Методическая статья

Оптимизированный протокол для цельной подготовки сетчатки к визуализации и иммуногистохимии

DOI:

10.3791/51018

⸱

13 декабря 2013 г.

 ,  ,  , 
1Ophthalmology, Weill Medical College of Cornell University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь протокол предназначен для структурной оценки цельного препарата сетчатки. Это включает в себя описание диссекции тканей, монтаж на мембранную вставку из гидрофилизированного политетрафторэтилена (ПТФЭ), болюсную нагрузку флуоресцентными маркерами и сравнение фиксации с карбодиимидом и параформальдегидом для иммуногистохимического анализа клеточных и синаптических компонентов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа с нежными тканями может быть осложняющим фактором при проведении иммуногистохимической оценки. Здесь мы представляем метод, в котором используется гидрофилизированная мембрана из ПТФЭ с кольцевой опорой для обеспечения структурной поддержки как живой, так и неподвижной ткани во время иммуногистохимической обработки, что позволяет использовать различные протоколы, которые в противном случае вызвали бы повреждение ткани. Во-первых, это демонстрируется на примере болюсной загрузки флуоресцентных маркеров в живую ткань сетчатки. Этот метод позволяет быстро визуализировать целевые структуры, в то время как мембранная опора сохраняет целостность тканей во время инъекции и позволяет легко перенести препарат для дальнейшей визуализации или обработки.

Во-вторых, описана процедура окрашивания антителами в ткани, зафиксированной карбодиимидом. Несмотря на то, что фиксация параформальдегида встречается чаще, фиксация карбодиимида обеспечивает превосходный субстрат для визуализации синаптических белков. Ограничением карбодиимида является то, что полученная неподвижная ткань относительно хрупка; Однако это преодолевается с помощью поддерживающей мембраны. Ткань сетчатки используется для демонстрации этих методов, но они могут быть применены к любой хрупкой ткани.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выполнение иммуногистохимии в нежных интактных тканях сопряжено с риском повреждения во время обработки и переноса. Это может произойти либо в срезах мозга, либо в других тонких тканях, таких как дегенерированная сетчатка. Кроме того, существуют определенные методы фиксации тканей, которые могут быть полезны для иммуноокрашивания нейронных структур, но приводят к нарушению структурной стабильности, что исключает их использование. Частным примером этого является фиксация на основе карбодиимида, которая лучше всего подходит для окрашивания рецепторов и гормонов1-7, но обычно избегается из-за нестабильности фиксированной ткани.

Здесь мы описываем процедуру, в которой используется гидрофилизированная мембрана из ПТФЭ для структурной поддержки нежной ткани, как неподвижной, так и нефиксированной, для различных методов окрашивания. Поддерживающая мембрана позволяет проводить манипуляции с нежными тканями до и после фиксации, что позволяет выполнять несколько этапов обработки при минимизации риска повреждения тканей. В целом, этот простой метод сохранения целостности тканей дает возможность использовать методы, которых в противном случае можно было бы избежать. Таким образом, этот подход также может быть успешно использован для получения широкого спектра тканей, таких как срезы мозга, которые становятся хрупкими после процедур среза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во всех экспериментальных процедурах животные лечились в соответствии с правилами Заявления ARVO по использованию животных в офтальмических и зрительных исследованиях и в соответствии с протоколами, утвержденными Медицинским колледжем Вейля Корнелла. Животных усыпляли углекислым газом и последующим вывихом шейки матки.

1. Рассечение сетчатки

  1. После того, как мышь будет усыплена, энуклеируйте ее глаза и поместите их в насыщенный кислородом HEPES-буферизованный раствор Рингера (табл. 1).
  2. Удалите роговицу, разрезав маленькими ножницами по круговой дорожке вдоль ora пильчатой, придерживая глаз в лимбе щипцами. Вытащите линзу с помощью щипцов.
  3. Удалите как можно больше стекловидного тела с помощью щипцов с тупыми краями. Этот шаг важен для болюсных инъекций и электрофизиологической записи; В этом нет необходимости при проведении только иммуногистохимии.
  4. Отсоедините сетчатку от наглазника, расположив щипцы между сетчаткой и наглазником, медленно перемещая щипцы по окружности. Стабилизируйте наглазник, крепко удерживая склеру вторым комплектом щипцов. Разрежьте зрительный нерв в месте между сетчаткой и наглазником, чтобы облегчить отделение сетчатки от наглазника.
  5. Сетчатка может быть рассечена на части (например, четвертинки) или использоваться как единое целое. Чтобы разрезать на кусочки, с помощью ножниц сделайте разрезы от периферии сетчатки до зрительного нерва. В качестве альтернативы, чтобы задействовать всю сетчатку, сделайте разрезы от периферии на полпути к зрительному нерву. Надрезы помогут сделать плоскую подготовку.

2. Монтаж на мембранную вставку из гидрофилизированного ПТФЭ

  1. Подготовьте мембрану, как описано ниже. Когда проводятся физиологические записи или эксперименты с впрыском красителя, укорачивайте держатель с помощью токарного станка или ручной пилы так, чтобы оставшееся кольцо имело высоту 1 мм.<бр/> Примечание: Вставки культуральных пластин могут быть как немодифицированными, так и модифицированными (Рисунок 1A). Выбор конфигурации продиктован целью эксперимента. Для иммуноокрашивания подойдет немодифицированный вкладыш.
  2. Шероховатые поверхности отшлифовать мелкой (зернистостью 300 или выше) наждачной бумагой.
  3. (По желанию) Снимите ножницы под кольцом.
  4. Чтобы удалить мусор, промойте или проработайте мембрану ультразвуком в дистиллированной воде в течение 2-3 минут.
  5. Закрепите салфетку на мембране (рисунок 1A). Поместите ткань с небольшим раствором поверх мембраны с помощью пластиковой пипетки для переноса. При необходимости отрежьте узкий кончик пипетки, чтобы образец ткани не прилип к пипетке во время переноса.
  6. Приложите сетчатку ганглиозными клетками (ГК) вверх: на мембране постепенно удаляйте раствор, одновременно раздвигая сетчатку и разворачивая складки щипцами.
  7. На противоположной стороне мембраны поместите пустой шприц (1 мл) непосредственно под ткань. Применяйте отсасывание, оттягивая поршень назад до объема 0,2-0,3 мл. Увеличьте площадь поверхности всасывания, разрезав удерживающий кончик шприца перед использованием. Ткань не требует дальнейшего лечения адгезии, так как она физически запутана в мембране.

3. Болюсная инъекция изолектина Alexa 488

  1. Приготовьте патч-пипетки и раствор для окрашивания. Вытягивайте патч-пипетки из боросиликатного капиллярного стекла с помощью съемника Flaming/Brown с сопротивлением ~1 МОм. Аккуратно сломайте кончик пипетки.
  2. Приготовьте окрашивающий раствор, добавив 0,3 мкл стокового раствора изолектина Alexa 488 к 10 мкл HEPES-буферизованного раствора Рингера, описанного в шаге 1.2.
  3. Перенесите образец в установку патч-зажима для инъекции (рисунок 1C). Поместите мембрану с прикрепленной тканью в записывающую камеру, перфузированную подогретым (37 °C) и насыщенным кислородом HEPES-буферным раствором Рингера.
  4. Приложите пипетку, содержащую краситель, к внутренней пограничной мембране (ILM, рисунок 2A). С помощью микроманипулятора далее продвигайте пипетку против ILM до тех пор, пока она не проникнет в него. Впрыскивают окрашивающий раствор под давлением 10-20 фунтов на квадратный дюйм в течение 1 секунды с помощью пикоспритцера. Одно или несколько мест могут быть нацелены на инъекцию (рисунок 2B). Если пикоспритцер недоступен, можно использовать шприц объемом 10 мл для подачи положительного давления воздуха для инъекции.
  5. Инкубируйте введенную ткань в течение 10 минут. Во время инкубации введенную ткань можно рассмотреть при эпифлуоресцентном освещении.
  6. После мечения препарат можно отнести к микроскопу для визуализации. Перенесите вкладыш в чашку для культуры со стеклянным дном, положив сетчатку вниз (рисунок 1C).
  7. Добавьте каплю раствора HEPES, чтобы образец оставался влажным.
  8. Поместите 2-3 пятна вакуумной смазки по периметру пластикового кольца, чтобы надежно закрепить вставку на дне чашки для культуры.
  9. Перенесите чашку на предметный столик для микроскопа.

4. Фиксация параформальдегида и карбодиимида

  1. Зафиксируйте образец, переложив вставку в фиксатор на 15 мин. В зависимости от применения можно использовать более или менее длительное время фиксации. Оба фиксатора могут быть эффективно использованы для фиксации GFP, изолектина или флуоресцентных гидразидов Alexa (например, используются для заполнения клеток в записях патч-клэмпа).
    Примечание: Для фиксации можно использовать либо 4% растворы карбодиимида, либо 4% параформальдегида. Для сохранения адгезии фиксацию следует проводить после того, как ткань уже была прикреплена к мембране. Ткань может быть зафиксирована сразу после монтажа или после физиологической регистрации и/или болюсной инъекции.
  2. Промойте салфетку в фосфатном буфере (ПБ) в течение 30 минут. После этого ткань может быть обработана либо целиком (шаг 5), либо разрезана на вертикальные участки, а затем обработана (этапы 6 и 7).

5. Иммуноокрашивание сетчатки

  1. В 24-луночной чашке (рис. 1D) заблокируйте кусочки сетчатки на мембране на 1 час в красящем растворе.
  2. Мышиные первичные антитела к PSD-95 развести в соотношении 1:300 в окрашивающем растворе и нанести на 48 ч при комнатной температуре в темноте. Добавьте ~100-150 мкл раствора антитела в каждую лунку с тканью. Чтобы не допустить пересыхания, неиспользуемые лунки заполняйте дистиллированной водой.
  3. Полоскать в течение 20 минут в PB, 3x.
  4. Инкубировать в течение 24 часов в ослином антимышином вторичном антителе Alexa 568, растворенном в 1:500 в окрашивающем растворе.
  5. Полоскать в течение 20 минут в PB, 3x.
  6. Поместите вкладыш с испачканной тканью в стандартную чашку Петри диаметром 3 см, заполненную раствором ПБ. С помощью маленьких ножниц вырежьте из кольца часть мембраны, содержащую сетчатку.
  7. Перенесите сетчатку на мембрану на слайд сетчатки вверх. Снимите PB, добавьте монтажный материал. Поместите небольшие кусочки разбитого защитного стекла между предметным стеклом и защитными стеклами, чтобы избежать сильного сдавливания и повреждения сетчатки. Установите покровную крышку.
  8. Заклейте покровное стекло лаком для ногтей. Храните горки в темноте, в холодильнике.

6. Вертикальное срезирование ткани, прикрепленной к мембране

  1. После фиксации погрузите ткань на мембране в градиентные растворы сахарозы из 10%, 20% и 30% сахарозы на 30 мин, 1 ч и на ночь соответственно. Ночной этап выполняется при температуре 4 °C в холодильнике, все остальные этапы при комнатной температуре.
  2. С помощью ножниц снимите мембрану с салфеткой из пластикового кольца-вставки.
  3. Поместите отрезанную мембрану на парапленку сетчаткой вверх и удалите как можно больше раствора с помощью салфеток Kimwipes.
  4. Поместите парапленку с салфеткой в криостатную камеру и добавьте каплю ОКТ-среды. Используйте устройство быстрой заморозки для ускорения заморозки.
  5. Отсоедините замороженный образец и переверните его.
  6. Отрежьте лишнюю замороженную ОКТ. Оставьте примерно 2 мм вокруг образца с трех сторон, и оставьте 5-6 мм от той стороны, которая будет крепиться к держателю.
  7. Накройте открытую сторону сетчатки (мембранную сторону) каплей ОКТ. Оставьте место прикрепления свободным.
  8. Заморозьте мембрану с тканью сетчатки. Теперь образец готов к размещению на держателе для резки.
  9. Поместите каплю ОКТ на кольцо держателя холода. Сразу же вставьте замороженный образец в каплю.
  10. Срезы имеют толщину 10-20 мкм, установив температуру криостата -19 °C. Используйте теплые (комнатной температуры) адгезионные стекла из полизина. Оставьте слайды с прикрепленными секциями на нагревательной платформе на ~2-3 минуты (41 °C) в темноте, чтобы обеспечить прочное сцепление секций.
  11. Поместите предметные стекла в коробку для хранения и держите при температуре -20 °C до использования.

7. Иммуноокрашивание срезов сетчатки

  1. Достаньте горки с секциями из морозилки. Дайте им постоять при комнатной температуре 1 минуту, чтобы удалить конденсат.
  2. Обведите секции блокиратором жидкости, чтобы создать барьер для дальнейшей инкубации.
  3. Поместите предметные стекла в инкубационный бокс. Залейте дно коробки водой, чтобы предотвратить испарение раствора антитела.
  4. Промыть PB в течение 5 минут.
  5. Приготовьте те же растворы для окрашивания и выполните действия, как в пункте 5. Инкубация с первичным антителом происходит в течение ночи, а со вторичным - 1 час. Не используйте битое стекло между покровным стеклом и предметным стеклом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь продемонстрированы два репрезентативных эксперимента, которые выигрывают от использования гидрофилизированной мембраны из ПТФЭ для поддержки всей сетчатки во время процедур окрашивания. Первый эксперимент иллюстрирует метод быстрой и простой характеристики сосудистой сети сетчатки, сложной сети кровеносных сосудов, которые охватывают несколько слоев сетчатки (рис. 2). Этот подход сочетает болюсную загрузку изолектина с иммерсионным мечением с СРЗ. Это эффективный метод маркировки живых тканей, кото...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокая биосовместимость и прозрачность растворов мембраны из гидрофилизированного фторопласта является преимуществом при работе с живыми тканями. Этот препарат был успешно использован в более ранних работах для патч-клэмпинговых регистраций световых откликов8-10. В этой статье мы покажем, как этот подход может быть использован для структурного анализа всей сетчатки.

Техника болюсной нагрузки может быть эффективно использована для маркировки живых тканей. Этому методу способствует с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом NIH R01-EY020535 (B.T.S), Международным фондом исследований сетчатки и Фондом Карла Кирхгесснера (B.T.S.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Вкладыш для клеточных культур Millicell, 12 мм,
гидрофильный ПТФЭ (биопора), 0,4 мкм; m		MilliporePICM01250
Инсулиновый шприц, 1 млBeckton Dickinson309659
НожницыFine Science Tools15003-08препарирование
щипцами, Dumont #55, inoxFine Science Tools11255-20диссекция
CryostatLeicaразличные
конфокальные микроскопы системыNikonразличные
капиллярные стеклаWorld Precision Instruments1B150F-4
P-97 Flaming/Brown Micropipette PullerSutter Instrument Co.
Picospritzer IIIParker Hannifin
Стеклянное дно Тарелки для культурыMatTek CorporationP35G-0-14-C
Чашка ПетриFalcon1008
Одноразовые градуированные трансферные пипеткиVWR16001-180
Multiwell plates, 24-луночныеBeckton Dickinson351147
Защитное стекло, #1Электронная микроскопия Sciences72200-30
Предметные стекла адгезии полисинусаЭлектронная микроскопия Sciences63412-01
Предметные стекла для микроскопаGlobe1301
Блокатор жидкостиЭлектронная микроскопия Sciences71312
Монтажная среда VECTASHIELDVector LaboratoriesH-1000
OCT mediumSakura4583
Парапленка лабораторная пленкаFisher13-374-10
Dow Corning высоковакуумная смазкаSigma-AldrichZ273554
Mouse anti-PSD95MilliporeMABN68антитело
Donkey anti-mouse Alexa 568InvitrogenA10037антитело
Isolectin Alexa 488InvitrogenI21411
ХемиблокаторChemicon2170S
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
СульфогодаминSigma-Aldrich341738
карбодиимидThermo Scientific22980EDC
параформальдегидSigma-AldrichP6148

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Csaba, G., Kovacs, P., Pallinger, E. EDAC fixation increases the demonstrability of biogenic amines in the unicellular Tetrahymena: a flow cytometric and confocal microscopic comparative analysis. Cell Biol. Int. 30, 345-348 (2006).
  2. Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstatter, J. H., Wassle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
  3. Gastinger, M. J., O'Brien, J. J., Larsen, N. B., Marshak, D. W. Histamine immunoreactive axons in the macaque retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 487-495 (1999).
  4. Haverkamp, S., Wassle, H. Immunocytochemical analysis of the mouse retina. J. Comp. Neurol. 424, 1-23 (2000).
  5. Koulen, P., Fletcher, E. L., Craven, S. E., Bredt, D. S., Wassle, H. Immunocytochemical localization of the postsynaptic density protein PSD-95 in the mammalian retina. J. Neurosci. 18, 10136-10149 (1998).
  6. Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nat. Methods. 6, 139-141 (2009).
  7. Tymianski, M., et al. A novel use for a carbodiimide compound for the fixation of fluorescent and non-fluorescent calcium indicators in situ following physiological experiments. Cell Calcium. 21, 175-183 (1997).
  8. Sagdullaev, B. T., Eggers, E. D., Purgert, R., Lukasiewicz, P. D. Nonlinear interactions between excitatory and inhibitory retinal synapses control visual output. J. Neurosci. 31, 15102-15112 (2011).
  9. Toychiev, A. H., Sagdullaev, B., Yee, C. W., Ivanova, E., Sagdullaev, B. T. A time and cost efficient approach to functional and structural assessment of living neuronal tissue. J. Neurosci. Methods. 214, 105-112 (2013).
  10. Yee, C. W., Toychiev, A. H., Sagdullaev, B. T. Network deficiency exacerbates impairment in a mouse model of retinal degeneration. Front Syst. Neurosci. 6, 8(2012).
  11. Ivanova, E., Muller, U., Wassle, H. Characterization of the glycinergic input to bipolar cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 23, 350-364 (2006).
  12. Dmitrieva, N. A., Strang, C. E., Keyser, K. T. Expression of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors by bipolar, amacrine, and ganglion cells of the rabbit retina. J. Histochem. Cytochem. 55, 461-476 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Retinal Whlemount PreparationImmunohistochemical StainingCarbodiimide FixationFluorescent Marker LoadingTissue StabilizationMembrane Support TechniqueSynaptic Protein ImagingRetinal Tissue PreparationFluorescence MicroscopyCryostat Sectioning

Похожие статьи