Методическая статья

ПМГК Наночастицы, образованные одним или двумя-эмульсии с витамином E-TPGS

68K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51015

⸱

27 декабря 2013 г.

 , 
1Barrow Brain Tumor Research Center, Barrow Neurological Institute

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем производство и определение характеристик наночастиц и микрочастиц, состоящих из поли(молочной-ко-гликолевой кислоты), используя витамин E-TPGS в качестве эмульгатора. Изменяя параметры рецептуры, такие как концентрация эмульгатора, можно получать наночастицы со средним диаметром от 220 нм до 1,98 мкм.

Аннотация

Поли (молочной-со-гликолевой кислоты) (PLGA) является биосовместимым членом семейства алифатический полиэфир биоразлагаемых полимеров. ПМГК уже давно является популярным выбором для доставки приложений наркотиков, в частности, так как это уже FDA утвержденных для использования в организме человека в виде рассасывающихся швов. Гидрофобные и гидрофильные лекарства заключены в ПМГК частиц через одно-или двойного эмульсии. Кратко, препарат растворяется с полимером или эмульгируют с полимером в органической фазе, которую затем эмульгировали с водной фазе. После испарения растворителя, частицы промывают и собирают путем центрифугирования для лиофилизации и длительного хранения. PLGA медленно разлагается с помощью гидролиза в водной среде, и инкапсулированные агенты высвобождаются в течение нескольких недель или месяцев. Хотя ПМГК это материал, который обладает многими преимуществами для доставки лекарств, воспроизводимое образование наночастиц может быть сложным; значительная изменчивость вводитсяИспользование различного оборудования, реагентов партии, и точный метод эмульгирования. Здесь мы описываем в деталях образование и характеристика микрочастиц и наночастиц, образованных одной или двойной эмульсии с использованием эмульгатора витамин E-TPGS. Морфология частиц и размер определяются с сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Мы предоставляем представительства изображения SEM для наночастиц, полученных с различной концентрации эмульгатора, а также примеры артефактов изображений и неудачных emulsifications. Этот протокол может быть легко приспособлены к использованию альтернативных эмульгаторы (например, поли (виниловый спирт), ПВА) или растворителей (например, дихлорметан, DCM).

Введение

Полимеры становятся все более популярными средствами доставки лекарств в последние несколько десятилетий для различных применений, начиная от таргетной терапии опухолей1 и заканчивая модуляцией иммунной системы2. Инкапсулированные в полимер или конъюгированные препараты часто более эффективны, чем их свободно доставляемые аналоги, поскольку полимер-ассоциированный препарат защищен от деградации. Эта защита приводит к более длительному биологическому периоду полувыведения и потенциально повышению эффективности с уменьшением системных побочных эффектов3-5.

Поли(молочная-ко-гликолевая кислота) (PLGA) проявляет многие из идеальных свойств наноразмерной системы доставки, обеспечивая долгосрочное высвобождение инкапсулированного агента и разлагаясь на биосовместимые продукты молочной и гликолевой кислоты. Малые молекулы, белки и нуклеиновые кислоты, инкапсулированные в PLGA, продемонстрировали повышенную активность в различных областях применения при заболеваниях8. Важно отметить, что материальная платформа облегчает настройку таких функций, как размер, заряд и отображение поверхности лигандов для нацеливания частиц на определенные ткани или для целей визуализации. Поскольку PLGA уже используется у людей в виде биоразлагаемых шовных материалов (например, Purasorb, Purac Biomaterials и Vicryl, Ethicon Inc.), потенциал клинического применения высок.

Масляно-водная (одна) или вода-масло-вода (двойная) эмульсия является одним из методов, с помощью которого PLGA может быть использована для инкапсуляции гидрофобных и гидрофильных препаратов в микро- или наноразмерную форму. Вкратце, PLGA растворяется в органической фазе (нефти), которая эмульгируется с помощью поверхностно-активного вещества или стабилизатора (воды). Гидрофобные препараты добавляются непосредственно в масляную фазу, в то время как гидрофильные препараты (вода) могут быть сначала эмульгированы с полимерным раствором до образования частиц. Всплески ультразвука высокой интенсивности способствуют образованию мелких полимерных капель. Полученную эмульсию добавляют в более крупную водную фазу и перемешивают в течение нескольких часов, что позволяет растворителю испариться. Затвердевшие наночастицы собираются и промываются центрифугированием (рис. 1).

Здесь мы описываем метод получения наночастиц PLGA с использованием одинарной и двойной эмульсии, с этилацетатом (EtAc) в качестве растворителя и витамином E-D-α-токоферолом полиэтиленгликоля сукцинатом (TPGS) в качестве эмульгирующего агента. Использование витамина Е-ТПГС имеет ряд возможных преимуществ по сравнению с другими типами стабилизирующих агентов (например, поливиниловым спиртом, ПВА), включая улучшенную эффективность эмульгирования и инкапсуляции. Другие группы сообщали о преимуществах витамина Е-ТПГС, включая ингибирование P-gp, трансмембранного белка оттока, который обычно сверхэкспрессируется на раковых клетках и, как известно, способствует устойчивости к лекарствам путем вытеснения лекарств из клеток-мишеней. Кроме того, мы демонстрируем, как определять характеристики и размеры частиц с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), а также даем дальнейшие рекомендации по изменению размера путем изменения протокола.

Протокол

1. Приготовление наночастиц

Все шаги, связанные с растворителем или растворенным/эмульгированным полимером, должны выполняться в вытяжном шкафу для химикатов.

  1. Взвесьте 100 мг (+/- 5 мг) поли(молочной-ко-гликолевой кислоты) (PLGA) и поместите в пробирку размером 13 мм x 100 мм.
  2. Перенесите 1 мл растворителя (этилацетата (EtAc) или дихлорметана (DCM)) в образец с помощью стеклянной серологической пипетки.
  3. Накройте верхнюю часть тюбика небольшим кусочком алюминиевой фольги и надежно нанесите парапленку, плотно обернув парапленку по верхнему краю флакона, а также по нижнему краю фольги.
  4. Отметьте уровень растворителя на внешней стороне пробирки. Дайте полимеру раствориться в течение ночи, добавив дополнительный растворитель на следующий день, если произойдет испарение.
    Примечание: Полимер также может быть растворен в день получения наночастиц, если это необходимо. Выполните шаги 1.1-1.3, затем сделайте вихревой на высокой мощности до полного растворения всего полимера (~10 минут).
  5. Подготовьте рабочую зону в вытяжном шкафу со следующим оборудованием/материалами рядом с ультразвуковым аппаратом: вихревым аппаратом, двумя маленькими стеклянными пипетками Пастера с резиновыми лампочками и магнитной мешалкой. Поставьте большой стакан с ледяной водой на подставку под ультразвуковым аппаратом.
  6. Добавьте 45 мл 0,3% витамина E-TPGS в стеклянный стакан объемом 200 мл с магнитной мешалкой и установите скорость перемешивания на 360 об/мин.
  7. Добавьте 2 мл 0,3% витамина E-TPGS в стеклянную пробирку размером 13 мм x 100 мм.
  8. Добавить лекарство:
    Для гидрофобных агентов: добавьте инкапсулятор непосредственно в раствор полимера (стараясь не задеть стенки пробирки) и переведите пробирку до тех пор, пока инкапсулятор не станет однородно диспергированным.
    Для гидрофильных средств: перед началом работы эмульгируйте инкапсулятор с раствором полимера. Добавьте до 50 мкл препарата в воду или буфер на поверхность полимерного раствора. Ультразвуком проводят кратковременно для эмульгирования препарата полимером (обычно 10 секунд или по мере необходимости для получения однородного, непрозрачного раствора). Этот этап ультразвуковой обработки следует выполнять на льду.
  9. Поместите полимер/герметизатор с открытой трубкой рядом с вихревым аппаратом. Держа пробирку с витамином E-TPGS вертикально и на сильном вихре, используйте стеклянную пипетку Пастера, чтобы добавить раствор полимера/инкапсулятора по каплям. Будьте осторожны, избегайте боковых сторон трубки и капайте полимерный раствор непосредственно на поверхность вихревого эмульгатора. После того, как весь 1 мл полимерного раствора был добавлен в витамин Е-ТПГС, продолжайте перемешивать раствор (теперь эмульсию) еще 15 секунд.
  10. Сразу же перенесите эмульгированный полимер в ультразвуковой аппарат. Держите пробирку погруженной в ледяную воду и обрабатывайте эмульсию ультразвуком в три раза по 10 секунд (амплитуда 40% для ультразвукового аппарата мощностью 700 Вт, 1/8 от размера наконечника щупа). Перемещайте эмульсию вверх и вниз по зонду, чтобы обеспечить равномерное ультразвуковое обработка, стараясь не касаться зонда боковыми сторонами или дном пробирки. Делайте паузы между каждыми десятью секундами, чтобы дать раствору остыть, прежде чем продолжить.
  11. Добавьте в эмульсию стеклянной пастеровской пипеткой 1-2 мл 0,3% витамина Е-TPGS из раствора для перемешивания, которая разжижает эмульгированный полимер так, чтобы он легче вылился. Высыпьте эмульсию в раствор для перемешивания. Повторите этот шаг, чтобы смыть остатки раствора из пробирки в раствор для перемешивания.
  12. Дайте наночастицам затвердеть при помешивании в течение трех часов. Если инкапсулятор светочувствительный, стакан можно обернуть алюминиевой фольгой, оставив верхнюю часть открытой для облегчения испарения растворителя.

2. Сбор наночастиц

  1. Разделите затвердевшие наночастицы на две центрифужные пробирки Oak Ridge (номинальный объем 30 мл) и сбалансируйте с точностью до 0,1 г.
  2. Центрифугирование наночастиц в роторе с фиксированным углом наклона в течение 15 мин при давлении 17 000 x g. Более длительное время центрифугирования приведет к сбору более высокой фракции более мелких наночастиц.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость, стараясь не потревожить гранулу наночастиц (вода может быть вылита или отлита пипеткой). Добавьте 15 мл diH2O и используйте ультразвуковой аппарат на водяной бане и/или вортексер для полной ресуспендирования наночастиц.
  4. Соедините содержимое двух пробирок центрифуги в одну и повторите шаги 2,1-2,3 еще 2 раза, всего три промывки в 30 мл diH2O каждый раз. Объем жидкости для ресуспензии последнего пеллетса должен составлять 4-5 мл.<бр/> Массовое соотношение 1:2 трегалоза:полимер может быть добавлено на этом этапе в качестве криопротектора (заморозьте небольшую аликвоту наночастиц без трегалозы для СЭМ-визуализации). Кристаллы льда, которые образуются в процессе замораживания, могут повреждать поверхность частиц и вызывать агрегацию, а включение трегалозы, как было показано, улучшает равномерную и полную ресуспендию наночастиц PLGA13.
  5. Переложите наночастицы в предварительно взвешенную центрифужную пробирку объемом 5 мл и заморозьте при температуре -80 °C в течение минимум 30 минут.
  6. Двигаясь быстро, чтобы не дать замороженному содержимому растаять, откройте пробирку и накройте верхнюю часть, закрепив лабораторную салфетку сверху резиновой лентой. ** Если произошло плавление, повторно заморозьте перед помещением в лиофилизатор.
  7. Лиофилизируйте 72 часа для объема 5 мл. Храните лиофилизированные частицы в обернутой парапленкой тубе при температуре -80 °C.

3. Определение размеров и морфология поверхности

Сканирующая электронная микроскопия

  1. Образцы для СЭМ должны быть подготовлены в день проведения визуализации. Поместите полоску двустороннего углеродного скотча на заглушку SEM. Перманентный маркер может быть использован для маркировки металлической части заглушки для последующего использования.
  2. С помощью металлического шпателя соберите небольшое количество лиофилизированных наночастиц и аккуратно распределите их по поверхности ленты. Смажьте поверхность огрызка лабораторной салфеткой или используйте сжатый воздух для удаления рыхлых наночастиц.
  3. Напыляем на образец золото-паладиум в течение 30-120 сек. Более длительное время распыления позволит получить более гладкую поверхность для визуализации, хотя это может привести к потере мелких деталей поверхности.
  4. Типичными параметрами для визуализации частиц являются рабочее расстояние 5-15 мм, сила луча 5-12 кВ, размер пятна 1-3. Более высокая интенсивность пучка может привести к региональному нагреву образца, что приведет к изменению морфологии поверхности частиц. Микрочастицы наблюдаются при 100-кратном увеличении, а наночастицы будут различимы при 3000-кратном увеличении.
  5. Идеальный образец должен состоять из равномерного покрытия частиц по всей плоской поверхности огрызка. Иногда вторичные структуры (включая чешуйки или сферы) могут возникать в результате лиофилизации. Сосредоточение внимания на краю чешуйки, где чешуйка встречается с лентой, или на вершине сферы, поможет найти частицы, которые можно легко визуализировать с помощью SEM. Соберите не менее трех изображений за партию, чтобы получить репрезентативную выборку размера и морфологии частиц.

Результаты

Репрезентативные СЭМ-изображения микрочастиц и наночастиц ПЛГА, приготовленных по данному протоколу, представлены на рисунках 2a и 2b. Частицы будут выглядеть как отдельные несплавленные сферы с гладкой морфологией поверхности и широким диапазоном размеров, распределенных по всему образцу.

Для определения среднего диаметра каждой партии измерения проводятся непосредственно по SEM-изображениям с использованием функции «measure» в программе ImageJ. Для получения репрезентативного распределения по размерам следует произвести не менее 150 измерений диаметра частиц, выбранных случайным образом в поле зрения. Средний размер партии частиц зависит от параметров состава. Например, в Рисунок 2aмикрочастицы (средний диаметр 730 нм ± 370) были сформированы при соотношении 1 мл растворителя на 100 мг PLGA с использованием 0,05% витамина E-TPGS в эмульгирующей фазе, тогда как в Рисунок 2bбыли сформированы наночастицы (средний диаметр 340 ± 70 нм) при использовании 4 мл растворителя на 200 мг PLGA с инкапсуляцией гидрофобного препарата камптотецина и применением 0,3% витамина E-TPGS в эмульгирующей фазе (полные параметры состава приведены в подписи к рисунку). Как правило, более высокая концентрация эмульгатора приводит к образованию более мелких частиц; при этом, варьируя концентрацию эмульгатора в диапазоне от 0,3% до 0,01%, можно достичь средних диаметров в пределах 220–2000 нм (Рисунок 3).

Наши выходы составляют 74-98% (22 партии наночастиц с различными растворителями, эмульгаторами и условиями эмульгирования, подготовленные одним экспериментатором). Более высокие выходы могут наблюдаться для более крупных (>150 nm) партий, так как мелкие наночастицы легко теряются во время центрифугирования и промывки, особенно когда супернатант сливают с осадка. Тщательное пипетирование жидкости может помочь избежать этой проблемы. Более высокие скорости и/или более длительное центрифугирование также могут увеличить выход как за счет лучшего сбора ультрамелкой фракции наночастиц, так и за счет более плотного осаждения, что снижает потери на этапе промывки. Описанный здесь протокол ориентирован на получение частиц с использованием TPGS в качестве эмульгирующего агента и EtAc в качестве растворителя, однако возможно использование альтернативных растворителей и/или эмульгаторов. В целом, мы обнаружили, что EtAc дает более мелкие и более однородные по размеру наночастицы, чем DCM (например, диаметры 540 nm±190 против 2,160 nm±1,530 для EtAc и DCM соответственно, при 100 mg/ml PLGA в растворителе, эмульгированных в 2 ml 0.1% TPGS), предположительно из-за того, что EtAc смешивается с водой, в то время как DCM — нет. PVA является популярным эмульгатором, который широко использовался нами и другими группами. Мы заметили вариабельность наночастиц, приготовленных из разных партий коммерчески доступного PVA. Поэтому для повышения воспроизводимости рекомендуется по возможности использовать одну и ту же партию PVA. По нашим данным, PVA является более эффективным эмульгатором при гораздо более высоких концентрациях, чем TPGS (например, диаметр 140 nm±48, 100 mg/ml PLGA в DCM, эмульгированных в 2 ml 5% PVA).

Характеристика наночастиц с помощью СЭМ может быть затруднена из-за различий в оборудовании и процессе визуализации. Поэтому важно отличать морфологические особенности, указывающие на проблемы с формированием частиц, от артефактов, которые непреднамеренно возникают в процессе получения изображений. На СЭМ-изображениях иногда наблюдается слияние (рисунки 4a и 4b), образование углублений (рисунок 4c) или растрескивание (рисунок 4f) частиц. Эти артефакты иногда указывают на плохо сформированные частицы (например, на рисунке 4a концентрация эмульгатора была слишком высокой для образования дискретных частиц), но также могут быть результатом артефактов, вызванных методом характеристики (например, на рисунке 4b образец нагрелся во время напыления, а на рисунке 4c локальный нагрев от пучка СЭМ изменил морфологию поверхности частиц при визуализации). Чтобы избежать артефактов визуализации, следует минимизировать время напыления и поддерживать низкую мощность пучка. При более длительном напылении наблюдается более гладкая морфология, однако это может привести к слиянию частиц. Слишком короткое время напыления может затруднить визуализацию, так как частицы будут заряжаться и перемещаться во время захвата изображения. Быстрый захват изображений поможет избежать длительного воздействия пучка и искажения снимков (рисунки 4d и 4e). Высокая экспозиция пучка также может привести к расширению и растрескиванию поверхности наночастиц (рисунок 4f). Если артефакты морфологии невозможно минимизировать путем изменения параметров характеристики, вероятно, они отражают реальные проблемы с самими наночастицами. В процессе изготовления слияние может быть результатом перегрева из-за высокой мощности ультразвуковой обработки, неполного испарения растворителя, неполного ресуспендирования на этапе промывки или неудачной лиофилизации.

Процесс разделения масла и воды; соникация, испарение, сбор; схема лиофилизации.
Рисунок 1. Схема изготовления наночастиц. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Структура наночастиц (СЭМ) и распределение по размеру (μm, nm), график сравнительного анализа.
Рисунок 2. СЭМ-изображения и соответствующие распределения по размеру микрочастиц и наночастиц PLGA, полученных методом простой эмульсии. На (A) частицы были сформированы путем эмульгирования 100 mg PLGA, растворенного в 1ml этилацетата, в 2 ml 0,05% Vitamin E-TPGS с последующим отверждением в 45 ml 0,01% Vitamin E-TPGS. Соответствующее распределение по размеру показано на (C). На (B) частицы были сформированы путем эмульгирования 200 mg PLGA и 40mg камптотецина, растворенных в 4mL этилацетата, в 4 ml 0,3% Vitamin E-TPGS с последующим отверждением в 90 ml 0,3% Vitamin E-TPGS. Соответствующее распределение по размеру показано на (D). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Анализ размера частиц; столбчатая диаграмма и СЭМ-изображения показывают влияние % TPGS на размер микросфер.
Рисунок 3. Размер частиц зависит от концентрации эмульгатора. Увеличение концентрации Vitamin E-TPGS привело к уменьшению размера наночастиц. Представлены средние диаметры и соответствующие СЭМ-изображения частиц, приготовленных путем эмульгирования 100 mg PLGA, растворенного в 1 ml этилацетата, в (A) 0.01%, (B) 0.05%, (C) 0.1% или (D) 0.3% Vitamin E-TPGS с последующим отверждением в 45 ml 0.3% Vitamin E-TPGS. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение 200 измерений диаметра, выполненных по 2 изображениям одной серии. Масштабная линейка соответствует 5 μm (A-C) и 200 nm (D).Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

СЭМ-микрофотография, демонстрирующая морфологию и агрегацию частиц. Анализ микроструктуры порошка.
Рисунок 4. Артефакты морфологии поверхности, наблюдаемые при СЭМ. На изображении (A) по всему образцу наблюдалось сильное сплавление и наличие листоподобных структур. Концентрация Vitamin E-TPGS была слишком высокой (1%) для формирования дискретных частиц. На изображении (B) некоторые области образца были сплавлены, однако присутствовали крупные скопления дискретных наночастиц, особенно там, где были пропуски в напылении. Мы полагаем, что эти артефакты сплавления вызваны нагревом в процессе напыления. На изображении (C) частицы изначально казались гладкими, однако длительное воздействие пучка СЭМ привело к появлению ямок и сморщиванию. На (D) представлено изображение с низким разрешением, полученное при минимальном воздействии пучка СЭМ на образец; частицы выглядят гладкими с округлой морфологией. На (E) тот же образец подвергался воздействию в течение более длительного времени, и наблюдается явное искажение их первоначальной морфологии. На (F) длительное воздействие пучка при высоком напряжении (12 kV) вызвало нагрев и растрескивание частиц. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Обсуждение

Частицы PLGA обычно получают с помощью одинарной или двойной эмульсии, метода, который обеспечивает возможность настройки характеристик частиц, таких как размер, инкапсулятор и свойства поверхности7. Эти и другие свойства зависят от многих переменных, включая тип растворителя, соотношения подаваемых материалов, метод эмульгирования и тип эмульгатора. Однако, по нашему опыту, один экспериментатор может получить частицы с постоянными свойствами. Используя тот же протокол, хорошо обученный экспериментатор получил семь отдельных партий наночастиц со следующими средними диаметрами: 317 нм±99, 342 нм±112, 298 нм±104, 361 нм±110, 339 нм±115, 360 нм±123 и 364 нм±110. Усреднение партий хорошо обученного экспериментатора дает средний диаметр 340 нм±25 и среднее стандартное отклонение внутри партии 110 нм±8. Второй экспериментатор, обученный первым, использовал тот же протокол для получения наночастиц со средним диаметром 328 нм±138. Однако третий экспериментатор, который в течение нескольких месяцев создавал наночастицы самостоятельно, следовал тому же протоколу для получения наночастиц со средним диаметром 220 нм±70. Таким образом, можно получить частицы с ожидаемым диапазоном диаметров, но это зависит от точного воспроизведения тонкой экспериментальной техники. Объединение партий может позволить производить большие количества наночастиц с идентичными агрегатными свойствами. Например, когда мы модифицируем поверхность наночастиц для исследования in vitro или in vivo , несколько (до 6) партий по 200 мг подготавливаются, промываются, собираются, смешиваются в одну пробирку, а затем разделяются для поверхностной модификации. Это гарантирует, что размер наночастиц, загрузка препарата, заряд и фракция поверхностных участков, доступных для модификации, будут сопоставимы между двумя группами обработки. В другом примере, если интересующей нас переменной является эффективность препарата при загрузке различных агентов в разные партии наночастиц, важно измерять и контролировать вариабельность загрузки лекарственного препарата. Крайне важно, чтобы свойства частиц измерялись для каждой партии производимых частиц, а также разрабатывались и проводились эксперименты для контроля вариабельности от партии к партии.

Полная эмульсия органической и водной фаз имеет решающее значение для образования мелких частиц. Поливиниловый спирт (ПВА) является, пожалуй, наиболее часто используемым эмульгатором. Мы и другие использовали различные эмульгирующие и стабилизирующие агенты, включая витамин E-TPGS9, PVA14, spans15 и полоксамеры16 (подробное обсуждение широкого спектра агентов, используемых для производства частиц PLGA, см. в обзоре Wischke et al.17). Правильно эмульгированный полимер будет выглядеть как однородный, молочно-белый/непрозрачный раствор. Плохая (или «сломанная») эмульсия будет демонстрировать макроскопическую неоднородность или зернистость, и она может даже разделиться на два визуально различимых слоя в трубке. Как правило, это указывает на неспособность образовывать наночастицы. Эмульсия может разорваться после шага 1.9, если ее немедленно не передать на ультразвуковое устройство. Если это произошло, вортекс еще раз до однородности и сразу приступайте к ультразвуковой обработке. Разделение не должно происходить после стадии ультразвуковой обработки (1.10). После того как частицы диспергируются в большем объеме воды (шаг 1.11), раствор должен быть равномерно непрозрачным или слегка полупрозрачным. Прозрачность будет увеличиваться по мере уменьшения размера частиц, а для очень мелких наночастиц может наблюдаться синий оттенок. Этот оттенок может не наблюдаться, если частицы инкапсулируют лекарственное средство. Если эмульсия не может равномерно диспергироваться в большом водном объеме или кажется зернистой, эксперимент не следует проводить. Нормально наблюдать некоторую вариацию внешнего вида гранулы частицы, а также ее сцепления. Некоторые гранулы могут ресуспендировать при слабом вихре, в то время как другие могут занять несколько минут ультразвуковой обработки на водяной бане. Повторная суспензия не должна занимать более 5 минут. Лиофилизированные частицы могут иметь различные текстуры от хлопчатобумажных до сыпучих.

Одним из многих преимуществ PLGA в качестве материала для наночастиц является возможность оптимизации процесса изготовления для создания частиц желаемого размера для предполагаемого применения. Более крупные наночастицы будут инкапсулировать более высокую долю гидрофобного препарата (по отношению к весу полимера), чем мелкие наночастицы, однако кинетика высвобождения лекарства также может быть затронута18-20. Размер наночастиц оказывает непосредственное влияние на механизмы интернализации частиц клетками, а также на их распределение в тканях, что может привести к существенным различиям в эффективности доставки. Например, система мононуклеарных фагоцитов будет помечать и удалять агенты в системном кровотоке размером более 1 мкм. Маленькие наночастицы могут представлять интерес для прямой инфузии в мозг, где более крупные наночастицы будут захвачены в плотном внеклеточном матриксе; Доставка небольших наночастиц также может способствовать пассивному нацеливанию на опухоли за счет усиленного эффекта проникновения и удержания. Эффективность инкапсуляции лекарственного средства варьируется в широких пределах, в зависимости от свойств конкретного препарата, размера частицы и эмульгатора (т.е. его растворимости в воде по сравнению с растворителем). Одинарная или двойная эмульсия также влияет на нагрузку препарата и размер наночастиц. Инкапсуляция гидрофобных агентов с помощью одинарной эмульсии может помочь в производстве сверхмалых наночастиц по сравнению с методом двойной эмульсии. Мы отсылаем читателя к другим ресурсам для обширного обсуждения данной темы23-28. Наконец, существуют альтернативные методы эмульгирования, включая высокоскоростную гомогенизацию, и эти другие подходы могут обеспечить преимущества для конкретных типов лекарственных препаратов или применений их доставки29.

Метод с использованием одной эмульсии дает возможность варьировать широкий спектр переменных состава, каждая из которых способна изменять свойства наночастиц. Например, использование дихлорметана (DCM) в качестве растворителя обычно приводит к получению более крупных наночастиц с более широким распределением по размерам. Поскольку этилацетат (EtAc) смешивается с водой, поверхностное натяжение полимерной капли в первичной эмульсии уменьшается, что приводит к образованию наночастиц меньшего размера. DCM может быть заменен на тот же объем EtAc. Альтернативные растворители или смеси растворителей могут быть использованы для оптимизации инкапсуляции лекарственных средств и свойств частиц. Другие параметры рецептуры также способны изменять размер частиц: например, увеличение объема растворителя, соотношения растворитель:полимер, интенсивности ультразвуковой обработки или скорости/продолжительности центрифугирования приведет к уменьшению размера собранных частиц. Фракционирование частиц можно определять по размеру путем последовательного центрифугирования (например, быстрого центрифугирования на низкой скорости для удаления сначала более крупных частиц, а затем более длительного вращения для сбора сверхмелких частиц) или фильтрации.

В данной работе мы описываем параметры рецептуры, которые позволяют получать частицы PLGA со средним диаметром от 220 нм до 1,98 мкм. Эти методы получения частиц, состоящих из PLGA, могут быть использованы для оптимизации конструкции частиц (размер, инкапсулятор и свойства поверхности) для будущего применения в области доставки лекарственных средств in vitro или in vivo.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

У авторов нет никаких благодарностей.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Поли(молочная-со-гликолевая кислота)  (PLGA)figure-materials-1 LactelB6010-2PСобственная вязкость: 0.55-0.75 dl/g
Этилацетат (EtAc)Sigma270989
Дихлорметан (DCM)
Витамин E TPGSSigma57668
Поливиниловый спирт87-89% гидролизованный, 30,000-70,000 Da
Оборудование
Ультразвуковой дезинтеграторFisher ScientificModel 705700 W (Ультразвуковой гомогенизатор)
Наконечник соникатораFisher Scientific1/8 in
ВортексVWR58816-121
Многопозиционная магнитная мешалкаCorningMP5I
УльтрацентрифугаBeckman-CoulterL8-80M
Ротор с фиксированным угломBeckman-Coulter50.2TI
Ультразвуковая водяная баняFisher ScientificFS30
ЛиофилизаторMillrockBT85

Ссылки

  1. Peer, D., et al. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nat. Nanotechnol. 2, 751-760 (2007).
  2. Jiang, W., Gupta, R. K., Deshpande, M. C., Schwendeman, S. P. Biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microparticles for injectable delivery of vaccine antigens. Adv. Drug Deliv. Rev. 57, 391-410 (2005).
  3. Haag, R., Kratz, F. Polymer therapeutics: Concepts and applications. Angew. Chem. 45, 1198-1215 (2006).
  4. Tong, R., Cheng, J. Anticancer polymeric nanomedicines. Polym. Rev. 47, 345-381 (2007).
  5. Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surf. B Biointerfaces. 75, 1-18 (2010).
  6. Anderson, J. M., Shive, M. S. Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres. Adv. Drug Deliv. Rev. 28, 5-24 (1997).
  7. Jain, R. A. The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) devices. Biomaterials. 21, 2475-2490 (2000).
  8. Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: An overview of biomedical applications. J. Control. Rel. 161, 505-522 (2012).
  9. Mu, L., Feng, S. S. A novel controlled release formulation for the anticancer drug paclitaxel (Taxol): PLGA nanoparticles containing vitamin E TPGS. J. Control. Rel. 86, 33-48 (2003).
  10. Mu, L., Feng, S. S. PLGA/TPGS nanoparticles for controlled release of paclitaxel: effects of the emulsifier and drug loading ratio. Pharm. Res. 20, 1864-1872 (2003).
  11. Collnot, E. M., et al. Vitamin E TPGS P-glycoprotein inhibition mechanism: influence on conformational flexibility, intracellular ATP levels, and role of time and site of access. Mol. Pharm. 7, 642-651 (2010).
  12. Dintaman, J. M., Silverman, J. A. Inhibition of P-glycoprotein by D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS). Pharm. Res. 16, 1550-1556 (1999).
  13. Zhou, J., et al. Highly-penetrative, drug-loaded nanocarriers improve treatment of glioblastoma. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. , (2013).
  14. Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The uptake and intracellular fate of PLGA nanoparticles in epithelial cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
  15. Niwa, T., Takeuchi, H., Hino, T., Nohara, M., Kawashima, Y. Biodegradable submicron carriers for peptide drugs: Preparation of dl-lactide/glycolide copolymer (PLGA) nanospheres with nafarelin acetate by a novel emulsion-phase separation method in an oil system. Int. J. Pharm. 121, 45-54 (1995).
  16. Ameller, T., et al. Polyester-poly(ethylene glycol) nanoparticles loaded with the pure antiestrogen RU 58668: physicochemical and opsonization properties. Pharm. Res. 20, 1063-1070 (2003).
  17. Wischke, C., Schwendeman, S. P. Principles of encapsulating hydrophobic drugs in PLA/PLGA microparticles. Int. J. Pharm. 364, 298-327 (2008).
  18. Batycky, R. P., Hanes, J., Langer, R., Edwards, D. A. A theoretical model of erosion and macromolecular drug release from biodegrading microspheres. J. Pharm. Sci. 86, 1464-1477 (1997).
  19. Panyam, J., et al. Polymer degradation and in vitro release of a model protein from poly(D,L-lactide-co-glycolide) nano- and microparticles. J. Control. Rel. 92, 173-187 (2003).
  20. Siepmann, J., Faisant, N., Akiki, J., Richard, J., Benoit, J. P. Effect of the size of biodegradable microparticles on drug release: Experiment and theory. Journal of Controlled Release. 96, 123-134 (2004).
  21. Desai, M. P., Labhasetwar, V., Walter, E., Levy, R. J., Amidon, G. L. The mechanism of uptake of biodegradable microparticles in Caco-2 cells is size dependent. Pharm. Res. 14, 1568-1573 (1997).
  22. Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Mol. Pharm. 5, 505-515 (2008).
  23. Barichello, J. M., Morishita, M., Takayama, K., Nagai, T. Encapsulation of hydrophilic and lipophilic drugs in PLGA nanoparticles by the nanoprecipitation method. Drug Dev. Ind. Pharm. 25, 471-476 (1999).
  24. Mundargi, R. C., Babu, V. R., Rangaswamy, V., Patel, P., Aminabhavi, T. M. Nano/micro technologies for delivering macromolecular therapeutics using poly(d,l-lactide-co-glycolide) and its derivatives. J. Control. Rel. 125, 193-209 (2008).
  25. Niwa, T., Takeuchi, H., Hino, T., Kunou, N., Kawashima, Y. Preparations of biodegradable nanospheres of water-soluble and insoluble drugs with D,L-lactide/glycolide copolymer by a novel spontaneous emulsification solvent diffusion method, and the drug release behavior. J. Control. Rel. 25, 89-98 (1993).
  26. Yang, Y. Y., Chia, H. H., Chung, T. S. Effect of preparation temperature on the characteristics and release profiles of PLGA microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction/evaporation method. J. Control. Rel. 69, 81-96 (2000).
  27. Yang, Y. Y., Chung, T. S., Ping Ng, N. Morphology, drug distribution, and in vitro release profiles of biodegradable polymeric microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction/evaporation method. Biomaterials. 22, 231-241 (2001).
  28. Zhang, Z., Feng, S. S. The drug encapsulation efficiency, in vitro drug release, cellular uptake and cytotoxicity of paclitaxel-loaded poly(lactide)-tocopheryl polyethylene glycol succinate nanoparticles. Biomaterials. 27, 4025-4033 (2006).
  29. Astete, C. E., Sabliov, C. M. Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 17, 247-289 (2006).
  30. Gaumet, M., Gurny, R., Delie, F. Fluorescent biodegradable PLGA particles with narrow size distributions: Preparation by means of selective centrifugation. Int. J. Pharm. 342, 222-230 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи