Традиционные процедуры выделения растворимого типа 1 коллагена (COL1) потребуется около 10 дней с начала до конца из-за длительных инкубации буферных и трудоемких resuspensions фибрилл. Здесь мы описываем средства для очистки COL1 от небольших кожных биопсий менее чем за 3 часа.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Улучшенный способ по подготовке I типа коллагена из кожи
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Растворимый коллаген типа 1 (COL1) широко используется в качестве клейкой подложки для клеточных культур и как сотовый каркаса для регенеративных приложений. Клинически этот белок широко используется для косметической хирургии, кожных инъекций, костной пластики и реконструктивной хирургии. Источники COL1 для этих процедур, как правило, нечеловеческий, что увеличивает потенциал для воспаления и отторжения, а также передачу ксенобиотиков заболевания. В связи с этим, метод, чтобы быстро и эффективно очищать COL1 от ограниченных количеств аутогенно производных тканей бы обойти многие из этих проблем, однако стандартные протоколы изоляции являются длительными и часто требуют большого количества коллагеновых тканей. Здесь мы демонстрируем эффективную COL1 метод извлечения, который уменьшает время, необходимое для выделения и очистки этого белка от 10 дней до менее чем 3 часа. Мы выбрали дермы как нашего источника ткани из-за его доступности во многих хирургических процедур. Тего метод использует традиционные буферы экстракции в сочетании с силовым перемешивании и центробежной фильтрации, чтобы получить высоко-чистый, растворимый COL1 из небольших количеств дермы. Вкратце, кожные биопсии тщательно промывают в ледяной дН 2 O после удаления жира, соединительную ткань, и волосы. Образцы кожи лишены неколлагеновых белков и полисахаридов с использованием 0,5 М ацетата натрия и высокоскоростное Настольные гомогенизатора. Коллаген из остаточных твердых веществ впоследствии экстрагируют 0,075 М буфере цитрата натрия, используя гомогенизатор. Эти экстракты очищают, используя 100000 МВт отсечения центробежные фильтры, которые дают COL1 препараты сопоставимой или высшего качества в коммерческих продуктов или полученными с использованием традиционных процедур. Мы ожидаем, этот метод будет способствовать использование аутогенно производного COL1 для множества исследований и клинического применения.
Введение
В течение десятилетий исследователи и коммерческие поставщики выделили солюбилизированного COL1 из ассортимента тканевых источников, включая кожу и сухожилия с помощью некоторые вариации простого протокола экстракции кислотой с последующей нейтрализацией, в результате чего в ресуспендирования матрицы, организованных COL1 фибрилл, которые могут быть использованы для множества биомедицинских приложений 1-4. В то время как есть много примеров клинических приложений для COL1, некоторые из них используют аутогенно производный COL1 потому подготовка этого белка требует длительных экстракции принимая несколько дней или недель, чтобы выполнить 5-7. В результате исследований исследователи и врачи обычно используют дорогие, коммерческие препараты COL1, которые получают с помощью нечеловеческие тканей, таких как крысы, быка или свиньи дермы или с использованием кожи удалены из трупов или после обрезания мужчин. Для восстановительных приложений, многие из них изменчивости продукты выставочная с точки зрения их способности сформировать твердоеМатрицы или ткани конструкции, способные поддерживать прикрепление и рост клеток. Следовательно, существует явная необходимость в новом стандартного метода предназначены для быстрого извлечения COL1 из доступного и обильными аутологичных тканевых источников.
Такой метод позволит сэкономить время и деньги в установке исследования, где COL1 могли быть извлечены из животной модели интерес и используется для доклинических испытаний инженерных тканей, собранных на основе коллагена лесов. В то же время, имея возможность использовать быстро изолированы, аутогенно производный COL1 в клинике было бы увеличить общую безопасность для пациентов, которые могли бы получать аллогенных или ксеногенных препараты. Для пациентов, получающих autogeneic подготовку, это обтекаемый метод позволит значительно сократить интервал между сбором биопсии и коллагена применения. По этим причинам, мы стремились улучшить давние методом выделения и очистки COL1 с помощью высокоскоростного AGitation и гель-центрифугирования. Этот метод прост для выполнения с использованием стандартных буферов и оборудования, найденные во многих лабораториях. Используя высокоскоростную агитацию, наш протокол сокращает время, необходимое для выделения растворимого, кожные COL1 от примерно 10 дней до менее чем 3 часа 8. Важно отметить, что этот метод может быть легко выполнена в клинических условиях с целью подготовки аутогенно производный COL1 для использования у пациентов во время одного набора процедур.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Здесь мы продемонстрируем изоляцию COL1 от кожи ягненка. Как написано, этот протокол также может быть использован, чтобы успешно изолировать COL1 из кролика и кожи человека.
1. Подготовка Кожные пробы
- Уравновесьте все реактивы до 4 ° С до использования.
- Промыть кожной пробы (25-50 г) в ледяной дН 2 O и удалите шерсть, мех, или волосы с депиляции кремом.
- Используйте одно-край лезвия бритвы, чтобы очистить образец чистоте соединительной ткани и жира.
- Промыть образец в ледяной дН 2 O.
- Нарежьте образец кожи в 1 см х 1 см шт с одной кромки лезвия бритвы.
2. Удалить неколлагеновых солюбилизированных Материал
- Взвесить 5 г образца в 50 мл коническую трубку и добавляют 30 мл ледяной 0,5 М ацетата натрия.
- Смешайте трубки в течение 1 мин в обстановке м / 6 с использованием адаптера 50 мл трубки в настольном гомогенизатора.
- Откажитесь вирernatant и повторите в общей сложности 7 ацетата циклов стирки натрия.
- Промыть образец в ледяной дН 2 O и перемешивают один раз, чтобы удалить остаточный ацетат натрия.
- С помощью шпателя для сжатия образца по отношению к стороне трубы для удаления избытка жидкости, а затем передать на свежий 50 мл коническую пробирку.
3. Тип I коллагена Добыча
- Промыть образец дважды в 2 мл / г 0,075 М буферный цитрат натрия течение 1 мин при 6 м / сек в настольном гомогенизатора сжатия образца и отбрасывая супернатант после каждой промывки.
- Добавить свежий 2 мл / г аликвоты 0,075 М натрийцитратный буфер для образца.
- Выполните 6 последовательный 1 мин, 6 м / с циклов настольный гомогенизатор переменная агитации без удаления буфера между каждым циклом.
- Перенести толстый, прозрачного супернатанта в пробирку.
- Добавить дополнительный 1 мл / г 0,075 М буфер цитрата натрия к образцу и выполнять один заключительный Настольные гомогенизатора AGITAЦикл Тион.
- Добавить эту последнюю супернатант в пробирку.
- Центрифуга пробирку в 3200 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
- Передача супернатант в верхнем отсеке молекулярной массой 100000 отрезать центробежный фильтрующее устройство.
- Центрифуга на 3200 мкг в течение 30 мин при 4 ° С.
- Трансфер очищенного COL1 из верхнего отсека на чистую коническую трубку и хранить при 4 ° С.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол изоляции COL1 требуется около 2 ч и 15 мин для завершения. На рисунке 1 показана схема с описанием основные шаги этой процедуры. Подготовка образца и выполнения 7 циклов высокоскоростных волнений и полоскания с ацетата натрия занимает около 35 мин (1А-C). Выполнение одного агитацию и промыть цикл с немецкой шкале 2 O занимает около 5 мин (рис. 1D и 1E). Добавление цитрата натрия и подвергание данной пробы один перемешивании и полоскания с послед...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Важнейшим компонентом этого метода является повторное эффективное сжатие образца кожного для удаления избытка жидкости. Очень важно, чтобы удалить как можно больше ацетат натрия, как это возможно в шаге 2,5 путем сжатия образца. Мы используем лопаточку, чтобы уплотнить кожу от стороны трубки, однако марлю также могут быть использованы, хотя это потребует удаление образца из трубки и увеличивает время, необходимое для выполнения этих шагов. Кроме того, важно, чтобы сжимать образец на шаге 3.1, так что объем цитрата натри...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана исследовательского гранта от Национального института здоровья (HL068915 в DBC), новую награду исследователь из исследовательского фонда Thrasher (к CAP), Грант-в-помощь от Американской ассоциации сердца (12GRNT11910008 к DBC) , исследовательский грант от Детского Heart Foundation (к DBC), и пожертвования в Бостонской детской больницы сердечной проводимости фонда, Райан Family фонда, и Дэвид Pullman.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | |
| центрифугой | Beckman | J6-MI | Swing bucket ротор для размещения конических пробирок объемом 50 мл при плотности 3 200 x g. |
Ссылки
- Nageotte, J. Coagulation fibrillaire in vitro du collagène dissous dans un acide dilué. CR hebd. séances Acad. Sei. 184, 115 (1927).
- Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. Electron microscope investigation of the structure of collagen. J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).
- Choi, Y. H., et al. Cardiac conduction through engineered tissue. Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).
- Pacak, C. A., Cowan, D. B. Fabrication of myogenic engineered tissue constructs. J. Vis. Exp. (27), (2009).
- Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin. Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Seifter, S., Gallop, P. Preparation and properties of soluble collagens. Methods in Enzymology. Colowick, S., Kaplan, N. , Academic Press. NY. (1963).
- Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).
- Ohan, M. P., Dunn, M. G. Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).
- Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).
- Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study. Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).
- Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. 3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment. Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).
- Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning. Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).
- Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256. Science. 155, 1259-1261 (1967).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
