Обычно используется, очень доступные методы для изучения миграции клеток и вторжение в пробирке описаны. Первый способ заключается клетка закрытия раны анализа, который измеряет подвижность клеток. Второй способ является Transwell миграции и вторжения анализ, который оценивает хемотаксического и инвазивной способности клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В пробирке миграции клеток и Вторжение Анализы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Миграция является ключевым свойством живых клеток и имеет решающее значение для нормального развития, иммунного ответа и болезненных процессов, таких как метастазирование рака и воспаление. Методы изучения миграции клеток очень полезны и важны для широкого спектра биомедицинских исследований, таких как биология рака, иммунология, сосудистая биология, клеточная биология и биология развития. В качестве примера мы используем миграцию и инвазию опухолевых клеток и описываем два связанных анализа, чтобы проиллюстрировать широко используемые и легкодоступные методы измерения этих процессов. Первый метод представляет собой анализ закрытия раны на клеточной культуре, при котором на сливающемся клеточном монослое создается царапина. Скорость закрытия раны и миграции клеток можно количественно оценить, сделав моментальные снимки с помощью обычного инвертированного микроскопа через несколько временных интервалов. Более детальное миграционное поведение клеток может быть задокументировано с помощью системы покадровой микроскопии. Второй метод, описанный в этой статье, — это трансвелловый анализ миграции и инвазии клеток, который измеряет способность клеточной подвижности и инвазивности к хемоаттрактантному градиенту. Наша цель состоит в том, чтобы описать эти методы в максимально доступной форме, чтобы процедуры можно было успешно выполнять в исследовательских лабораториях даже с базовыми знаниями клеточной биологии.
Введение
Подвижность является существенным признаком живых клеток. Миграция клеток участвует в концепции жизни, эмбрионального развития, иммунного ответа, и многих патологических процессов, таких как метастаза рака и воспаления 1-9. Поэтому методы для изучения миграционное поведение клеток очень полезные инструменты исследования для широкого круга дисциплин в области биомедицинских наук, биология, биотехнологии, и в смежных областях.
Изучение миграции клеток в исследовании рака представляет особый интерес, поскольку основной причиной смерти у больных раком связан с метастатическим прогрессии. Для того, чтобы рак распространения и распространение по всему организму, раковые клетки должны мигрировать и вторгнуться через внеклеточного матрикса (ECM), intravasate в кровь, приложить к далекой сайта, и, наконец, вытекать из сосудов в ткань, чтобы сформировать далекую очаги 1,10-12. Различные биологические методы могут быть использованы для изучения этих событий в деталях. Культура клеток рана закрытиег миграции Transwell и вторжения анализы широко используются в научном сообществе 1,10. Эти тесты могут представлять необходимые данные, которые могут позволить для понимания того, насколько хорошо конкретный тип клеток может самопроизвольно мигрировать или ответить на химио-аттрактанта и направленно мигрируют к нему. Несколько перелетные фенотипы были описаны. Клетки могут мигрировать в единой форме клеток, таких как видно на мезенхимальных или амебоидной-как движения или многоклеточного движения с надписью коллективную миграцию или ячейку потокового 13. Способ движения, используемого в подвижных клеток можно легко наблюдать с помощью культуры клеток закрытия раны анализа.
Среди многочисленных способов изучения миграции клеток, клетка закрытия раны анализ является одним из самых простых. Этот метод полезен для определения миграции способность целых масс клеток. При приеме на шаг дальше он может быть использован для наблюдения морфологических характеристик отдельной клетки во время миграции 14. После анализа закрытия раны многие фенотипы могут быть выявлены. Измерение замкнутую дистанцию со временем при сравнении с контролем может выявить конкретные изменения миграционных или с дефектами зрения миграционного фенотипа, который был неизвестен ранее. Кроме того, формирование одной клетки lamellipodium, хвост отвод, и направленное движение может дать ключ для того, что может быть нарушена или усиливается в клетках интерес 14.
Миграция Transwell и инвазии анализы могут быть использованы для анализа на способность отдельных клеток с целью непосредственного реагировать на различные химио-аттрактантов являются ли они хемокинов, факторов роста, липиды, или нуклеотиды 4,5,8,15,16. Он также может оценить дифференциальную миграционную способность в связи с чрезмерной экспрессией рецептора 1,14. Эти анализы могут быть также использованы для идентификации и характеристики ключевых регуляторов клеточной миграции, такие как семейства Rho малых GTPases 2. После них короткие и легкого доступаможных тесты, режим миграции клеток и способность клетки к вторжению в 3-D матрицы также может быть определена.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Закрытие Анализ клеточной культуры Рана
- Отделить клетки от культуры ткани пластины с использованием 0,25% раствора трипсина-ЭДТА. Гранул клеток в 15 мл коническую пробирку центрифугированием, аспирата супернатант и вновь приостановить клеток в культуральной среде. Plate соответствующее количество клеток в 6-луночный планшет для 100% слияния в 24 часов.
Примечание: Испытания могут быть необходимы, чтобы определить время и количество клеток для достижения 100% слияния в связи с типом клеток и размера хорошо используется (например, 1 х 10 6 B16F10 меланомы клетки высевают в лунку 6-луночный планшет за 24 часа до генерации раны). В качестве альтернативы, можно использовать 12-луночных или 24-луночных планшетах.
Примечание: Если возможно, клетки могут быть посеяны в культуру-Insert (от ibidi ООО) на обработанной планшета для культуры ткани делает рану предварительно приведением. Культура-патрон может защитить поверхность планшета для культуры ткани от повреждения кончика пипетки. Если культура-вставки используется пропустить шаг1.2. - В стерильной среде (обычно биологической безопасности капот) используют пипетки 200 мкл нажать плотно прижата к верхней части планшета для культуры ткани и быстро сделать вертикальную рану вниз через клеточный монослой. Разного размера наконечник пипетки может быть использован, чтобы размер раны, которая является желательной. Не прилагайте чрезмерных усилий против планшета для культуры ткани с кончика пипетки, как это может повредить поверхность. Если рана предварительно отлиты, этот шаг может быть пропущен.
- Тщательно аспирата средств массовой информации и остатков клеток. Медленно добавить достаточно питательных сред против а стены, чтобы покрыть дно колодца и избежать отсоединения дополнительные ячейки. После генерации и проверки раны Исходная картина должны быть приняты. Поместите планшета для культуры ткани в инкубатор при соответствующей температуре и концентрации СО 2 (обычно 37 ° C и 5% CO 2).
- В разные моменты времени, например, каждые 3 часа, удалить пластину из incubatили и поместите его под инвертированным микроскопом, чтобы сделать снимок картины и для проверки наличия закрытия раны. Если покадровой микроскопии доступен, примите фото каждый X количество минут (обычно начиная с каждые 5 минут) для любой продолжительности времени в температуре и CO 2 контролируемой камере. В зависимости от типа клеток, время закрытия раны может изменяться.
- Для анализа результатов Снимки изображений, измерить расстояние от одной стороны раны к другому, используя масштабную линейку. Анализ и явно присутствует закрытие раны со временем, используя точечный график или гистограмма, например Рисунок 1.
- Для анализа покадровой фотографии, импортировать фотографии в ImageJ программного обеспечения (в свободном доступе на http://rsb.info.nih.gov/ij/), чтобы сделать видео. Для этого откройте ImageJ в меню Файл выберите Импорт и последовательности изображений. Найдите файл с фотографиями; нажмите первую фотографию в файле. Сохранить видео, выбрав Файл, Сохранить как, и AVI. Холост мигрирующие клетки можно наблюдать в чараcterize направленное движение. Кроме того, морфологические характеристики, такие как формирование ламеллиподий и задней кромки отвода могут быть изучены, а (рис. 2 и дополнительного видео).
2. Transwell сотовый Миграция и Вторжение Анализ
- В стерильных условиях (как правило, капот биобезопасности) отделить клетки от планшета для культуры ткани с использованием неферментативное буфер клеток диссоциации или 0,25% раствором трипсина-EDTA, гранул клеток путем центрифугирования, и аспирации существующая СМИ оставляя осажденные клетки. Повторное приостановить клеток в свободной клеточной культуральной среде сыворотки, содержащей 0,1% БСА (бычий сывороточный альбумин).
Примечание: В зависимости от клеточной линии под следствием 0,25% Трипсин-ЭДТА может повлиять на миграцию клеток и инвазии в связи с расщеплением различных рецепторов на клеточной поверхности 17.
Примечание: число клеток на мл зависит от размера клеток. Дальнейшие тесты могут быть необходимы, чтобы найти плотность посева, что ProVides лучшие результаты. Обычно 1 х 10 6 клеток / мл является хорошей отправной точкой для большинства типов клеток при использовании 24-а Transwell вставить. Существует целый ряд Transwell размеров вставки и количество клеток, добавленных должна быть скорректирована для соответствующим образом. - Тарелка 100 мкл раствора клеток в верхней части мембраны фильтра в Transwell вставки и инкубировать в течение 10 минут при 37 ° С и 5% СО 2, чтобы позволить клетки, чтобы успокоиться.
Примечание: Конкретный размер пор мембраны, используемой Transwell зависит от индивидуального размера клеток в образце. Например, если клетки слишком малы, они могут проходить через поры без необходимости для облегчения миграции или если они слишком велики, они не могут проходить через поры. Есть несколько Transwell вставки с размером пор, которые варьируются от 3 мкм, 5 мкм и 8 мкм для миграции клеток анализов. В Transwell вставки являются коммерчески доступными от таких компаний, как Corning.
Примечание: Transwell мigration анализ может быть легко модифицирована для выполнения вторжения клеток анализа. Чтобы сделать это, добавьте внеклеточный матрикс (ECM) материалов в верхней части Transwell мембраны, а затем добавить клетки в верхней части ECM. Например, Матригель оттаивают и сжиженный на льду, а затем 30-50 мкл Matrigel добавляется в 24-луночный Transwell вставить и затвердевает в инкубаторе 37 ° C в течение 15-30 минут, чтобы сформировать тонкий слой геля. Сотовый решение добавляется в верхней части покрытия Матригель имитировать вторжение через внеклеточного матрикса.
Примечание: Есть четкие различия между миграцией Transwell клеток и вторжения Transwell клеток анализов. Миграция анализ Transwell клеток измеряет хемотактическую возможности клеток в сторону химио-аттрактанта. Вторжение Transwell клеток анализ, однако, измеряет как сотовые хемотаксис и нашествие клеток через внеклеточного матрикса, процесс, который обычно находится в метастазами рака или эмбрионального развития. - С помощью пипетки, очень carefUlly добавить 600 мкл требуемой химио-аттрактанта в нижней части нижней камеры в 24-луночный планшет. Добавьте химио-аттрактант без перемещения Transwell вставку и избежать образования пузырьков. Убедитесь, что химио-аттрактант жидкость в нижней скважины вступает в контакт с мембраной в верхней скважины, чтобы сформировать градиент хемотаксиса. Время инкубации зависит от типа клеток и химио-аттрактанта используется.
Примечание: Дальнейшие тесты могут быть необходимы, чтобы определить, инкубационный период.
Примечание: адгезивных клеток, перенесенные клетки приложить к другой стороне мембраны 1,8. Количественное мигрировавших клеток могут быть выполнены следующие шаги 2,4 до 2,8 (шаги 2.4-2.8 не нужно быть выполнены в стерильной среде). Для не-прилипшие клетки, мигрировавшие клетки упадет в СМИ в нижней палате. Количество мигрировавших клеток можно пересчитать с помощью гемоцитометра или проточного цитометра 5. - Извлеките вставку Transwell от пластины. Используйте ватный-наконечником аппликатором столько раз, сколько необходимо тщательно удалить средства массовой информации и оставшиеся клетки, которые не переносятся из верхней части мембраны, не повреждая ее.
- Добавить 600-1000 мкл 70% этанола в лунку 24-луночного планшета. Поместите Transwell вставку в 70% этаноле в течение 10 минут, чтобы позволить прикрепление клеток. Удалить Transwell вставку из 24-луночного планшета и использовать ватным наконечником аппликатора для удаления оставшегося этанола из верхней части мембраны. Разрешить Transwell мембрана высохнуть (обычно 10-15 минут).
- Добавить 600-1000 мкл 0,2% кристаллическим фиолетовым в лунку 24-луночного планшета и поместите в него мембрану для окрашивания. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5-10 минут.
- Осторожно удалите кристаллический фиолетовый сверху мембраны с наконечником пипетки или хлопка наконечником аппликатора. Очень осторожно, чтобы избежать смывания фиксированные клетки, окуните мембрану в дистиллированной воде столько раз, сколько необходимо для удаления избытка кристально Violeт. Разрешить Transwell мембрана для просушки.
- Вид под инвертированным микроскопом и подсчета количества клеток в различных полей зрения, чтобы получить среднюю сумму клеток, которые мигрировали через мембрану к химио-и аттрактанта, прикрепленных на нижней стороне мембраны (рис. 3).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рана закрытие анализа и миграции Transwell клеток анализа, представленные здесь проводились с использованием мыши B16F10 клетки меланомы в качестве модельной системы. В анализе закрытия раны, B16F10 клетки высевали в культуре ткани пластины 6-луночный и выращивали до 100% слияния в течение 24 часов. Рана примерно 700 мкм в ширину был сгенерирован с помощью пипетки и закрытие раны (миграции клеток) был записан с помощью покадровой микроскопии. С другой стороны, закрытие раны также могут быть изучены, взяв фотоснимков в р...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Миграция клеток является важным аспектом для изучения в исследовании рака, а также может быть применен в развитии, иммунологических и заживление ран исследований. Культуру клеток закрытия раны анализа и миграции Transwell клеток и вторжения анализы показывают подробную информацию о миграционных поведения клеток и может быть использован для исследования молекулярных механизмов клеточной миграции 1,2,10,14. Наше исследование использовали эти подвижности клеток анализы для определения скорости миграции и вторжен...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы благодарят Майка Майлза, Сэма Сондерса и К.В. Элтона из ECU Multimedia & Technology Services за помощь в производстве видео. Мы выражаем признательность за грантовую поддержку от Биотехнологического центра Северной Каролины, организации «Игроки в гольф против рака», Благотворительного фонда братьев Броуди, Американской кардиологической ассоциации и Фонда исследований и образования в области рака ECU/Vidant (L.V.Y. и M.J.R.).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Дульбекко s модифицированный Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Бычья сыворотка альбумин (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Трипсин ЭДТА 0,25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco' s фосфатно-солевой буфер (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Кристаллический фиолетовый | Sigma | C0775-100G | Растворенный в воде в концентрации 0,2% |
| Буфер для диссоциации клеток | Gibco | 13151-014 | |
| Инкубатор для клеточных культур | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD биозащитный капюшон | The Baker Company, Inc. | Модель # VBM-600 | |
| EVOS Fl инвертированный микроскоп | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Тканевая культуральная пластина | Becton Dickinson | 353046 | Каталожный номер варьируется в зависимости от типа культуральной пластины |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Каталожный номер варьируется в зависимости от размера пор мембраны |
Ссылки
- Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor. Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Peter, C., et al. Migration to apoptotic "find-me" signals is mediated via the phagocyte receptor G2A. J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).
- Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).
- Buul, J. D., Hordijk, P. L. Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).
- Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis. 228 (4), 606-616 (2003).
- Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A. Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).
- Albini, A. Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms. Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).
- Fidler, I. J. Critical determinants of metastasis. Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).
- Zhang, Y., et al. Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells. Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).
- Junger, W. G. Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis. Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).
- Lazennec, G., Richmond, A. Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation. Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, (2010).
- Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).
- Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
