Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изоляция и характеристика химерных человеческих fc-выражать протеины используя протеин Адсорберы мембраны и обтекаемый рабочий процесс

6.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51023

⸱

8 января 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University, 2Biomedical Engineering Program, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University, 3Department of Dermatology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

По сравнению с традиционной хроматографией сродства с использованием белка агароза бисероубитарные колонки, мембранные адсорберы белка A могут значительно ускорить лабораторно-масштабную изоляцию антител и других фрагмент-экспрессионных белков Fc. Надлежащие методы анализа и количественной оценки могут еще больше ускорить обработку белка, что позволит завершить изоляцию/характеристику за один рабочий день, а не за 20 часов работы.

Аннотация

Лабораторный масштаб до промышленной очистки биомолекул от супернатантов клеточной культуры и лизированных клеточных растворов может быть выполнен с помощью хроматографии сродства. Хотя сродство хроматографии с использованием пористого белка Агароза бисер упакованы в колонки, возможно, наиболее распространенным методом лабораторного масштаба изоляции антител и рекомбинантных белков, выражают Fc фрагменты IgG, это может быть трудоемким и дорогостоящим процессом. Время и финансовые ограничения особенно огромны в небольших базовых научных лабораториях, которые должны восстановить сотни микрограммов до миллиграммовых количеств белка из разбавленных растворов, но не имеют доступа к системам доставки жидкостей высокого давления и/или персоналу, опыту в биоразделение. Кроме того, количественная оценка и характеристика продукции могут также чрезмерно удлинять время обработки в течение нескольких рабочих дней и завышать расходы (расходные расходы, заработная плата и т.д.). Таким образом, быстрый, недорогой, но эффективный протокол необходим для лабораторной изоляции масштаба и характеристики антител и других белков, обладающих фрагментом Fc. С этой целью мы разработали протокол, который может быть завершен ограниченным опытом технического персонала менее чем за 9 часов (примерно один рабочий день) и так же быстро, как 4 часа, в отличие от традиционных методов, которые требуют 20 часов работы. Большинство необходимого оборудования легкодоступно в стандартных биомедицинских науках, биохимии и (био) лабораториях химической инженерии, и все реагенты доступны на коммерческой основе. Чтобы продемонстрировать этот протокол, репрезентативные результаты представлены, в которых химерин галектин-1 сливается с человеком Fc (Gal-1hFc) из клеточной культуры супернатант был изолирован с помощью белка мембраны AdSorber. Очищенный Gal-1hFc был количественно оценен с помощью ускоренной процедуры анализа западного blotting и характеризовался использованием цитометрии потока. Оптимизированный рабочий процесс может быть изменен для других белков, выражаюющих Fc, таких как антитела, и/или изменен для включения альтернативных методов количественной оценки и характеристики.

Введение

Изоляция антител и рекомбинантных белков, выражаюющих иммуноглобулин G (IgG) Fc фрагменты из клеточной культуры supernatants и разбавления облизатических клеточных растворов может быть достигнуто с помощью белка сродство хроматографии. В фундаментальных научно-технических лабораториях и промышленности, колонны упакованы с пористым белком Агароза, стекло, или полимерные бусы чаще всего используются для сродства хроматографии, несмотря на высокие финансовые затраты и длительноевремя обработки 1-3. Это хорошо оценили, что сродство хроматографии представляет собой крупнейший счет и обработка узкое место в лабораторных ипромышленных условиях 2,4. В результате, многочисленные улучшения были разработаны для снижения затрат и времени обработки без ущерба для общего восстановления продуктаот процесса поезд 1,2,5-7. Особенно перспективным для изоляции антител и других белков, выражаюющих Fc, является сродство хроматографии с использованием белка мембраны А adorber2,5,7-10. В то время как fc захвата в колонке хроматографии диффузии ограничено(т.е. Fc-экспрессии белка должны диффузии в и через внутренние поры, чтобы достичь большинства белка А) с высоким давлением падение по всей колонке, массовый транспорт в мембранных адсорберов приводит к массовой конвекции, в результатечего избежать диффузии ограничения 8,9,11,12. Кроме того, падение давления через мембрану adorber является низким, что позволяет быстрее перфузии скорости потока по сравнению с бисером упакованыколонны 8,9,11,12. Таким образом, для изоляции лабораторных масштабах, мембранная хроматография, по прогнозам, сократит время изоляции на несколько часов и увеличит улавливание продукта по сравнению с колонкой хроматографии. Кроме того, математические модели для IgG adorption в мембранных адсорбенахбыли предложены 8,9,11,12, что позволяет конечных пользователей прогнозировать производительность в лаборатории.

Еще одним узким местом в фундаментальных научно-технических лабораториях является характеристика белка Fc-expressing. Тем не менее, выбор соответствующих методов для завершения анализа характеристик, таких западных помарки, может значительно сократить время, затученные на тестирование продукта. Например, полудровый переход в прерывистой буферной системе может выполнить электрофоретический перенос белков из геля SDS-PAGE в мембрану поливинила дифторидина (PVDF) в считанные минуты, в отличие от 1-2 часов в баке (мокрый) передачи в непрерывной буфернойсистеме 13.

Быстрый, недорогой и эффективный протокол, чтобы изолировать и охарактеризовать химерный синтез белка, выражаюго Fc фрагмент человека IgG описывается здесь. Большинство оборудования легкодоступно в стандартных базовых биомедицинских науках, биологии, химии и (био) лабораториях химической инженерии, и все реагенты доступны на коммерческой основе. Хотя репрезентативные результаты были получены в результате изоляции и характеристики murine galectin-1/human Fc химерного белка синтеза (Gal-1hFc), обтекаемый протокол может быть применен к изоляции других молекул, обладающих фрагментом Fc, таких как антитела, сами фрагменты Fc или другие белки синтеза Fc. Наши улучшения значительно сократили время обработки (всего за 4 часа, но, как правило, на 9 часов, по сравнению с 20 часами работы) при одновременном достижении аналогичного или улучшенного восстановления продукта по сравнению со стандартными методами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Проверить сродство к белку А

  1. Убедитесь, что белок Fc-экспрессии (рекомбинантный синтез белка или IgG антитела, до сих пор называют "белок") имеет приемлемоесродство к белку 14-17 до использования белка мембраны AdSorber, и тест на наличие белка в фондовом растворе(например, клеточной культуры супернатант, уточненный центрифугации на 1000 х г гранул для гранул). Использование цитометрии потока, западной blotting, ELISA и т.д.. для обнаружения белковой функции и/или присутствия Fc, на основе лабораторных предпочтений. В идеале, количественно белка в клеточной культуре супернатант (шаг 6), чтобы избежать превышения белка мембраны adorber потенциала. Продолжайте, если обнаружен белок.

2. Подготовка белка Membrane Adsorber и клеточной культуры Supernatant

  1. Следуйте инструкциям производителя по подготовке мембранного асорбера. Никогда не позволяйте воздуху проникать в мембранный асорбер. Все растворы, пронизанные мембранным асорбером, должны быть при комнатной температуре и предварительно профильтрованы с помощью фильтра 0,22 мкм. Заполните 10 мл шприца с 0,22 мкм фильтрованных фосфатов Dulbecco буфера солевого раствора (DPBS) или буфер выбора и разряда пузырьков воздуха. Perfuse DPBS, чтобы удалить решение для хранения и уравночные мембраны adorber непосредственно перед использованием.
  2. Фильтровать супернатант клеточной культуры непосредственно перед перфузией через мембранный асорбер, используя вакуумный блок стерильной фильтрации на 0,22 мкм.

3. Загрузите белок мембранный асорбер

  1. Аспират клеточной культуры супернатант в шприц Luer Lock (30 мл или больше), и разрядить любые пузырьки воздуха.
  2. Сборка материалов и оборудования, как показано на рисунке 1. Подключите шприц к входу мембранного асорбера. Прикрепите гибкую трубу к мембранной розетке adorber. При желании поместите фильтр шприца 0,22 мкм между шприцем и мембранным асорбером. Используйте колбу или бутылку, чтобы поймать поток через (также известный как фильтрат), от adsorber.
  3. Установите шприц-насос до нужной скорости потока, но не превышает рекомендуемую производителем скорость потока(например, 10 мл/мин). Perfuse клеточной культуры супернатант через мембрану adorber, собирая поток через в стакане или другом контейнере. Перезагрузить шприц с необходимыми супернатантами.
  4. При желании проверьте поток на наличие белка с использованием цитометрии потока, западного blotting, ELISA и т.д.. на основе лабораторных предпочтений. Как правило, нет необходимости повторно использовать поток до конца.

4. Белок Элюта из Мембраны Адсорбер

  1. Вымойте мембранный асорбер 10 мл DPBS, чтобы удалить любой несырь белка.
  2. Белок элюта из мембранного асорбера при желаемой скорости потока (например, 1 мл/мин) с использованием 10-15 мл буфера элюции (например, буфер на основе амина (рН 2,8)). Поймать элуат в трубке, содержащей нейтрализующий буфер (например, 1 М Трис (рН 9,4)) при 10% объема элюции (1,0-1,5 мл).
  3. Кроме того, элютовый белок в одном мл шагом в трубки, содержащие 100 мкл буфера нейтрализации, используя общий объем 10-15 мл элюционного буфера. Используйте предпочтительный метод характеристики, чтобы проверить каждую фракцию на наличие белка.
  4. Регенерировать мембранный асорбер в соответствии с инструкциями производителя. Перелить 10 мл 0,22 мкм фильтрованных DPBS или буфер выбора, то 10 мл 0,22 мкм фильтруется 50 мм NaOH в 1 N NaCl, и, наконец, 10 мл 0,22 мкм фильтруется DPBS. Заполните мембранный асорбер 20% этанола в DPBS для длительного хранения при 4 oC.

5. Концентрат и диализ белка

  1. Депозит все элуат (или элюционные фракции, содержащие белок, определяемый в шаге 4.3) в 10 kDa молекулярного веса отрезанных центробежных фильтров единицы. Следуйте инструкциям производителя по центрифугации.
  2. Диализировать ретентат в небольшом блоке диализа объема (10 kDa молекулярного веса отрезания) против буфера выбора, следуя инструкциям производителя. Буфер, возможно, потребуется добавить в обезличеный материал, если белковые осадки вызывают озабоченность. При желании диализный материал можно хранить в холодильнике до 6-го шага, но длительное хранение без консервантов не рекомендуется.

6. Количественная оценка и характеристика очищенного продукта в ускоренной западной процедуре Blotting

  1. Разрешить очищенный белок и Fc стандартов на гель выбора SDS-PAGE, в условиях сокращения или необразования пожеланию 18-20. Используйте мини-гель, а не миди гель, чтобы свести к минимуму время работать.
    1. Если еще не известно, определите диапазон стандартов Fc, по которому сигнал диапазона изменяется линейно по отношению к количеству загруженных(например, 0,1-1 мг). Используйте тот же гель, условия работы, условия передачи и реагенты, которые будут использоваться для количественной оценки и характеристики очищенного белка.
    2. Загрузите несколько образцов очищенного белка, включая образцы, разбавленные DPBS, чтобы убедиться, что сигналы очищенной белковой полосы находятся в линейном диапазоне сигналов стандартов Fc при анализе изображений.
  2. Передача белков из геля в мембрану поливинилидена фтора (PVDF) в прерывистой буферной системе с использованием полудрого пятна13, следуя инструкциям производителя блоттера. Время передачи обычно 5-10 мин. При желании, Coomassie пятно гель после передачи для проверки эффективности передачи21.
  3. Выполните иммуноблотинг с анти-Fc или анти-IgG конъюгированных щелочной фосфатазы (AP) или хрена пероксидаза (HRP), на основе лабораторных предпочтений, используя вакуумную систему обнаружения белка. Иммуноблоттинг время, как правило, менее 1 часа.
  4. Разработка иммуноблот с использованием субстрата и метода выбора(например, субстрат AP и повышенная химилюминесценция).
  5. Количественная оценка очищенного белка с помощью анализа изображений. Выполните линейную регрессию на сигналах полосы от стандартов Fc. Если R2>0,90, используйте уравнение для линии для расчета количества белка из сигнала полосы (ы). При необходимости учитывать разбавление образца. Так как количественная оценка белка выполняется на основе Fc, корректировать значение молекулярных различий в весе между белком и Fc. Если R2<0.90, повторите шаг 6 в полном объеме.
  6. Проверка белка с использованием функциональных анализов или методов для обнаружения Fc через поток цитометрии, западной blotting, ELISA и т.д.. на основе лабораторных предпочтений.
  7. Разбавить белок до нужной концентрации и/или добавить любые желаемые консерванты или стабилизаторы в очищенный белковый раствор перед алицитированием для длительного хранения, замороженных или иных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оптимизированный протокол для изоляции и характеристики Fc-экспрессирующих белков обычно используется для обработки химерин-галектин-1, слитый с человеческим Fc (Gal-1hFc) из разбавленных супернатантов клеточной культуры. Диаграмма потока на рисунке 2 иллюстрирует рабочий процесс и время для каждого шага в протоколе. Для типичной партии 300 мл супернатанта, общее время обработки составляет около 9 часов, когда проводится дополнительное цитометрия потока фракций elution. Если весь анализ цитометрии потока...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, описанный в этом, был разработан для быстрой изоляции и характеристики химерного синтеза белка, выражаюго человека Fc (Gal-1hFc), без существенного ущерба для восстановления продукта или завышения стоимости. Ключевыми компонентами обтекаемого рабочего процесса являются белок мембранный асорбер для изоляции, а также полудрый перенос и вакуумный иммуноблотирование для характеристики западными блоттингами.

Резкое сокращение времени обработки для изоляции и характеристики Gal-1hFc с 300 ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Раскрывать нечего.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить г-на Луиса Ф. Дельгадильо (департамент химической и биомолекулярной инженерии, Университет Огайо), г-на Мэтью Х. Уильямса (департамент химической и биомолекулярной инженерии, Университет Огайо) и д-ра Филиберто Седено-Лорана (Brigham and Women's Hospital и Harvard Medical School) за экспертную техническую помощь. Авторы также хотели бы поблагодарить Зимой 2011 CHE 404/BME 504 и осень 2012 CHE 4830/BME 5830 студентов (Департамент химической и биомолекулярной инженерии и биомедицинской инженерной программы, Университет Огайо) за технические консультации и обсуждения. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (NSF) Основные исследования инструментов грант CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Дерматология Фонд исследований Грант A050422 (SRB), Национальные институты здравоохранения (NIH) NCI грант 1R15CA161830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Постдокторская стипендий F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD), и NIH NCCAM грант R01AT004628 (CJD).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Мембранный адсорбер протеин А (Sartobind Protein A 2 мл)Sartorius-Stedim93PRAP06HB-12--A Центробежный
фильтр Amicon Ultra, 10 кДа, 4 млMilliporeUFC801008Используйте объем 15 мл при необходимости
Стерильный вакуумный фильтрующий блок, 0,22 &; m, 500 млMilliporeSCGPU05RE
10 мл Шприцы с наконечниками Luer LockBD301604
30 мл Шприцы с наконечниками Luer LockBD309650
Лабораторные трубки Tygon (1/16 дюйма x 1/8 дюйма x 50 футов)Cole ParmerWU-95903-16
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO)Thermo Scientific69576
Snap i.d. лоток для сбора антителEMD MilliporeWBAVDABTR
Snap i.d. однолуночный блот-держательEMD MilliporeWBAVDBH01
элюционный буферThermo Scientific21004
Tris, ультрачистыйFisher Scientific819623
хлорид натрияFisher Scientific7647-14-5
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
DPBSThermo ScientificSH30028.02
DPBS с Ca2+/Mg2+Life Technologies14080-055
BSASigmaA9647
Human FcBethyl Research LaboratoriesP80-104
Anti-human Fc-APCJackson Иммуноисследования109136170
Античеловеческий Fc-APBio-Rad170-5018
Щелочной фосфатазный субстратPromegaS3841
Проточные цитометрические пробирки (5 мл полистирола или полипропилена)BD352054
Шприцевой насосHarvard Apparatus55-2226Также приемлем перистальтический насос
Белковый гель система электрофорезаBio-Rad Laboratories552BR094876Любая система гель-электрофореза приемлема, но мини-гелевые системы работают быстрее всего
Semidry blotterBio-Rad Laboratories690BR006163Любая система переноса приемлема, но прерывистые системы переноса выполняют электрофоретический перенос быстрее
всего SNAP i.d. вакуумная система обнаружения белкаEMD MilliporeWBAVDBASEНа смену этому конкретному инструменту пришла модернизированная модель, но любой из них должен работать так же хорошо

Ссылки

  1. Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
  2. Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
  3. Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
  4. Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
  5. Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
  6. Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
  7. Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
  8. Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
  9. Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
  10. Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
  11. Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
  12. van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
  13. Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
  14. Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
  15. Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
  16. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
  17. Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
  18. Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
  19. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  20. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
  21. Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
  22. Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
  25. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
  26. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
  27. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  28. Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Изоляция и характеристика химерных человеческих fc-выражать протеины используя протеин Адсорберы мембраны и обтекаемый рабочий процесс
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.