Подход Вазелин разрыв отключения открытым используется для получения низких шумовых записи ионных и стробирования токов от потенциал-зависимых ионных каналов, выраженных в Xenopus ооциты с высоким разрешением быстрой кинетики канала. С небольшим изменением, зажим напряжение флюометрия может быть соединен с протоколом ооцитов вырезом открыт.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ооцит Вазелин разрыв отключение открытой (CoVG) техника зажим напряжения позволяет для анализа электрофизиологических и кинетических свойств гетерологичных ионных каналов в ооцитов. Записи от установки бортового открытым особенно полезны для решения малых токов величина литниковые, быстрого ионной активации текущий и дезактивацию. Основные преимущества над двухэлектродной зажима напряжения (TEVC) техники включают повышенную скорость зажим, улучшение соотношения сигнал-шум, и способность модулировать внутриклеточной и внеклеточной среде.
Здесь мы используем человеческий канал сердечная натрия (HNA V 1.5), выраженную в Xenopus ооцитах, чтобы продемонстрировать настройку бортового открытым и протокол, а также изменения, которые необходимы, чтобы добавить зажим напряжение возможность флуорометрии.
Свойства быстрых активирующих ионных каналов, таких как HNA V 1,5, не могут быть полностью решены около комнатной температуре с использованием TEVC, в whicч полнота ооцита мембраны зажимается, что делает контроль напряжения трудно. Однако, в технике вырезом открыт, выделение только небольшой части клеточной мембраны позволяет быстро зажима, необходимого, чтобы точно записать быструю кинетику, предотвращая канала краткое изложение, связанное с методами патч зажима.
В сочетании с техникой CoVG, ионных каналов кинетики и электрофизиологические свойства могут быть дополнительно анализировали с помощью напряжения зажим флуорометрии, где движение белок отслеживается с помощью цистеина конъюгации внеклеточно, применяемых флуорофоров, вставка генетически кодируемых флуоресцирующих белков, или включения неприродных аминокислот в интересующей области 1. Это дополнительные данные дает кинетическую информацию о потенциал-зависимых конформационных перестроек белка через изменения в микросреды, окружающей флуоресцентные молекулы.
Введение
Специализированный методы напряжение зажимные разрешить запись ионных токов при контролируемых мембранных потенциалов. Широко используется двухэлектродной зажим напряжения (TEVC) и методы патч зажим обеспечивают надежную электрофизиологические информацию о свойствах многих ионных каналов. Тем не менее, оба этих метода имеют свои недостатки, которые препятствуют приобретению надежных данных для быстрых напряжения натриевых каналов и других каналов быстро активирующих в мембранах, таких как те, из Xenopus ооциты. В Безания и Стефани лаборатории следовательно разработана методика Вазелин разрыв зажим напряжения бортового открытым (CoVG) для ооцитов 2.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Начальная настройка оборудования
- Поместите сцену и микроэлектродной манипулятор в системе вибрации изоляции (например таблицы воздуха) с окружающей клетки Фарадея для предотвращения электрического и механического шума.
- Припой шесть Ag / AgCl гранул к длинам шестидюймовыми от 24 AWG провода. Для одного из этих длин (для подключения к P1), соединение в второй проволоки, чтобы сформировать "Y". На концах каждого провода припаять золотую BNC штифт, который входит с усилителем.
- Подключите пять Ag / AgCl гранулы спаянные до 24 AWG провода к headstage Ванна / Guard (P1, P2, CC, GS1 и GS2). Подключите «я» Ag / AgCl окатышей на "I" h....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 4 показывает изменение проницаемости ооцита в виде раствора сапонина применяется к нижней части ооцита. Рисунок 5 демонстрирует скорость обмена внутриклеточного раствора путем диффузии следующее сапонина проницаемости. 20-40 мин обязаны прийти к стационарной 2,18.
На фиг.6А показаны следы, полученные из протокола записи. На рисунке показано, ионные токи (после вычитания P/-8 утечки) в ответ на протоколе напряжения (вставка.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Ооцит Вазелин техника напряжение на промежутке зажим отключение открытой позволяет быстро разрешения данных, низкий уровень шума, возможность постоянного контроля за внутренним решением и внешнего состава раствора, и стабильные записи над относительно длинных протоколов 19. Эти преимущества этого метода установлено отдельно от стандартной двухэлектродной зажима напряжения и методов патч зажима. Хотя специализированное оборудование требуется и протокол относительно трудно, очень немногие проблемы возникают, ко.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Все члены Вашингтонского университета в Сент-Луисе Сердечная молекулярной инженерии Lab. Берроуз Здравствуйте фонд Карьера премии в Научно-интерфейс - 1010299 (с JS).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Внешний раствор | Номер в | каталоге | [Окончательный], вес или объем |
| N-метил-D-глюкамина (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 25mM |
| MES Натриевая соль | Sigma-Aldrich | M5057 | 90mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Гидроксид кальция | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES Гидрат | Sigma-Aldrich | M8250 | переменный (pH до 7,4) |
| Внутренний раствор | |||
| N-метил-D-глюкамин (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 105mM |
| MES Натриевая соль | Sigma-Aldrich | M5057 | 10mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH до 7,4) |
| Деполяризующий раствор | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 110mM |
| Магния хлорид | Sigma-Aldrich | M8266 | 1,5mM |
| Кессон хлорид кальция | C021 | 0,8 мМ | |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 10 мМ |
| раствор | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 3М |
| раствор | |||
| Сапонин | Sigma-Aldrich | 47036 | 0,125 г |
| внутренний См | . выше | 50 мл | |
| Агар Мост Раствор | |||
| (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 100 мл 1М |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 1,2 г |
| MES Гидрат | Sigma-Aldrich | M8250 | вариативный (pH до 7,4) |
| Гранулированный агар | Исследовательские продукты Международный | A20250 | 3% |
| NMDG Storage Solution | |||
| NMDG, HEPES, MES Гидратный раствор | см. выше | 40 мл | |
| Вода | 60 мл | ||
| Название материала/оборудования | Номер компании в каталоге Комментарии | /описание | |
| Высокопроизводительный зажим для ооцитов | Dagan | CA-1B | |
| Система сбора данных | Axon CNS | Digidata 1440A | |
| Осциллограф | Tektronix | TDS 210 | |
| APC | Регулятор | ||
| Dagan | HCC-100A | ||
| ПК | Dell | Optiplex 990 | |
| pCLAMP 10.3 Напряжение Clamp Программное обеспечение | Molecular Devices, LLC | pCLAMP10.3 | |
| TMC Настольная платформа для контроля вибрации | TMC | 64 SERIES | |
| TMC Стол для контроля вибрации | TMC TMC | 20 | |
| V1/I Электродный коллектор данных | Dagan | часть CA-1B | |
| MX10L Микроманипулятор | Siskiyou | MX10L | |
| Ванна/защита (I/V) Головной стол (с соответствующими разъемами) | Dagan | часть CA-1B | |
| Микроскоп | Omano | OM2300S-JW11 | |
| Термостат Ванна | Custom или Dagan Custom или Dagan | Custom или HE-204C | Кастомная камера, изготовленная из материалов из холодных полимеров (серия D). Dagan также предоставляет предварительно подготовленную ступень (HE-204C). |
| Изготовленный на заказ контейнер для пеллет AgCl | Custom | Изготовленный | на заказ |
| Ag/AgCl электрод, гранулы, 2,0 мм | Warner | E-206 | |
| External Oocyte | Bath Custom или Dagan | Custom или CC-1-T-LB | Изготовленный на заказ или купленный у Dagan |
| Internal Oocyte Bath | Custom или Dagan | Custom или CC-TG-ND | Изготовленный на заказ или приобретенный у Dagan |
| Капилляры для агаровых мостиков и тянутых электродов | Warner | G150T-4 | |
| Вращающиеся крепления для микроскопа, микроманипулятора и ванны | Siskiyou | SD-1280P | |
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner | LMI-600 | |
| Обычный отбеливатель | Clorox | 470174-764 | |
| Xenopus laevis Ооциты | Nasco | LM535M (половозрелые самки) | |
| 90 Na+ Внешнее решение | См. лист | ||
| 10 Na+ Внутренний раствор | См. лист | ||
| 3 M KCL | См. лист | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| NMDG Storage Solution | |||
| Переносные пипетки объемом 5 мл | SciMart | GS-52 | |
| Модифицированный инжектор электродов KCl | BD | 309659 | Пластиковый наконечник шприца расплавлен для впрыска раствора в электроды. В качестве альтернативы можно приобрести Microfil от WPI. |
| Microvaccum | Custom | Custom Leverps | |
| VWR | 63040-458 | ||
| Инструменты для работы с ооцитами (пипетка) | VWR | 53502-222 | |
| Бутылка для брызг с деионизированной водой | VWR | 16649-911 | |
| Вазелин Вазелин | Fisher Scientific | 19-086-291 | |
| Дополнительные материалы, необходимые для записи VCF: | |||
| Микроскоп | VCF Nikon | Eclipse FN1 | |
| Nikon CFI APO 40XW NIR объектив | Nikon | N40X-NIR | |
| X-Y Транслятор система для вертикальных микроскопов с фиксированной ступенью | Sutter Instruments | MT500-586 | |
| Внешний VCF Ооцитовая ванна | на заказ | Изготовлен на заказ. Размеры камеры составляют 2,7 х 1,9 х 0,4 см. | |
| Внутренняя ванна для ооцитов VCF | на заказ | изготовлена на заказ. Размеры камеры составляют 1,6 х 1,6 х 0,4 см. | |
| Модифицированная термостатическая ванна | Custom | Custom камера изготовлена из материалов из холодных полимеров (серия D). Размеры камеры модифицированной ванны с регулятором температуры составляют 2,7 x 1,9 x 0,3 см для горизонтальной камеры и 1 x 2,5 x 0,5 см для вертикальной камеры. |
Ссылки
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).
- Stefani, E., Bezanilla, F. Cut-open oocyte voltage-clamp technique. Methods Enzymol
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
