Методическая статья

Идентификация мышиный эритробласта субпопуляции обогащенный энуклеирующий События на нескольких спектральных изображений проточной цитометрии

DOI:

10.3791/50990

⸱

6 июня 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer and Blood Diseases Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, University of Cincinnati College of Medicine, 2IBM

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол описывает новый метод выявления население энуклеирующий ортохроматических эритробласты по многоспектральным потока изображений цитометрии, обеспечивая визуализацию процесса энуклеации эритробластов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эритропоэз у млекопитающих заключает с драматической процессе энуклеации, что приводит к ретикулоцитов образования. Механизм энуклеации до сих пор не выяснена. Общей проблемой столкнулись при изучении локализации ключевых белков и сооружений в пределах энуклеирующий эритробластов с помощью микроскопии является трудность наблюдать достаточное количество клеток, подвергающихся энуклеации. Мы разработали протокол о романе анализа с использованием многопараметрическую высокоскоростной визуализации клеток в потоке (Multi-спектральных изображений проточной цитометрии), метод, который сочетает в себе Иммунофлуоресцентной микроскопии с проточной цитометрии, с целью выявления эффективно значительное количество энуклеирующий событий, что позволяет получить измерения и выполнить статистический анализ.

Мы сначала опишем здесь два в пробирке эритропоэз культуры методами, используемые для того, чтобы синхронизировать мышиных эритробласты и увеличить вероятность захвата энуклеации в гое время оценки. Затем мы подробно описать окрашивание эритробластах после фиксации и проницаемости для изучения локализации внутриклеточных белков или липидного плоты во время энуклеации по многоспектральная потока изображений цитометрии. Наряду с размером и DNA/Ter119 окрашивания, которые используются для идентификации ортохроматических эритробласты, мы используем параметры "Соотношение сторон" ячейки в канале светлого поля, что помогает в признании удлиненных клеток и "дельта центроидного XY Ter119/Draq5 "что позволяет идентифицировать клеточных событий в которой центр Ter119 окрашивания (зарождающейся ретикулоцитов) является далеко друг от друга от центра Draq5 окрашивания (ядро претерпевает экструзии), что указывает на ячейку собирается выяснять. Подмножество ортохроматической населения эритробластов с высокой дельта тяжести и малого удлинения настоятельно обогащенный энуклеирующий клетки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Терминальной дифференцировки эритроидных в линии у млекопитающих заключает с резким процессе энуклеации, через который ортохроматический эритробласт вытесняет его мембрану в корпусе ядро (pyrenocyte) 1, генерируя ретикулоцитов 2. Точный механизм этого процесса, который также является ограничение скорости шаг успешным, масштабная, производство красных кровяных клеток в пробирке, еще не полностью выяснены. Локализация ключевых белков и сооружений в пределах энуклеирующий эритробластах основывается на использовании флуоресцентного и электронной микроскопии 3-5. Этот трудоемкий процесс обычно приводит к идентификации ограниченного числа энуклеации событий и не всегда позволяет значимого статистического анализа. Развивая метода идентификации эритробластов описанной ранее МакГрат и др.. 6, мы разработали новый подход к идентификации и изучения энуклеации события по многоспектральные ИмаПеренять проточной цитометрии (многопараметрических высокоскоростной визуализации клеток в потоке, метод, который сочетает в себе флуоресцентной микроскопии с проточной цитометрии) 7, которые могут обеспечить достаточное количество наблюдений, чтобы получить измерения и выполнить статистический анализ.

Здесь мы описываем первые два в пробирке эритропоэз культуры методами, используемые для синхронизации эритробласты и повысить вероятность захвата энуклеацию на момент оценки. Тогда мы подробно описать окрашивание эритробластах после фиксации и проницаемости для изучения локализации внутриклеточных белков или липидного плоты во время энуклеации по многоспектральная потока изображений цитометрии.

Образцы работать на потоке изображений цитометр и собранные клетки закрытого соответствующим определить ортохроматических эритробласты 6. Ортохроматический эритробластов затем анализируют на основе их пропорции, как измерено в светлое IMAПеренять, по сравнению с их значение для параметра дельта центроидного XY Ter119-ДНК, которая определяется как расстояние между центрами областей, окрашенных для Ter119 и ДНК соответственно. Популяция клеток с низким соотношением сторон и высокой дельта тяжести XY Ter119/DNA настоятельно обогащенный энуклеирующий клетки. Использование дикого типа (WT) эритробластов по сравнению с эритробластов Mx-Cre опосредованного условной делеции Rac1 на RAC2 - / - или комбинированной RAC2 - / -; Rac3 - / - генетический фон и этот анализ новый протокол из нескольких спектральных изображений потока цитометрии, недавно мы показали, что энуклеации напоминает асимметричную цитокинеза, и что формирование актомиозинового кольца регулируемого частично Rac GTPases важен для энуклеации прогрессии 7.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Долгосрочный Экстракорпоральное эритропоэза культуры (Экс естественных эритроидной дифференцировки Культура протокол по Giarratana др.. 8, модифицированы и адаптированы для мышиных клеток)

Это 3-ступенчатый долгосрочная экстракорпоральное протокола эритропоэза. На первом этапе (0-4 дней) 2 х 10 5 клеток / мл помещают в среду роста эритробластов с добавлением фактора стволовых клеток (SCF), интерлейкин-3 (IL-3) и эритропоэтин (ЕРО). На втором этапе (дни 5-6), клетки ресуспендировали в 2 х 10 5 клеток / мл и культивируют совместно на прилипающих клеток стромы (MS5) в свежей среде роста эритробластов, дополненной только с ЕРО. На третьем этапе (7-9 дней) клетки культивируют на слое MS-5 клеток в свежей среде роста эритробласт без цитокинов до энуклеации (рис. 1а).

Все протоколы животных были утверждены уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC) побочныхБольница Медицинского центра Цинциннати Детская.

  1. Урожай костей и изоляции низкой плотности клеток костного мозга
    1. Добавить 2 мл стерильной среде IMDM, содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в 15 мл коническую пробирку и хранить на льду.
    2. Усыпить на 2-6 месячного дикого типа C57/BL6 мышь (наряду с или без генетически-целевой мыши интереса) после учреждения утвержденных протоколом (например CO 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков).
    3. Изолировать тазовые кости, бедра и голени обеих ног с помощью щипцов и скальпель, добавьте их в пробирку, содержащую IMDM +2% FBS и держать на льду.
    4. Добавить 1 мл IMDM +2% FBS в стерильной проточной цитометрии трубки и флеш костей с помощью щипцов и туберкулиновые шприцы с 25-G х 5/8 "Игла. Флеш IMDM +2% FBS через кости несколько раз мягко ( путем аспирации ~ 500 мкл из клеточной суспензии и промывки его снова через кость), и собирать клетки костного мозга в проточной cytometrу трубки. Промывка будет завершена, когда кости появляются белые.
    5. Фильтр-клеток суспензии через клеточный фильтр набора 40 мкм на вершине 50 мл коническую пробирку. Промыть фильтр клеток с IMDM +2% FBS и с использованием тех же среда регулировать конечный объем клеточной суспензии в 5 мл.
    6. Подготовка низкой плотности клеток костного мозга (LDBM) по центрифугирования в градиенте плотности: тщательно наслаивать 5 мл клеточной суспензии на 5 мл разделения градиент плотности клеток среднего 1,083 г / мл в 15-мл пробирку и спина при 750 мкг в течение 25 мин при комнатной температуре (RT), без тормозов / низкая ускорения.
    7. Передача супернатант (все примерно до 2-мл отметки 15-мл пробирку для того, чтобы приобрести Баффи пальто) на новую 15-мл трубки и выполнять еще одну стирку с IMDM +2% FBS при 525 мкг в течение 5 мин при RT.
    8. Аспирируйте супернатант и любые оставшиеся лизировать красные кровяные клетки (RBC) суспендированием осадка в 3 мл буфера для лизиса эритроцитов в течение 5 мин при комнатной температуре. Если больше, чистота эритробластов являетсятребуется на конечной стадии (например, для биохимических исследований), очистить LDBM клетки дальше на этом этапе к Лин нег клеток путем магнитной сепарации.
  2. Экс естественных эритроидных дифференциация протокол культуры, начиная с LDBM или Лин нег клеток (рис. 1А)
    1. Добавить 7 мл IMDM +2% FBS, спина при 525 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре и ресуспендируйте осажденные клетки в 2 мл роста эритробласт среды (ВОСА), состоящий из:
      . StemPro-34 средний, содержащий
      б. 2,6% StemPro-34 среднего добавка,
      с. 20% БИТ-9500,
      г. 900 нг / мл сульфат железа,
      э. 90 нг / мл нитрат трехвалентного железа,
      е. 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина, 2 мМ L-глутамина
      г. 10 -6 М гидрокортизон
      час и недавно добавил цитокины:
      я) 100 нг / мл SCF,
      II) 5 нг / IL-3 мл,
      III) 3 МЕ / мл ЕРО.
    2. Граф клеток с использованием автоматического счетчика клеток или вручную на микроскопе с использованием крайocytometer.
    3. Пластина в клеточной культуральной пластины 6-луночный в концентрации 5 × 10 5 клеток / лунку в конечном объеме 2,5 мл в EGM (2 × 10 5 LDBM клеток / мл) и инкубировали при 37 ° С (это считается как день # 0 культуры).
    4. Изменение среды путем аспирации 1,5 мл надосадочной жидкости, вращается со скоростью 525 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, ресуспендирования в 1,5 мл свежей среды, содержащей все три цитокины и добавление обратно в лунки каждый день по дням # 2, 3, 4, чтобы оптимизировать пролиферативная фаза. На 3-й день, удалить все клетки, считать и разделен на соответствующее количество скважин для поддержания концентрации также сотовые ~ 2 х 10 5 клеток / мл. Поддерживать культуру при 37 С / 5% СО 2 °.
    5. На 4-й день, пластина MS5 клетки (мышиный линии стромальных клеток) в лунки новой клеточной культуры 6-луночный планшет. Клетка-культуральная среда MS5 в α-МЕМ, содержащей 20% FBS, 100 единиц / мл пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина.
    6. На 5-й день, подсчитать количествоклетки (теперь значительно обогащен эритробластов) в каждую лунку исходного культуральном планшете с использованием автоматического счетчика клеток или вручную на микроскопе с помощью гемоцитометра.
    7. Лифт все клетки из каждой лунки и передать 15-мл конические пробирки, спин вниз при 525 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, аспирата супернатанта и растворить гранулы со свежим EGM, содержащей только EPO (3 МЕ / мл) до концентрации 2 х 10 5 клеток / мл.
    8. Аспирируйте супернатант из лунок, где MS-5 Клетки высевали в предыдущий день (направлена ​​на 70-80% слияния во время совместного культивирования) и добавить эритроидных клеток в этих скважинах в EGM, содержащей только EPO (хотя не их среда выбор, MS-5 клеток выживать в ВОСА в течение нескольких дней).
    9. Изменение средней добавив, свежий EPO на день # 6.
    10. Изменение среды на день # 7, используя внеочередное собрание акционеров без добавления цитокинов. В дни с 7 по 9, тестовые образцы для энуклеации с проточной цитометрии после окрашивания анти-Ter119 и SYTO-16 ежедневно и рroceed для окрашивания образцов для нескольких спектральных изображений проточной цитометрии (как описано в разделе 3).
      Примечание:. Перед покрытием и в день 2, 4, 6 и 7 культуры, мониторинг культивируемые клетки для обогащения эритробластов и дифференциации с проточной цитометрии путем оценки поверхностные маркеры CD44 и Ter119 против размера (FSC) 9 альтернативы CD71, Ter119 и FSC также могут быть использованы 10, 11.

2. Быстрый Энуклеация Анализ, В соответствии с протоколом, описанным Yoshida и соавт. 12 с изменениями (рис. 1В)

  1. Стресс эритропоэз индукция и стромы клеточный препарат для в пробирке эритропоэза культуры
    1. Обезболить в 2-6 месячного дикого типа C57/BL6 мышь за руководящими принципами IACUC (например, с изофлурана решения). Убедитесь, что мышь была адекватно наркоз путем проверки отсутствия рефлексивных ответов на пологом задние лапы-шнура и длярегулярные дыхания во время процедуры. Используйте ветеринар глазной мази на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
    2. Вызвать стресс эритропоэз через хвост кровотечение до конечного объема 500 мкл. Использование инсулиновый шприц, вводят равный объем физиологического раствора внутрибрюшинно заверить жидкости реанимации животного (держать животное в положение Тренделенбурга перед инъекцией и впрыснуть в нижней части живота, чтобы не повредить внутренние органы).
    3. Не оставляйте без присмотра мышь, пока он не восстановил контроль двигателя, как указано животного начинает двигаться по клетке и быть в состоянии стоять и ходить, не падая. Phlebotomized Мышь помещают в клетку без других мышей.
    4. После 2 дней, плиты MS-5 клеток в лунки клеточного культурального планшета 24-луночного. Инкубировать MS-5 клеток на 37 ° C / 5% CO 2 в MS5 клеточной среде (-МЕМ, содержащей 20% FBS, 100 единиц / мл пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина) с целью быть 70-80 % сливной ян планшетов после 48 часов.
  2. Урожай селезенки и обработки спленоцитов
    1. Четыре дня (96 ч) после индукции стресс эритропоэза, усыпить ранее кровь мыши через IACUC-утвержденным протоколом (например CO 2 ингаляции следуют путем смещения шейных позвонков).
    2. Урожай селезенки и положить его в 15-мл коническую трубку с IMDM 2% FBS и держать на льду.
    3. Еще в лаборатории, в капот культуры ткани в стерильных условиях, инвертировать селезенки, содержащие трубки на сито 40 мкм клеток, установленного в верхней части 50-мл пробирку. Давка селезенки, используя поршень из 5-мл пластиковый шприц.
    4. Промыть фильтр клеток с IMDM +2% FBS и с использованием той же среды, регулировать конечный объем клеточной суспензии в 5 мл.
    5. Осторожно слой в 5 мл суспензии спленоцитов на 5 мл плотности разделения градиента клеток среднего 1,083 г / мл в 15-мл пробирку и спина при 750 мкг в течение 25 минут при комнатной температуре, без тормозов / низкая ускорения.
    6. Передачасупернатант (раствор примерно до 2-мл отметки 15-мл пробирку для того, чтобы приобрести Баффи пальто) на новый 15-мл трубки и выполнять еще одну стирку с IMDM +2% FBS в 525 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре .
    7. Аспирируйте супернатант и лизиса эритроцитов путем суспендирования осадка в 3 мл буфера для лизиса эритроцитов в течение 5 мин при комнатной температуре.
    8. Добавить 7 мл IMDM +2% FBS мыть клетки и разбавить и нейтрализовать буфер для лизиса и спина РБК в 525 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
    9. Аспирируйте супернатант и приостановить осажденные клетки в 2 мл среды роста эритробластов (EGM).
  3. Культура изолированных спленоцитах низкой плотности, обогащенных эритробластах, на пластик (первый этап быстрого эритропоэза культуры в пробирке)
    1. Подсчет клеток на автоматическом счетчике клеток или вручную гемоцитометре. Обычная количество клеток, выделенных на селезенке на данном этапе составляет ~ 15 х 10 6.
    2. Приостановить клетки далее в ВОСА, содержащие цитокины (в фИнал концентрации): SCF 50 нг / мл, IL-3 5 нг / мл, и Epo 2 Ед / мл.
    3. Пластинчатые 1-5 х 10 6 клеток в конечном объеме 1 мл / лунку (такое же количество клеток на лунку в зависимости от общего числа клеток) в 24-луночный клеточной культуральный планшет и инкубируют O / N при 37 ° С / 5% СО 2.
  4. Культура эритробластах на MS5 клеток (второй этап быстрого эритропоэза культуры в пробирке
    1. Аспирируйте супернатант из пластика скважины и поднимать клетки (высоко обогащенных эритробластов) добавлением 2 мл холодного 10 мМ ЭДТА в PBS в течение 5 мин, на льду в каждую лунку.
    2. Положите клеток в свежие пробирки, мыть один раз в ВОСА (без цитокинов) и ресуспендируйте в то же самое.
    3. Пластинчатые 5 х 10 5 -1 × 10 6 клеток в объеме 1-2 мл в каждую ячейку MS5 покрытием лунку 24-луночного планшета. Если фармакологические ингибиторы, которые используются в эксперименте, добавить их в соответствующих концентрациях теперь.
    4. Выдержите в течение 6 до 8 часов (время руководствуясьмикроскопическим наблюдением примерно 30% -40% энуклеации в необработанном образце WT). Связывание эритробластах для MS-5 клеток ускоряет их энуклеации.
    5. Лифт клеток из каждой лунки добавлением 2 мл холодного PBS + 10 мМ ЭДТА, в течение 5 мин, на льду. Наряду с эритробластах, MS-5 клеток также будут собраны, но они позже могут быть легко исключены при анализе цитометрического потока как FSC привет Ter119 - клеток.
    6. На данном этапе клетки могут быть зафиксированы и окрашены для анализа нескольких спектральных изображений проточной цитометрии.

3. Окрашивание эритробласты для локализации внутриклеточных белков или липидного плоты момент энуклеации по Multi-спектральных изображений проточной цитометрии

  1. Промыть клеток в PBS, спина 525 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и аспирации супернатант.
  2. Fix клетки ресуспендированием ячейки гранул в 500 мкл 3,7% формальдегида в PBS в течение 15 мин (время фиксирования может варьироваться в зависимости от антипоколения зондируемой) и пипетки осторожно.
  3. Переход к 1,5-мл пластиковые центрифужные пробирки и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
  4. Спин на скамейке микроцентрифужную 2000 мкг в течение 20 сек, аспирации супернатант и выполнить одно мытье, добавив 500 мкл PBS в каждую пробирку и пипетки осторожно.
  5. Спин на скамейке микроцентрифужную 2000 мкг в течение 20 сек, аспирации супернатант и держать труб на льду в течение не менее 15 мин. Permeablization шаги 3.6-3.9 должно быть сделано быстро и эффективно, и после спиннинг / стремление при комнатной температуре, клеточные осадки сразу следует положить обратно на льду, для того, чтобы клетки, чтобы лучше сохранить их целостность.
  6. Возьмите ацетон решения из -20 ° C морозильник и поставить на лед. Проницаемыми клетки ресуспендированием ячейки гранул сначала в 500 мкл ледяного 50% ацетона (1:1 с дН 2 O) и пипетки осторожно.
  7. Спин на скамейке микроцентрифуге 2000 мкг в течение 20 сек, аспирации супернатант и ресуспендируют осадков клеток в 500 мкл60; ледяной 100% ацетона с помощью пипетки осторожно.
  8. Спин на скамейке микроцентрифуге 2000 мкг в течение 20 сек, аспирации супернатант и ресуспендируют осадков клеток более раз в 500 мкл ледяного 50% ацетона с помощью пипетки осторожно.
  9. Спин на скамейке микроцентрифуге 2000 мкг в течение 20 сек, аспирации супернатант и мыть клетки один раз в холодном буфере FACS (PBS + 0,5% BSA) с помощью пипетки осторожно.
  10. Подготовка маркировки коктейль с антителами или маркеров для молекул, представляющих интерес: 0,1 мкл U/100 AF488-фаллоидином для F-актина окрашивания и 1 мкл μl/100 Ter119-PECy7 для окрашивания эритроидных клеток. Альтернативных или дополнительных окрашивание также можно сделать с помощью AF-488-анти-β-тубулина антитела (1:50), AF-594-сопряженных холерный токсин субъединицы B маркировать липидов плоты (1:200), анти-pMRLC (Ser19) Первичные антитела к фосфорилированной регуляторной легкой цепи миозина (1:50), с последующим анти-кроличьего AF-488-конъюгированным вторичным антителом (1:400) и анти-γ-тубулин первичный кроличье антитело (1:100) с последующим анти-кроличьего AF-555-конъюгированного вторичного антитела (1:300).
  11. После супернатанта аспирацией, ресуспендируют осадка клеток в 100 мкл коктейля маркер, пипетки осторожно и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
  12. Подготовка FACS буфера, содержащего 2,5 мкм в пятно Draq5 ядерной.
  13. Вымойте клеток в FACS буфера, спин вниз на скамейке микроцентрифуге 2000 мкг в течение 20 сек, аспирации супернатант и ресуспендируют в 60 мкл FACS буфера, содержащего Draq5.
  14. Запуск образцы на визуализации проточного цитометра собрать не менее 10 тысяч событий в эксперименте, компенсировать файлы исходных данных, как ранее опубликованной 13, и анализировать результаты, как показано на рисунке 2, используя программное обеспечение для анализа, специфичную для визуализации проточного цитометра.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во-первых, клетки анализируются на основе их светлое Aspect Ratio (соотношение длины их незначительное по сравнению с их главной оси) и их Светлое Площадь (ориентировочная от их размера). События с значение Светлое Площадь ниже 20 и выше, чем 200, в основном мусор и клеточные агрегаты, соответственно, и исключены из анализа (рис. 2А). Отдельные клетки (ворота "R1") затем анализировали на основе их значения параметра Градиент RMS, что указывает резкость изображения. Ворота "R2" создается содержащие клетк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы изучение эритробластов энуклеации приобрел большее импульс, так как это является шагом в в пробирке эритропоэз культур, которые наиболее трудно воспроизвести эффективно для достижения успешного, крупномасштабное производство красных кровяных клеток экс естественных условиях. До недавнего времени изучение эритробластов энуклеации используются в основном флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии методы. Методы флуоресцентной микроскопии, хотя полезны в выявлении, участвующих моле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Исследования проточной цитометрии Ядро в больнице Research Foundation Цинциннати Детская и Ричард Demarco, Sherree другу, и Скотт Мордехая от Amnis Corporation (часть EMD Milllipore) для экспертной технической поддержки. Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья предоставляет K08HL088126 и R01HL116352 (TAK) и P30 DK090971 (YZ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
α MEM mediumCellGro15-012-CV
IMDM mediumHyclone (Thermo Scientific)SH30228.01
Stempro-34 SFMGIBCO (Life Tech)10640
Питательная добавка Stempro-34GIBCO (Life Tech)10641-025
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Atlanta Biologicals512450
BIT9500Стволовые клетки Технологии09500
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Fisher ScientificBP-1600-100
Фосфатный буферный раствор (PBS)Гиклон (Thermo Scientific)SH30028.02
Пенициллин/стрептомицинГиклон (Thermo Scientific)SV30010
L-глутаминГиклон (Thermo Scientific)SH30590.01
Изотезия (изофлуран)Батлер-Шейн029405
Histopaque 1,083 мг/млSigma10831
BD Pharmlyse (буфер для лизиса эритроцитов)BD Biosciences555899
ацетонSigma-Aldrich534064
формальдегидомFisher ScientificBP 531-500
ГидрокортизонSigmaH4001
Фактор стволовых клеток (SCF)Peprotech250-03
Интерлейкин-3 (IL-3)Peprotech213-13
EPOGEN Epoetin Альфа (Эритропоэтин, ЭПО)AMGENдоступно в аптеке
Антитело CD44-FITCBD Pharmingen553133
антитело CD71-FITCBD Pharmingen553266
Антитело Ter119-PECy7BD Pharmingen557853
фаллоидин-AF488Invitrogen (Life Technologies)A12379
β-tubulin-AF488 антителоCell Signaling#3623
anti-rabbit AF488-вторичное антителоInvitrogen (Life Technologies)A11008
anti-rabbit AF555-вторичное антителоInvitrogen (Life Технологии)A21428
AF594-холерный токсин субъединица BInvitrogen (Life Technologies)C34777
pMRLC (Ser19) антителоCell Signaling#3671
&гамма;-тубулин антителоSigmaT-3559
Syto16Invitrogen (Life Technologies)S7578
Draq5BiostatusDR50200
Сульфат железаSigmaF7002
Нитрат железаSigmaF3002
EDTAFisher ScientificBP120500
15 мл тубыBD Falcon352099
50 мл пробиркиBD Falcon352098
6 лунокBD Falcon353046
24- колодцыBD Falcon351147
Проточные трубкиBD Falcon352008
Туберкулиновый шприцBD309602
Инсулиновый шприцBD329461
Шприц игла 25-G 5/8BD305122
Проточные трубки с крышкамиBD352058
40-μ m клеточный фильтрBD Falcon352340
Скальпель (одноразовый)Feather2975#21
FACS Canto Flow CytometerBD
ImagestreamX Mark II Imaging Flow CytometerAMNIS (EMD Millipore)
Программное обеспечение для исследования и анализа данных изображений (IDEAS) версии 4.0 и выше.AMNIS (EMD Millipore)
Счетчик клеток Hemavet 950Drew ScientificCDC-9950-002
Инкубатор серии NAPCO 8000WJТермонаучная
центрифуга Allegra X-15RBeckman Coulter392932
мини-настольная настольная центрифуга для мышейDenvilleC0801

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
  2. Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
  3. Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
  4. Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
  5. Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
  6. McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
  7. Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
  8. Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  9. Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).
  10. Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
  11. Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. , (2011).
  12. Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
  13. Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Ter119Draq5in vitro

Похожие статьи