), которая остается мембраны связаны после трипсина расщепления родной б (5), в том числе 17-остатков TMD (трансмембранный домен), по бокам вверх и вниз по полярных последовательностей (ИБП и DPS) . Линкер состоит из Myc эпитопа с последующим [(Gly) 4 Ser] 3, и весь кДНК вставлен в сайты Hind3-Xba1 в экспрессирующий вектор млекопитающего pcDNA3. Детали конструкции этой плазмиды были описаны в предыдущей публикации, в котором он упоминается как GFP-ER 16.
  2. Grow COS-7 клеток в Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% Фетал бычьего сывороточного, 2 мМ L-глутамина, 1% пенициллина / стрептомицина в инкубаторе при 37 ° С и 10% CO 2.
  3. Трансфекция. Пластина 3 х 10 5 клеток на круглом покровным стеклом в 6-луночный планшет и, на следующий день, трансфекции с системой JetPEI, как описано производителем. Следует отметить, что оптимальное соотношение JetPEI / ДНК был протестирован, чтобы установить максимальную эффективность трансфекции в зависимости от плазмиды и клеточной линии, используемой: в нашем случае JetPEI соотношение 2:01 ДНК приводит к 70-80% эффективности трансфекции.

2. Онлайн флуоресценции сканирующий конфокальный микроскопия

  1. Онлайн-ячейки изображения. Поместите покровное на котором трансфицированные клетки высевают в стальной камере культуре клеток в течение 24 мм покровные стекла, заполненных DMEM без фенолового красного, с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1% ручка / стрептококк, 25 мМ HEPES , 50 мкг / мл циклогексимида и 1:100 OxyFluor, чтобы предотвратить образцы из фотообесцвечивания. SP5 конфокальной Микроскопэ оснащен регулируемой температурой СО 2 инкубатора (37 ° C и 5% CO 2) используется для экспериментов изображений живых клеток, с д GFP-ER Визуализируемый помощью лазера 488 нм и фильтр с 525/50 полосовой выбросов.
  2. Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP). Нарисуйте область интереса (ROI), что соответствует структуре Осер, и отбелить его, используя 20 итераций и комбинацию 488 нм (100% лазера 30 мВт Аргон, что соответствует 5,5-6 мкВт на образце) и 405 нм (60% от 30 мВт диод 405 лазера, что соответствует 11,6 мкВт на образце) лазеры, которые, по нашему опыту, приводит к эффективному и быстрому фотообесцвечивания.
  3. Запишите восстановление флуоресценции в обесцвеченных трансформирования, взяв одного кадра раз в 10 сек в течение 10 мин (время пикселей = 1,61 мкс / PX).
  4. Потеря флуоресценции в фотообесцвечивания (флип). Нарисовать ROI, соответствующую структуре Осер, и отбеливатель, как описано выше. Отбеливание повторяется каждые 30 сек,и пост-отбеливания изображения записываются каждые 10 сек в течение 30 мин (время пикселей = 1,61 мкс / PX).
  5. FRAP и анализ FLIP. Все изображения анализируются с помощью ImageJ программного обеспечения ( http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html ). В FRAP экспериментов, восстановление флуоресценции беленой ROI измеряется во времени и нормированы на общей флуоресценции беленой клетки, которая всегда проверяется, чтобы быть постоянным во времени.
  6. Защелкивающейс экспериментов, нарисовать ROI за пределами отбеленной Осер и охватывающей всю ячейку. Измерить его интенсивность флуоресценции с течением времени и нормализации до уровня флуоресценции в ROI, нарисованных на небеленой клетки с целью коррекции в случае любого снижения флуоресценции, вызванной самой визуализации.
  7. Во всех экспериментах, вычитается фоновый сигнал (определяется в области вне клеток) из люминесцентных интенсивностей трансформирования. Наконец, участок результаты с помощью GrПрограммное обеспечение aphPad Призма.

3. Ультраструктурный Анализ методом трансмиссионной электронной микроскопии

Учитывая токсичность многих из реагентов, все процедуры должны проводиться носить соответствующую лабораторию. пальто и перчатки под вытяжкой.

  1. После удаления покровное от чашки Петри, исправить оставшиеся клеток, выращенных на дне чашки в виде монослоя с использованием отфильтрованного 2% глутарового альдегида в 0,1 М какодилатном буфере, рН 7,4, в течение 10 мин при комнатной температуре.
  2. Собрать клетки с использованием тефлоновой скребок и передавать их в 1,5 мл пробирки Эппендорфа. Гранул клеток путем центрифугирования при 9000 г в течение 10 мин. Удалить супернатант, добавить свежий фиксатор, и оставить на ночь при 4 ° С.
  3. Промыть гранул с буфером, а затем после исправить с помощью раствора 1% осмия в какодилатном буфере в течение 1 часа при комнатной температуре.
  4. Промыть MilliQ воды, и единым блоком пятно с1% уранилацетатом в дистиллированной воде для между 20-60 мин.
  5. Высушить образцы в увеличении этанол ряд (70%, 80%, 90%, 100% и 100% в течение 10 мин каждый), и кратко мыть дважды в окись пропилена (15 мин каждый).
  6. Проникнуть образцов в смеси пропиленоксида + Epon (1:1) (от 2 часов в течение ночи).
  7. Вставить в Epon отвержденной эпоксидной смолы при 60 ° С в течение по крайней мере 24 часов.
  8. Секции вручную отделанные блоки смолы с использованием ультрамикротоме LEICA UC6 оснащенный алмазного ножа 45 ° для получения разделы толщиной 60-70 нм. Соберите разделы по 300 сетки медных сетей.
  9. Пятно разделы по сетке с насыщенным раствором уранилацетатом (20 мин) и цитратом свинца (7 мин), тщательно промыть сетки, погружая их в би-дистиллированной фильтрованной воды, и дайте им высохнуть при комнатной температуре.
  10. Окрашенные сетки наблюдаются использованием Tecnai G2 просвечивающего электронного микроскопа, и образы, получены с помощью боттовскийом монтажа ПЗС-камера на различных конечных увеличениях (как правило, в пределах от 6,000-39,000 X).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 2 показывает пример FRAP изучение подвижности белка. Подвижность г EGFP-ER белка свидетельствует быстрое восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания в отбеленной OSERs. Для количественного анализа, половина времени и с мобильного фракция были получены из экспериментально измеренных данных путем установки следующий моноэкспоненциальной уравнение:

F (T) = F сообщению + (F REC-F сообщение) (1-е-т / τ)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протоколы и подходы визуализации, описанные в этой статье, были использованы для исследования распределения и мобильности трансфектированных TA флуоресцентных белков резидентов в ЭР живых клеток. Мы также проанализировали влияние над экспрессия этих белков на архитектуре этой субклеточной отсека с помощью ультраструктурных анализов.

Сочетание живых клеток конфокальной микроскопии и электронной микроскопии представляет очень мощное средство исследования динамических свойств белков, и может пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарны Fondazione Филарете за его помощь и поддержку в публикации этой статьи. Мы также хотели бы поблагодарить Centro Europeo ди Nanomedicina для использования Tecnai G2 просвечивающего электронного микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Дульбекко s Модифицированный Eagle Medium (DMEM)Invitrogen41966029
Dulbecco' s Модифицированная Eagle Medium (DMEM) без фенола красногоInvitrogen31053028
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)Invitrogen10270106
Pen/StrepInvitrogen15140-122
L-Glutamine 200 мМ растворInvitrogen25030-024
jetPEIPolyplus TransfectionPP10110
оксифтороксиразой Инк.OF-0005
Глутаральдегид Grade ISigma AldrichG5882
Тригидрат какодилата натрияSigma AldrichC0250
Тетраоксид осмия 4% растворЭлектронная микроскопия Наука19150
Дигидрат уранилацетатаSigma Aldrich73943слаборадиоактивный
Оксид пропиленаSigma-Aldrich82320
Набор встраиваемых сред EPONSigma-Aldrich45359-1EA-F
Цитрат свинца Электронная микроскопия Наука17800
Настольная центрифугаEppendorf5415 D
Спектральный конфокальный микроскоп Leica MicrosystemsTCS SP5
CO2 Микроскоп Клеточная инкубационная система OkoLab
Ultramicrotome Leica MicrosystemsUC6
Алмазный нож DiatomeUltra 45 °
Просвечивающий электронный микроскоп FEITecnai G2
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software, Inc
Стальная культуральная клеточная камера для покровного стекла 24 ммBioscience ToolsCSC-25
Электронные микроскопические сеткиЭлектронная микроскопия ScienceG300Cu

Ссылки

  1. Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
  2. Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux. Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).
  3. Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).
  4. Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).
  5. Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. Bi-directional protein transport between the ER and. 20, 87-123 (2004).
  6. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).
  7. Papiani, G., et al. Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome. J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).
  8. Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization. J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).
  9. Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. The dynamic ER: experimental approaches and current questions. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).
  10. Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 12, 327-342 (1994).
  11. Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital. Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).
  12. Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells. J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).
  13. Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13, 643-649 (2012).
  14. Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres. J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).
  15. Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
  16. Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases. EMBO J. 27, 336-349 (2008).
  17. Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways. Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).
  18. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).
  19. Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  20. Michida, T., et al. Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats. Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Фотовыгорание с восстановлением флуоресценциифотовыгорание с потерей флуоресценциивизуализация живых клетокпросвечивающая электронная микроскопияконфокальная микроскопиябелки с GFP-меткойтранспорт белков и липидовсубкомпартменты органеллультраструктурный анализ
Визуализация эндоплазматической сети субдоменов в культивируемых клетках
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.