Описаны подходы изображений мы используем, чтобы исследовать распределение и мобильность трансфектированных флуоресцентных белков резидентов в эндоплазматической сети (ER) с помощью конфокальной микроскопии живых клеток. Мы также ультраструктурно проанализировать влияние их экспрессии на архитектуру этого субклеточной отсека.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация эндоплазматической сети субдоменов в культивируемых клетках
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Липиды и белки в клетках эукариот постоянно обмениваются клеточных отсеках, хотя они сохраняют свою особую состав и функции, несмотря на интенсивный interorganelle молекулярной трафика. Методы, описанные в этой статье, являются мощным средством изучения белков и липидов мобильность и торговлей в естественных условиях и в их физиологической среде. Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) и потери флуоресценции в фотообесцвечивания (Flip) широко используются методы проживанию ячейки изображения для изучения внутриклеточных торговлей через экзо-эндоцитотический пути, локализация образование белковых комплексов, и белка непрерывность между органелл или субкомпартментов в липидных микродоменов, все из которых могут наблюдаться при физиологических и патологических состояний. Ограничения этих подходов в основном за счет использования флуоресцентного слитых белков, и их потенциальные недостатки включают артефактом над-экспрессионов в клетках и возможность различий в складывания и локализации меченых и нативных белков. Наконец, как предел разрешения оптической микроскопии (около 200 нм) не позволяет исследование тонкой структуры ER или конкретных субкомпартментов которые могут происходят в клетках в условиях стресса (то есть гипоксия, введение лекарственного средства, по-выражение трансмембранного белки ER-резидентов) или при патологических состояниях, мы объединяем живых клеток изображений культивируемых трансфекции клеток с Ультраструктурные анализирует на основе просвечивающей электронной микроскопии.
Введение
Открытие зеленого флуоресцентного белка (GFP) и ее спектральных вариантов, и параллельного развития флуоресцентной микроскопии, открыли совершенно новые возможности для исследования поведения белка в клетках. Такие методы, как флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания (FRAP) и потери флуоресценции в фотообесцвечивания (Flip), которые являются возможным из-за внутренней емкости флуорофорами погасить их флуоресценции при интенсивном освещении, основаны на конфокальной микроскопии живых клеток и использование трансфецировали флуоресцентные белки слияния 1-3. Они широко используются для оценки не только локализацию белков, но и их мобильность и вез....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Плазмиды, Культура клеток, и Трансфекцию с ER флуоресцентных белков
- Плазмида, которую используют в данном исследовании, состоит из расширенной версией GFP слитый на его С-конца к хвостовой области ER изоформы цитохрома крысы B (5) (сокращенно здесь как B (5)) через линкерную последовательность. В регионе хвост содержит всю последовательность (Pro94-Asp134), которая остается мембраны связаны после трипсина расщепления родной б (5), в том числе 17-остатков TMD (трансмембранный домен), по бокам вверх и вниз по полярных последовательностей (ИБП и DPS) . Линкер состоит из Myc эпитопа с последующим [(Gly) 4 Ser] 3, и весь кДНК вставлен в....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 2 показывает пример FRAP изучение подвижности белка. Подвижность г EGFP-ER белка свидетельствует быстрое восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания в отбеленной OSERs. Для количественного анализа, половина времени и с мобильного фракция были получены из экспериментально измеренных данных путем установки следующий моноэкспоненциальной уравнение:
F (T) = F сообщению + (F REC-F сообщение) (1-е-т / τ)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протоколы и подходы визуализации, описанные в этой статье, были использованы для исследования распределения и мобильности трансфектированных TA флуоресцентных белков резидентов в ЭР живых клеток. Мы также проанализировали влияние над экспрессия этих белков на архитектуре этой субклеточной отсека с помощью ультраструктурных анализов.
Сочетание живых клеток конфокальной микроскопии и электронной микроскопии представляет очень мощное средство исследования динамических свойств белков, и может пр.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Авторы благодарны Fondazione Филарете за его помощь и поддержку в публикации этой статьи. Мы также хотели бы поблагодарить Centro Europeo ди Nanomedicina для использования Tecnai G2 просвечивающего электронного микроскопа.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Дульбекко s Модифицированный Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco' s Модифицированная Eagle Medium (DMEM) без фенола красного | Invitrogen | 31053028 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine 200 мМ раствор | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| оксифтороксиразой | Инк. | OF-0005 | |
| Глутаральдегид Grade I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Тригидрат какодилата натрия | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Тетраоксид осмия 4% раствор | Электронная микроскопия Наука | 19150 | |
| Дигидрат уранилацетата | Sigma Aldrich | 73943 | слаборадиоактивный |
| Оксид пропилена | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| Набор встраиваемых сред EPON | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Цитрат свинца | Электронная микроскопия Наука | 17800 | |
| Настольная центрифуга | Eppendorf | 5415 D | |
| Спектральный конфокальный микроскоп | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2 Микроскоп Клеточная инкубационная система | OkoLab | ||
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Алмазный нож | Diatome | Ultra 45 ° | |
| Просвечивающий электронный микроскоп | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
| Стальная культуральная клеточная камера для покровного стекла 24 мм | Bioscience Tools | CSC-25 | |
| Электронные микроскопические сетки | Электронная микроскопия Science | G300Cu |
Ссылки
- Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
- Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
