Имитация поджелудочной Нейропластичность:<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Dual-нейрон Пластичность Анализ

Краткое содержание

Нейронов пластичность более широкое признание, но недостаточно понимать особенность желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Здесь, в примере поджелудочной железы человека, приведены в пробирке нейропластичности анализа для изучения нейрональной пластичности в желудочно-кишечном тракте на обоих морфологической и функциональной уровне.

Аннотация

Нейропластичность является неотъемлемой особенностью кишечной нервной системы и желудочно-кишечного (GI) иннервации при патологических состояниях. Тем не менее, патофизиологическая роль нейропластичности при расстройствах ЖКТ остается неизвестной. Новые экспериментальные модели, которые позволяют моделирования и модуляцию GI нейропластичностью может включить расширенное оценку вклада нейропластичности в частности GI заболеваний, таких как рак поджелудочной железы (РПЖ) и хронического панкреатита (ХП). Здесь мы приводим протокол для моделирования поджелудочной нейропластичности в условиях в пробирке с использованием новорожденного крысы ганглии задних корешков (DRG) и мышечной оболочки кишечника сплетение нейронов (MP). Эта двойная-нейрон подход не только позволяет осуществлять мониторинг как орган-внутренняя и внешняя-нейропластичности, но и представляет собой ценный инструмент для оценки нейронов и глиальных морфологию и электрофизиологии. Кроме того, она позволяет функциональную модуляцию поставляемых микроокружения содержания для изучения их Impacт на нейропластичности. После создания, настоящее нейропластичность анализ несет потенциал быть применимо к изучению нейропластичности в любой GI органа.

Введение

Изменения в желудочно-кишечном (GI) нерва морфологии и плотности привлекли внимание гастроэнтерологов и патологоанатомов в течение длительного времени, но их актуальность для патофизиологии GI заболеваний остается неизвестной ^1-3. Действительно, несколько весьма распространенных расстройств ЖКТ, такие как гастрит, рефлюкс-эзофагит, колит, дивертикулит, и аппендицита связаны с повышенной плотностью иннервации в воспаленные участки ткани ^1. Однако ни подлинной внимание до сих пор не было уделено механизмам и значении нейропластичности в желудочно-кишечном тракте. У морфологически измененные нервы GI отличаются от нормальных нервов GI, то есть нормального состояния кишечной нервной системы, с точки зрения их функции? Каковы последствия измененным содержанием нейропептида / нейромедиатора в пластиковых кишечных нервов? Ли периферийная нейропластичность всегда влечет за собой измененную сигнализации для центральной нервной системы? А где центральные проекции пластиковой EXTRINSIC Г.И. нервные пути? Длинный ряд таких ключевых вопросов может быть легко сгенерирована при взгляде на малочисленность наших знаний о функциональных аспектах GI нейропластичности.

Изучение GI нейропластичностью на функциональном уровне требуется действительные, воспроизводимые и до сих пор легко применимые экспериментальные модели. В эпоху большую популярность и признание генно-инженерных условных мышиных моделях (GECoMM), таких в настройках естественных условиях располагают потенциалом для выяснения ранее неизвестных аспектов GI нейропластичности в реалистической моды ^1. Тем не менее, разработка и производство GECoMM остается дорогостоящим, трудоемким и, особенно, отнимает много времени. Кроме того, они требуют априорной выбор цели для условно модулированного в генетически измененной мыши (например, трансгенные суперэкспрессии фактора роста нервов / ФРН в кишечных эпителиальных клеток). Следовательно, для DESIGN успешного GECoMM, исследователи должны некоторые показатели (например, предыдущие экспериментальные данные) из стоящей цели, то есть, что молекула представляет интерес (здесь NGF), по крайней мере можно ожидать оказывать некоторые биологически соответствующие эффекты на ЖКТ нервов.

Такие показатели могут быть легко получены из адекватным в пробирке моделей, в которых выделенные клеточные подтипы от комплексной микроокружении в естественных условиях системы могут быть выборочно совместно культивировали в гетеротипичной образом ^4-7. Модуляция молекулярных мишеней в таком гетеротипичной обстановке культуры в среднем технически менее громоздким, быстрее, и, следовательно, может помочь в Префильтрация из достойных целей для проверки в естественных условиях исследования в.

Недавно мы представили в пробирке Нейропластичность анализа, которая была разработана для имитации повышенную нервную плотность и гипертрофию intrapancreatic пеРВЭС в человеческой рака поджелудочной железы (РПЖ) и хронического панкреатита (CP) тканей. Здесь, нейроны, полученные из новорожденных крыс ганглиях задних корешков (DRG) или мышечной оболочки кишечника сплетения (МП) подвергали воздействию тканевых экстрактах из хирургически удаленных РПЖ или CP тканей образцов и по сравнению с теми культивировали в нормальной человеческой поджелудочной железы (NP) тканевых экстрактах ^5. Вместо того, чтобы тканевые экстракты, можно также использовать клеточной линии супернатантами изучить влияние отдельных типов клеток на нейропластичности. В сочетании со стандартизированным измерения морфометрического, представлены нейропластичности анализ позволяет действительный и воспроизводимую оценку нейрональной пластичности в ответ на различные поджелудочной микросреды. В частности, она позволяет моделирование 1) морфологической нейропластичности, то есть изменения в аксонов, разветвления рисунка и размеров нейронов, и 2) функциональной нейропластичности, то есть изменения в возбудимости периферических нейронах. Более того, не только периферические (т.е. Кишечно), но и центральный (например DRG или второй спинной заказ) нейроны могут быть включены в настоящее анализа для оценки их морфологические и функциональные реакции на различным содержанием Г.И. ткани. В настоящем видео-учебник, мы продемонстрировать техническую протокол для выполнения этого анализа и обсуждения свои преимущества и недостатки. Кроме того, мы обращаем внимание на применимости основного понятия этом анализе к изучению нейропластичности в любой GI органа.

Протокол

Все экспериментальные животные процедуры в протоколе следуйте рекомендациям по уходу за животными из Технического университета в Мюнхене, Германия.

1. СМИ / Extract Подготовка

1. Ткань гомогенизации
   Качество ткани гомогенизации имеет решающее значение для последующего обнаружения neuroplastic изменений в культивируемых нейронах. Здесь, рекомендуется гомогенизатор, который позволяет ткани диссоциации без значительного увеличения температуры тканей.
   1. Передача 5 мм х 5 мм х 5 мм кубики ткани поджелудочной железы непосредственно от -80 ° С до жидкого азота и места в твердой фазе в ткани homogenator. Идеальный homogenator бы отделить ткани достаточно быстро, не позволяя ему разморозить.
   2. Сразу после диссоциации, ресуспендируют твердое вещество, порошкообразный гомогената в 300-500 мкл 0,1 × фосфатно-солевом буфере (PBS). Здесь не используют никаких буфер для лизиса (например, RIPA) так как это может лизировать нейронов.
   3. Центрифуга гомогенаты для по крайней мере 15 минут при максимальной скорости вашего скамейке центрифуге (например 21130 мкг). Соберите четкое слой, который представляет выписку ткани.
2. Клеточной линии надосадочные
   1. Пусть клетки интерес достичь по крайней мере 70 - 80% слияния в нормальной ростовой среды.
   2. Как правило, эти носители содержат компонентов сыворотки и может оказывать неконтролируемые эффекты при роста нейронов. Таким образом, после достижения необходимой плотности клеток, мойте клетки, по крайней мере 3x с класса клеточной культуры PBS и поместить их в среде без сыворотки (SFM) на срок до 48 часов.
      Примечание: Здесь считают, что некоторые клетки (как поджелудочной звездчатых клеток), возможно, потребуется сыворотки в их питательной среды для того, чтобы поддерживать их нормальное состояние и структуру. В таких случаях выполнения последовательных разведений сыворотки в среде клетки интереса для того, чтобы найти самые низкие содержания, что необходимо сыворотки для неповрежденной Functio клетокн.
   3. Измерение концентрации белка в гомогенате ткани или клеточных супернатантах с помощью белкового анализа Брэдфорда. В то время как эти показатели меняются в зависимости от ткани и клеток типа, экстрактов ткани поджелудочной железы, можно было бы ожидать диапазона концентраций между 5-12 мкг / мкл, а для линии клеток супернатантов между 3-8 мкг / мкл.

2. Алиготе Экстракты и Сотовые Супернатанты

В зависимости от концентрации, которые будут использоваться в анализе, конечная концентрация экстракта или надосадочной жидкости в нейронной среде должна быть 100 мкг / мл ^5,8.

Примечание: Для анализа с нейроны растет в 500 мкл среды в каждую лунку 24-луночного планшета, необходимо 50 мкг белка от каждого экстракта или надосадочной жидкости на лунку. В типичной концентрации экстракта около 10 мкг / мкл, можно было бы необходимо 5 мкл экстракта / супернатанта для каждой скважины. В каждом SETTINг выполнены в виде трех экземплярах, это будет соответствовать 15 мкл экстракта / супернатанта. Для различных тканей или клеточных типов, выполнять серийные разведения конечного экстракта или концентрации супернатанта и сравнивать наблюдаемые нейротрофические эффекты между различными концентрациями экстракт / супернатант.

3. Выделение нейронов

После того, как коллекция экстракт / супернатант закончил, вести с изоляцией нейронов.

1. Для DRG нейронов, собирать шейки поясничного DRG новорожденных крыс между послеродовой день (Р) 2-12 после обезглавливания и stereomicroscopic рассечение DRG (рис. 1А). Для того чтобы иметь достаточные нейронов DRG для 24-луночный планшет, собрать все шейные чтобы поясничного DRG одного новорожденных крыс (равной 52 DRG) за тарелку.
   1. Срежьте периферическое (нервные) и центральные проекции (корни) из DRG с помощью microscissors.
      Оставив прогнозы на месте препятствует растирание и увеличивает тон попадания загрязнений риск культуре фибробластов.
2. Для МП нейронов, срезать брыжейки из тонкой кишки и вручную и тщательно сдирать seromuscular слой тонкой кишки (для детального протокола о изоляции МП, обратитесь к Шефер и др.. ^9, рисунок 1b). Для депутата, собрать сплетение от двух крыс на 24-луночного планшета.
   Примечание: Постарайтесь быть как можно ласковее, чтобы избежать слез в seromuscular слоя, так как они препятствуют его успешной отделение от тонкой кишки.
3. Соберите DRG и seromuscular слой в ледяной минимальной необходимой среде (MEM), поставляемый с гентамицин (20 мг в 500 мл среды) и метронизадолу (2,5 мг в 500 мл среды).
4. После сбора DRG, инкубировать их в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS), поставляемой с коллагеназы типа II в течение 20-30 мин. Для выделения МП, инкубировать в типа коллагеназы между 1-3 ч, в зависимости от возрастаживотного (рис. 1в).
5. Для депутата, собрать сетчатой ​​MP куски под стереомикроскопа и трансфер в ледяной MEM.
6. Тогда растирают DRG и MP через шприцы с уменьшением диаметра.
   Примечание: Чрезмерное растирание может уничтожить нейроны, но за вычетом клетки глии.
7. После того, как среда, содержащая DRG или MP стало пасмурно, центрифуги суспензию на 93,9 мкг в течение 5 мин, отбросить средних и ресуспендируют в Neurobasal среды (с добавлением 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 0.5 мм L-глютамин и 2% B-27).
8. Подсчитать общее количество клеток (то есть нейронов и глии) с помощью гемоцитометра.
   Примечание: количество необходимых клеток зависит от параметра измерения. Для количественной оценки плотности нейритов, необходимо более плотные культур и, следовательно, большее количество клеток, чем для измерения нейритов, perikaryonal размераи ветвление образец отдельных нейронов. Для измерения плотности аксонов, использовать например 10000 клеток (нейронов + глии) / а или 1500 нейронов / а. Для морфометрии отдельных нейронов, краткая (1 минута длиной) трипсинизации клеток и посева 2500 клеток / а или 400 нейронов / хорошо рекомендуется. Типичный выход клеток, полученных из одной крысы составляет около 300,000-500,000 клетки.
9. Семенной клеток на 13 мм покровные, которые были покрыты в ночь перед и началу скважин с Neurobasal среде (содержащей 100 U / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 0.5 мм L-глютамин и 2% B-27) (рис. 1D).
   Примечание: Использование поли-D-лизина (40 мг / м ²⁾ или орнитин-и ламинин покрытием (1 мг / мл каждого) с покрытием покровные стекла. Клетки прикрепляются к поли-D-лизина очень быстро, что делает его пригодным для экспериментов, в которых необходимы многие клетки (т.е. измерения плотности нейритов). Привязанность к ламинином это вообще Зомечто слабее, но ламинином является сильным пропагандистом аксонов. Таким образом, для измерений на нейронной ветвления и длины аксонов, предпочитают орнитин / ламинином покрытие.
10. Разрешить клетки прикрепляются к скважин на ночь. На следующий день, приготовления экстракта с добавкой носитель (в конечной концентрации экстракт / надосадочной 100 мкг / мл).
11. Аспирируйте посева среду, а также выполнять дополнительный, очень бережная стирка с PBS, а затем медленно пипетки экстракт / надосадочную-дополняется носителя (Рисунок 1E).
12. Пусть клетки растут в течение 48 часов. Аспирируйте СМИ и исправить в 4% параформальдегиде для иммуноокрашивания (рис. 1F).
13. Выполните двойного окрашивания иммунофлюоресценции с использованием специфичные для нейронов (например бета III-тубулина) и глии конкретным (например глиальных fibriallary кислый белок / GFAP) маркеры (рис. 1G).
14. Для морфометрии, использовать инвертированный светового микроскопа, снабженного ПЗС-камеры в комбинации Wiй автоматизированное программное обеспечение, которое позволяет измерять плотности аксонов (см. таблицу).
15. Плотность аксонов нейронов культур измеряется на 4-5 представительств микрофотографии на 200-кратное увеличение с 4-х различных регионах плотной роста на каждом покровном при наложении х 50 мкм сетки 50 мкм и подсчета плотность волокон на квадрат измеренного в пересекающихся волокон. Рост нейритов, среднее количество ответвлений на нейрона, средняя длина ветвь и perikaryonal размер может быть измерена с 30 случайно выбранных одиночных нейронов из каждого покровного стекла путем отметки нейритов и perikarya (Рисунок 1H).

Результаты

Морфологические нейропластичность

В указанном возрасте от новорожденных крыс (Р2-12) и плотностей высева, MP и DRG нейроны уже построения плотных нейронные сети после 48 часов (рис. 2А). Сравнение плотности аксонов между нейронами, культивируемых в РПЖ, CP, и NP экстрактов показывает большую плотность аксонов из DRG нейронов в РПЖ или экстрактов СР, чем в НП экстрактов ⁵ (рис. 2A). Особенно предпочтительно MP нейроны для измерений на отде...

Обсуждение

Настоящий протокол предназначен для иллюстрации методики позади в пробирке поджелудочной Нейропластичность анализа, который был недавно разработанной нашей группой для изучения механизмов нейропластичности в РПЖ и CP ^5. Протокол включает в себя процедуру трехдневный которые могут быть легко применены после того, как исполнитель приобрел достаточный опыт в изоляции и культуры DRG и МП нейронов. Кроме того, он представляет собой ценный инструмент для изучения сопутствующей реакцию кишечных и ДРГ-связан...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Поли-D-лизина гидробромид	Sigma-Aldrich	P1149
Орнитин/ламинин	Sigma-Aldrich	P2533/L4544
13 мм Покровные стекла	Merck		Для использования в 24-луночных планшетах
Дисмембранатор S	Sartorius
Anti-Beta-III-тубулин антитело	Миллипор	MAB1637	концентрация 1:200
Анти-GFAP-антитело	DAKO	M0761	1:400 концентрация
RIPA буфер + ингибитор			Любой поставщик
Нейробазальная среда	Gibco/Life Sciences	21103-049
B-27 Добавка	Gibco/Life Sciences	17504044	Известно, что качество B-27 зависит от номера партии
Гентамицин/Метронидазол			Любой
поставщик Минимальная необходимая среда	Gibco/Медико-биологические науки	31095-029
Хэнк s Сбалансированный солевой раствор (HBSS)	Gibco/Life Sciences	24020133	Улучшает активность коллагеназы при содержании Ca/Mg
Коллагеназа типа II	Worthington Biochemical	CLS-2	Получите партии с активностью не менее 200 ЕД/мг
Трипсин-ЭДТА 0,25%	Gibco/Life Sciences	25200056
4% Параформальдегид			Любой поставщик
анализируетSIS docu программное обеспечение	Olympus

протеазы