Методическая статья

Тканевая инженерия: Строительство многоклеточного 3D строительные леса на поставки слоистых сотовых листов

DOI:

10.3791/51044

⸱

3 октября 2014 г.

 ,  , 
1School of Engineering, University of California, Merced

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для создания высокоорганизованных структур сложной ткани необходимо собрать несколько материалов и типов клеток в единый композит. Этот комбинаторный дизайн включает в себя специфичные для органа слоистые клеточные листы с двумя различными биологически полученными материалами, содержащими прочную волокнистую матриксную основу, и эндотелиальные клетки для усиления образования новых сосудов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие ткани, такие как взрослых человеческих сердцах, не в состоянии адекватно восстановить после повреждений. 2,3 Стратегии тканевой инженерии предложить инновации, чтобы помочь организму в восстановлении и ремонте. Например, TE подходы могут быть в состоянии ослабить ремоделирования сердца после инфаркта миокарда (ИМ) и, возможно, увеличить общий функцию сердца к почти нормальной предварительно МП уровня. 4 Как и в любой функциональной ткани, успешной регенерации сердечной ткани предполагает своевременную доставку множество различных типов ячеек с внешним стимулам в пользу интеграции и выживания имплантированной клеточной / тканевой трансплантат. Инженерные ткани должны обратиться нескольких параметров, включая: растворимые сигналы, клетки к клетке взаимодействия и матричные материалы оцениваются как средств доставки, их влияние на выживаемость клеток, прочность материала, и оказанию организации клетки к ткани. Исследования, использующие прямой впрыск привитых клеток только игнорировать эти важные элементы. 2,5,6Дизайн ткани сочетая эти ингредиенты до сих пор не разработаны. Здесь мы приведем пример интегрированных конструкций с использованием наслоение узорчатыми клеточных листов с двумя различными типами биологических полученных материалов, содержащих тип орган клеток цель и эндотелиальные клетки для повышения новое образование сосудов в "ткани". Хотя эти исследования сосредоточены на генерации сердца, как ткани, эта конструкция ткань может быть применен к другим, чем сердце с минимальными дизайна и существенных изменениях, многих органов, и предназначается, чтобы быть вне-полки продукт для регенеративной терапии. Протокол содержит пять детальные шаги. Чувствительны к температуре поли (N -isopropylacrylamide) (pNIPAAM) используется для покрытия чашках для тканевых культур. Затем конкретной ткани клетки культивировали на поверхности с покрытием пластин / micropattern поверхностей с образованием клеток листы с сильным боковым спаек. В-третьих, базовая матрица создается для ткани путем объединения пористую матрицу с неоваскулярной Permissiве гидрогели и эндотелиальные клетки. Наконец, клеточные листы поднимаются из блюд в pNIPAAM покрытием и переносили в базовом элементе, в результате чего полное конструкцию.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инъекция клеток и/или отдельных материалов сама по себе показала переменный успех в других системах органов и ограниченный успех в регенерации сердца. 5,7-12 В настоящее время клетки, полученные из стволовых клеток, доставляются в поврежденную ткань с использованием различных методов доставки, включая: прямую инъекцию клеток в ткань и перфузию в кровоток. 13-17 Другие имплантируют только клетки, материалы отдельно и/или в сочетании с материальными носителями, чтобы помочь регенерации поврежденных органов. 18-21 Эта конструкция сочетает в себе несколько стратегий, которые обеспечивают прочность материала, структурирование из нескольких материалов и несколько типов ячеек.

В частности, основание ацеллюляризованного волокнистого матрикса обеспечивает основную физическую прочность конструкции, делая ее пригодной для наложения швов на пациента, если это необходимо. Пустые пространства в базовом матриксе заполнены эндотелиальными клетками в неоваскулярном пермиссивном гидрогеле22 для быстрого установления васкуляризации имплантированной конструкции. Затем этот композит интегрируется с предварительно структурированными клеточными листами, которые обеспечивают улучшенную межклеточную коммуникацию, более точно имитируя нативную ткань. 1,23-25 Общий процесс производства слоистого клеточного пятна описан на блок-схеме на рисунке 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 Создание Плиты pNIPAAM покрытием

  1. Растворить 2,6 г pNIPAAM в 2 мл 60% толуола / 40% раствора гексана.
  2. Смесь нагревают до 60 ° С в течение 10 мин с перемешиванием, до тех пор, pNIPAAM не растворится.
  3. Вырезать фильтровальную бумагу в 60 мм круга диаметром и бумагу в воронке Бюхнера.
  4. Фильтр решение через воронку Бюхнера в предварительно взвешенный стеклянный стакан (не использовать пластик, как гексан будет оплавление пластмассовых деталей).
  5. Стакан помещают и содержание под колокольню вакууме (24 фунтов на квадратный дюйм) O / N (16 ч). Примечание: До остаток не взаимодействует с изопропил он будет окислять поэтому убедитесь, что он не вступает в контакт с кислородом.
  6. Взвесьте стакан установить вес pNIPAAM.
  7. Добавить изопропиловый спирт в pNIPAAM, создавая 50/50 вес / вес раствора.
  8. Поместите 2 мл раствора на поверхности планшета для культуры ткани, и слой в течение 5 мин в УФ-свете.
  9. Промыть пластины с 2 мл теплой PBS в два разаПеред использованием в клеточной культуре.

2 Создание Сотовые листы

Примечание: Сотовые листы для первичных клеток органа-мишени могут быть созданы с использованием ряда различных методов, или путем нанесения культуры ткани поверхностей с термо-полимера реагируют, как описано здесь. Предварительно покрытых термочувствительных пластин предлагают также ряда поставщиков.

Примечание: Этот протокол является для культуры с использованием 35 мм блюдо. Вкратце, клетки сначала инкубировали при 37 ° С в течение не менее 24 ч при слиянии установить боковые соединения между соседними ячейками. Чтобы освободить сотовые листы, плиты подвергаются воздействию температур ниже 32 ° C. Ячейка лист затем переносили в сильной базовой волокнистой матрицы, содержащей неоваскулярной разрешающий гидрогель с эндотелиальными клетками сосудов.

  1. Изолировать клеточной популяции. Примечание: Этот метод зависит от индивидуальных процедур вывода и типа клеток. Крыса аорты гладкая муSCLE клетки (RASMC) используются в данном примере. Эти первичные клетки гладкой мускулатуры, выделенные из брюшной аорты крысы.
  2. Промывают клетки 2 мл теплого PBS.
  3. Добавить 3 мл трипсина (или другого раскалывания / диссоциации раствора) к клеткам в течение 5 мин.
  4. Блокировка трипсина путем добавления 3 мл культуральной среды, или фосфатного буферного раствора (PBS), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
  5. Собирают клетки в коническую пробирку и считать аликвоту.
  6. Спин клеток при 1000 оборотов в минуту (228 мкг) в течение 5 мин.
  7. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в их питательной среды (SmGM2 плюс пуля комплект питательная среда используется для RASMC).
  8. Поместите носителей, содержащих клетки на 35 мм термочувствительной пластины - пластины, покрытой pNIPAAM в концентрации, которая будет достичь 100% слияния. Примечание: RASMCs, что число было установлено, что 100 000 клеток / см 2. Тем не менее, в связи с потерей клеток во время прохождения, 120% от этой VA LUE используется.
  9. Поместите в инкубатор при 37 ° CO / N. Примечание: Важно, чтобы поддерживать клетки при 37 ° С, чтобы поддерживать клеточную адгезию к пластине.

3 Получение Учредительном Matrix

Примечание: Различные 3D волокнистые матрицы могут быть использованы в слой волокнистой матрицы сильное между тонкими листами клеток. Вот несколько примеров: Gelfoam, биостекло, природные acellularized материалы 26 или nanospun материалов 27,28 свиной матрица мочевого пузыря (UBM) используется в этих исследованиях был щедро обеспечена от нашей сотрудника, доктора Badylak 29.

  1. Перед использованием определения характеристик матрицы включая отсутствие клеточной содержания, если используется матрица decellularized, 27,28 конкретных жизнеспособность клеток, а пустое пространство. 22
  2. Обрежьте предварительно стерилизуют в матрицу желаемого размера и формы. Примечание: Здесь, перфорации используется для резки диаметром 4 мм круг.
ve_title "> 4. посевные эндотелиальных клеток в неоваскулярных Permissive гидрогеля

Примечание: Эндотелиальные клетки могут быть получены из различных источников, в том числе дифференциации из стволовых клеток или клеток-предшественников. Здесь HUVECs используются.

  1. Используйте любой разрешительный гидрогель (фибрин, коллаген гели), если сшивающего время является достаточно коротким, чтобы позволить клеткам оставаться жизнеспособным. Примечание: Здесь Гиалуроновая кислота (ГК) на основе гель сшитой с дисульфидный мостик используется.
  2. Подготовьте гидрогель HA в соответствии с протоколом компании.
  3. Соберите эндотелиальные клетки и разогнать в одном решении клеток с использованием 1x трипсин. Примечание: Accutase или клеточной диссоциации буфера также могут быть использованы для одного дисперсии клеток.
  4. Отключение фермента трипсина с использованием такого же количества ингибитора трипсина сои (если это важно, что клетки не вступают в контакт с сывороткой) или 10% FBS в PBS, сбор раствора / клеток в 15 мл коническую трубку.
  5. Cр а ф клетки, и рассчитать объем необходимой для размеров патч (ранее количественно). Примечание: Для 4 мм патча, используются здесь 2000000 эндотелиальные клетки.
  6. Выписка 2000000 клетки, и поместите в новый 15 мл коническую трубку.
  7. Отжим при (228 мкг) в течение 5 мин.
  8. Аспирируйте супернатант, оставляя клетки в виде гранул в конической трубе.
  9. Смешать жидкие материалы HA и желатин в 1: 1 рационе. Затем добавляют 80% от общего объема в коническую пробирку, содержащую осадок.
  10. Ресуспендируют эндотелиальные клетки в 1: 1 HA / смесь желатина
  11. Поместите приостановленные клетки в смеси HA / желатина в базовой волокнистой матрицы со стадии 2.
  12. Добавить 1/5 (20 процентов) от общего объема требуемой из сшивающего агента
  13. Инкубировать в течение 1 часа при 37 ° С.

5 Выделение Сотовые листы

  1. Снимите 35 мм pNIPAAM обращению пластин, содержащих ячейки из инкубатора и место в капот культуре клеток приRT.
  2. Быстро аспирации СМИ из клеток, и добавьте 2 мл 6% нормальной желатина, который был нагрет до 37 ° С.
  3. В то время как желатин еще теплый, разместить кристаллической решетки металла в желатин, погружая его ниже поверхности нормальной желатина (Видео 1).
  4. Поместите всю плиту на льду в течение 5 до 7 мин, позволяя желатин, чтобы укрепиться.
  5. После 7 мин, используют шпатель, чтобы тщательно отделить желатиновые края со стороны пластины, а затем с помощью щипцов для подъема решетки металла от пластины Примечание: 6% желатина, и клетка лист должен снять с решеткой.
  6. Перемещение клеток листа в чашку и поместить поверх базовой волокнистой матрицы-гидрогель комбинации, тщательно установив решетку в верхней части конструкции. Примечание: верхушечный сторона ячейки листа по-прежнему будет в верхнем положении.
  7. Добавить 2 мл теплой СМИ (37 ° C).
  8. Инкубируйте O / N позволяет лист клеток прилипать к поверхности гидрогеля.
  9. Удалить тон решетки металла после решение согревает (примерно 1 час), или на следующий день.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Блок-схема (рисунок 1) показывает общую способ изготовления многослойной патч. Сотовые листы отделены от pNIPAAM обработанной пластины, понижая температуру ниже 32 ° C. Затем клетки лист помещается на верхней части поперечно-сшитого гидрогеля, содержащей эндотелиальные клетки высевают на основной волокнистой матрицы (фиг.1). Предварительно обработанные термочувствительных пластин также может быть использован для создания клеточных листов. Специальные топологические поверхности использую...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги в протоколе включают: покрытие поверхностей пластины с thermoresponsive полимера и манипулирования клеток листы после охлаждения пластин. Поскольку различные клетки обладают различными физическими свойствами, как адгезивности, время подъема должна быть оптимизирована для каждого типа клеток. Второй, и наиболее значительно сложным компонентом этого протокола, центры на манипуляции клеточной листа, важнейшего аспекта методов сборки ткани. Один слой клеток в клеточной листа довольно хрупки и легко могут ра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была профинансирована премией New Faculty Award II от Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM; RN2-00921-1), Национальную исследовательскую премию, финансируемую NIH (F32-HL104924), и Грант на обучение CIRM (TG21163). Материалы предоставлены: Glycosan Biosystems Inc / BioTime и доктором Стивеном Бадылаком (Университет Питтсбурга)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Reagents
Calcein-AMInvitrogenC3099Трекер клеток / живой краситель
Lysotracker RedInvitrogenL7528Трекер клеток
нейтральный Red SigmaN7005Краситель для видимых клеток
pNIPAAMSigma Aldrich412780250Poly(N-изопропилакриламид)
ТолуолСигма Олдрич244511-1L
ГексанСигма Олдрич296090-1L
RAOSMCLonzaR-ASM-580Гладкомышечные клетки аорты крысы
SmGM2LonzaCC-4149Гладкие мышцы
HUVECInvitrogenC-003-5CЭндотелиальные клетки вен человека
HyStemGlycosan/ Biotime
Изопропиловый спиртVWR InternationalBDH1133-4LP
ТрипсинCorning Cellgro25-053-C1
PBSGibco14287-072
FBSGibco16140-071
Specific Equipment
Фильтровальная бумагаAhlstrom 6310-0900 
Воронка Бюхнера Сигма Олдрич Z247308 
Пластины UpCell Nunc 2014-11 
Ультрафиолетовый светJelight Company Очиститель UVO Модель No42

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ohashi, K., Okano, T. Functional tissue engineering of the liver and islets. Anat Rec (Hoboken). 297, 73-82 (2014).
  2. Chen, Q. Z., Harding, S. E., Ali, N. N., Lyon, A. R., Boccaccini, A. R. Biomaterials in cardiac tissue engineering: Ten years of research survey. Mat Sci Eng R. 59, 1-37 (2008).
  3. Jakob, P., Landmesser, U. Current status of cell-based therapy for heart failure. Curr Heart Fail Rep. 10, 165-176 (2013).
  4. Tongers, J., Losordo, D. W., Landmesser, U. Stem and progenitor cell-based therapy in ischaemic heart disease: promise, uncertainties, and challenges. Eur Heart J. 32, 1197-1206 (2011).
  5. Etzion, S., et al. Influence of embryonic cardiomyocyte transplantation on the progression of heart failure in a rat model of extensive myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 33, 1321-1330 (2001).
  6. Masuda, S., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering for heart tissue repair. Adv Drug Deliv Rev. 60, 277-285 (2008).
  7. Koh, G. Y., Soonpaa, M. H., Klug, M. G., Field, L. J. Strategies for myocardial repair. J Interv Cardiol. 8, 387-393 (1995).
  8. Li, R. K., et al. Construction of a bioengineered cardiac graft. J Thorac Cardiovasc Surg. 119, 368-375 (2000).
  9. Muller-Ehmsen, J., et al. Rebuilding a damaged heart: long-term survival of transplanted neonatal rat cardiomyocytes after myocardial infarction and effect on cardiac function. Circulation. , 105-1720 (2002).
  10. Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. , 100-193 (1999).
  11. Roell, W., et al. Cellular cardiomyoplasty improves survival after myocardial injury. Circulation. 105, 2435-2441 (2002).
  12. Soonpaa, M. H., et al. Potential approaches for myocardial regeneration. Ann N Y Acad Sci. 752, 446-454 (1995).
  13. Akins, R. E. Can tissue engineering mend broken hearts. Circ Res. 90, 120-122 (2002).
  14. Goodell, M. A., et al. Stem cell plasticity in muscle and bone marrow. Ann N Y Acad Sci. 938, 208-218 (2001).
  15. Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
  16. Murry, C. E., Wiseman, R. W., Schwartz, S. M., Hauschka, S. D. Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis. J Clin Invest. 98, 2512-2523 (1172).
  17. Orlic, D., et al. Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice. Ann N Y Acad Sci. 938, 221-229 (2001).
  18. Elia, R., et al. Silk-hyaluronan-based composite hydrogels: a novel, securable vehicle for drug delivery. J Biomater Appl. 27, 749-762 (2013).
  19. Kai, D., et al. Stem cell-loaded nanofibrous patch promotes the regeneration of infarcted myocardium with functional improvement in rat model. Acta Biomater. , (2014).
  20. Hong, H. J., et al. Tracheal reconstruction using chondrocytes seeded on a poly(l-lactic-co-glycolic acid)-fibrin/hyaluronan. J Biomed Mater Res A. , (2014).
  21. Serpooshan, V., et al. The effect of bioengineered acellular collagen patch on cardiac remodeling and ventricular function post myocardial infarction. Biomaterials. 34, 9048-9055 (2013).
  22. Turner, W. S., et al. Cardiac tissue development for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial and cardiac cells in natural matrices. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 2060-2072 (2012).
  23. Sato, M., Yamato, M., Hamahashi, K., Okano, T., Mochida, J. Articular cartilage regeneration using cell sheet technology. Anat Rec (Hoboken). 297, 36-43 (2014).
  24. Sawa, Y., Miyagawa, S. Present and future perspectives on cell sheet-based myocardial regeneration therapy. Biomed Res Int. 2013, 583912(2013).
  25. Demirbag, B., Huri, P. Y., Kose, G. T., Buyuksungur, A., Hasirci, V. Advanced cell therapies with and without scaffolds. Biotechnol J. 6, 1437-1453 (2011).
  26. Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol Med. 17, 424-432 (2011).
  27. Badylak, S. F., et al. The use of extracellular matrix as an inductive scaffold for the partial replacement of functional myocardium. Cell Transplant. 15, Suppl 1. S29-S40 (2006).
  28. Wang, Y., et al. Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds. Hepatology. 53, 293-305 (2011).
  29. Gilbert, T. W., et al. Collagen fiber alignment and biaxial mechanical behavior of porcine urinary bladder derived extracellular matrix. Biomaterials. 29, 4775-4782 (2008).
  30. Luna, J. I., et al. Multiscale biomimetic topography for the alignment of neonatal and embryonic stem cell-derived heart cells. Tissue Eng Part C Methods. 17, 579-588 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Tissue EngineeringCell SheetspNIPAAM CoatingFibrous Matrix HydrogelEndothelial CellsRat Aortic Smooth Muscle CellsLight MicroscopyCell Sheet TransferHydrogel CrosslinkingThermo Sensitive Polymer

Похожие статьи