Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Реверс дрожжевой Два-гибридная система для идентификации Mammalian ядерного рецептора Остатки, которые взаимодействуют с лигандами и / или антагонистов

12.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51085

⸱

15 ноября 2013 г.

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine , 2Shanghai Key Laboratory of Complex Prescription and MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines, Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Кетоконазол связывается и противодействует прегнановых X рецептор (ПРИ) активации. Дрожжи высокой пропускной экраны PXR мутантов определить уникальный регион для связывания кетоконазол. Этот генетический метод дрожжей на основе обнаруживает новые взаимодействия ядерных рецепторов с лигандами, которые связывают с поверхности участков связывания.

Аннотация

В критической регулятора метаболизма лекарств и воспаления, прегнан Х-рецептора (ПРИ), играет важную роль в патофизиологии болезни обмена веществ, связывающую и воспаление (например, стеатоза печени) 1,2. Там был достигнут значительный прогресс в идентификации агонистов лигандов для ПРИ, однако, есть ограниченные описания наркотиками как антагонистов и их сайтов связывания на PXR 3,4,5. Критический барьер была неспособность эффективно очистить полнометражный белка для структурных исследований с антагонистами, несмотря на то, что ПРИ клонировали и характеризуется в 1998 году. Наша лаборатория разработала новую высокую пропускную дрожжи основе двугибридная анализа определить антагонист, кетоконазол х, связывания остатков на ПРИ 6. Наш метод включает в себя создание мутационные библиотеки, которые бы спасти эффект одиночных мутаций на AF-2 поверхности ПРИ ожидается, взаимодействовать с кетоконазол. Спасение или «усиления из-функции" вторй мутации могут быть сделаны таким образом, что выводы о генетическом взаимодействии кетоконазол и поверхностного остатка (ов) на ПРИ осуществимы. Таким образом, мы разработали высокую пропускную двухгибридного дрожжей экран PXR мутантов, взаимодействующих с ее коактиватора, SRC-1. Используя этот подход, в которых дрожжи был изменен, чтобы приспособить изучение противогрибкового препарата, кетоконазол, мы могли бы продемонстрировать специфические мутации на ПРИ обогащенные клонов не могли связать с кетоконазол. По обратной логике, мы приходим к выводу, что первоначальные остатки являются прямыми остатки взаимодействия с кетоконазолом. Этот анализ представляет собой роман, послушный генетический анализ для скрининга антагонистов сайтов связывания на поверхности ядерного рецептора. Этот анализ может быть применен к любому препарату независимо от его цитотоксического потенциала для дрожжей, а также клеточного белка (ов), которые не могут быть изучены с помощью стандартного структурной биологии или протеомических на основе методов. Потенциальные ловушки включают интерпретацию данных (нетрадиционные методы полезны), надежAnce на одного метода Y2H, опыт в обращении с дрожжей или выполнение дрожжей двух гибридных анализов и оптимизации анализа.

Введение

Дрожжи двугибридная (Y2H) анализ широко используется, чтобы обнаружить белок-белковых взаимодействий и совсем недавно для открытия новых малых молекул, которые разрушают белок-белковых комплексов взаимодействия 7, 8, 9, 10, 11. Однако обычные подходы этом анализе используется для лекарственных препаратов или "попаданий", не позволяют для обнаружения аллостерических остатков химических веществ взаимодействия соединений в белок-белковых поверхности, что, когда изменяется еще взаимодействовать и позволяют опроса измененных остатков 11 . В самом деле, такой способ (ы), если это возможно, чтобы развиваться, позволило бы сговорчивым систему дрожжей для оценки высокой пропускной аллостерических остатков взаимодействия критических для нарушения взаимодействия белок-белок. В контексте открытия новых лекарств, наиболее прямой путь для установления взаимодействия соединений с белками предполагает структурную определение (например Кристаллизация белок-ингибитор комплекса). Эти методы дипломbersome, использовать сложные ресурсы, и это технически невозможно выполнить структурные исследования по каждой белка.

Сговорчивым системы генетического скрининга наркотиков были созданы в бактериях 1, 2 и других модельных систем, как млекопитающих двугибридная. Тем не менее, эти системы должны оптимизацию и альтернативные системы, такие как Y2H-прежнему являются наиболее протестирован в лекарственных препаратах. Существуют ограничения, которые включают слабую чувствительность и надежность взаимодействия с использованием особых методов 13, однако, один Y2H анализ может быть изменен, чтобы ответить на конкретные вопросы, касающиеся остатков взаимодействия. В области исследований ядерной рецепторов, Y2H был использован для определения взаимодействующих белков 14, однако, эти белковые взаимодействия редко используется для определения характера, в которых лиганды / антагонисты взаимодействуют с ядерными рецептор-белковых комплексов. Таким образом, наша лаборатория сосредоточены усилия на определении метода, особенно для белков-рецепторов, которые нелегко поддаются протеомные методы, основанные, что бы раскопать роман лиганд / антагониста, взаимодействующих остатков с использованием обратной Y2H основе платформу открытия.

Основываясь на нашем предыдущем открытии, что кетоконазол нарушает PXR и его активатор SRC-1, мы разработали роман обратного Y2H систему, которая позволит нам определить и допросить кетоконазол взаимодействующих остатков на ПРИ 6. Наша методика основана на свойствах белка GAL4 дрожжей, который состоит из отделимых областей, отвечающих за активацию ДНК-связывающего и транскрипции. Белок PXR LBD выражается в виде гибрида к LexA ДНК-связывающий домен (ДНК-BD), в то время как по всей длине Соактиваторы SRC-1 (стероид коактиватор рецептор 1) белки экспрессируются в виде слитых с доменом активации GAL4 (AD ). Взаимодействие между ПРИ и SRC-1 слитых белков приводит к транскрипционной активации GAL4-связывающие сайты, содержащие репортерный ген β-Lac Z, который интегрирован в геноме дрожжейэ. Кетоконазол, антагонист PXR, нарушает PXR и SRC-1 взаимодействие 15, 16, 17, и мы можем детектировать взаимодействие ПРИ и SRC-1 в присутствии или в отсутствие кетоконазол после окрашивания колонии на фильтров для X-гал активности. Принцип Y2H иллюстрируется на рисунке 1 и экспериментальная процедура показаны на рисунке 2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Строительство ПРИ и SRC-1 Fusions в дрожжевые векторы

  1. ПЦР-амплификации человеческого PXR ДТЛ (107-434 аминокислот) и человека SRC-1 полной длины (1-1401 аминокислот).
    1. Используйте pSG5-hPXR плазмиды 8 как ПРИ LBD шаблона, используйте PCMX-SRC1 плазмиды как SRC-1 шаблонов.
    2. Оттепель ПЦР SuperMix, ДНК-матрицы и праймеры (см. материалы), держать их на льду.
    3. Добавить 0,25 мкг / мкл матричной ДНК 1 мкл, 10 мМ пары праймеров 2 мкл каждый, ПЦР SuperMix 45 мкл и добавить H 2 O, чтобы довести общий объем до 50 мкл.
    4. Набор ПЦР на один цикл при 94 ° С в течение 2 мин, 20 циклов при 94 ° С в течение 30 сек, 55 ° С в течение 30 сек и 72 ° С в течение 2 мин, а затем один цикл при 72 ° С в течение 10 мин для расширения. Проверка продуктов ПЦР, запустив на 1% агарозном геле.
  2. Продукты ПЦР клонирования в Y2H векторов.
    1. Очищают продуктов ПЦР с 1% агарозном геле. Дайджест ПРИ, ДТЛ, ПЦР и Y2H вектор pSH2-1 сBamHI и SalI; переварить SRC-1 ПЦР и Y2H вектор pGADNOT с NotΙ и SalΙ. Чтобы сделать это, добавьте 1 мкг ДНК, 3 мкл 10х реакционного буфера, 1 мкл ферменты рестрикции, и, наконец H 2 O, чтобы принести общий объем до 30 мкл.
    2. Положите образцы пищеварения в 37 ° С водяной бане в течение 1 часа. Проверка на пищеварение работает на 1% агарозном геле.
    3. Очищают образцы пищеварения от 1% агарозном геле, переваривали перевязывать продуктов ПЦР и Y2H векторы и преобразования, чтобы компетентных клеток DH5б.
    4. Выберите колонии и изолировать ДНК плазмиды.
  3. Определить pSH2-1-PXR ДНК плазмиды по BamHI / SalI пищеварения, определить pGADNOT-SRC-1 ДНК плазмиды на NotI / SalI пищеварения. Проверьте весь положительный ДНК плазмиды путем секвенирования.

2. Дрожжи двугибридная Анализы

  1. Инокуляции штамма дрожжей в 5 мл YPAD и инкубировать в течение ночи при постоянном перемешивании (220 оборотов в минуту при 30 ° С). Примечание: Штамм Saccharomyces CEREVISIAE был CTY10-5d(MAT ade2 ГТО 1-901 leu2-3, 112 his3-200 га L4 - gal80 - URA3 :: Lexa-LacZ), который содержит интегрированный ген GAL1-LacZ с Lexa оператора 10. Для получения жизнеспособных дрожжевых клеток, устойчивых к кетоконазол, но те, которые не несут транспортера изменения в качестве причины азольного сопротивления 18-20 новых штаммов CTY10-5d дрожжей были получены предварительного удаления ERG3 (erg3 Δ), а затем введения дополнительного удаления в ERG11 (erg3 Δ / erg11 Δ) гены путем гомологичной рекомбинации. Конструктивные детали были описаны в ранее опубликованной рукописи 6.
  2. На следующий день (утром), привить дрожжи (1:20) в 5 мл YAPD и инкубировать, чтобы получить OD 600 ~ 0,2 на постоянном перемешивании (220 оборотов в минуту при 30 ° С).
  3. Гранул клеток при 2000 оборотах в минуту в микроцентрифуге в течение 2 мин и отбросить супернатант. Затем промыть Pelleт дважды автоклавного водой и один раз 0,1 М LiAc.
  4. После последней промывки, отбросить супернатант и добавьте следующие реагенты к осадку клеток: 240 мкл ПЭГ 3500 50% вес / объем, 36 мкл 1 М LiAc, 50 мкл 2 мг / мл кипяченой одноцепочечной ДНК спермы лосося, H 2 O 34 мкл. Vortex перемешать, добавить 1 мкг ПШ-PXR и 1 мкг pGADNOT-SRC-1 ДНК и перемешать.
  5. Перенести смесь с полистиролом с круглым дном трубки, агитировать преобразование, смешать (220 оборотов в минуту при 30 ° С) в течение 30 мин. Перемещение трубки 42 ° С на водяной бане и инкубируют в течение еще 30 мин.
  6. Центрифуга трубки при 2000 оборотах в минуту в течение 2 минут и удалить супернатант. Вымойте гранул один раз автоклавного воды.
  7. Внесите 100 мкл стерильной воды в трубку, вновь приостановить клеток путем легкого пальцем разговоров и пипетки, затем пластину на пластинах -His/-Leu Dropout Medium (композиции на один литр -His/-Leu Dropout Medium: 20 г декстрозы, 1,7 г YNB, 0,67 г CSM-His/-Leu, 5 г сульфата аммония, 1,5% агар) и вклUbate при 30 ° С в течение 3-4 дней, чтобы изолировать трансформантов.

3. X-гал фильтр Анализ

  1. Cut нитроцеллюлозную мембрану с размером части чашке Петри. Этикетка нитроцеллюлозную мембрану, чтобы отметить ориентацию.
  2. Поместите premarked на нитроцеллюлозную мембрану дрожжевых колоний, убедитесь, что мембрана находится в контакте с поверхностью пластины среде.
  3. Удалить мембрану, поместите его колонии стороной вверх на 3 мм фильтровальной бумаги и поместите мембрану и фильтровальную бумагу при -80 ° С в течение 15 мин.
  4. Сделать X-гал решение. Добавить 50 мкл 20 мг / мл X-Gal и 15 мкл β-меркаптоэтанола в 5 мл Z-буфера (1 л буфер содержит 16,1 г Na 2 HPO 4 7H 2 O, 5,5 г NaH 2 PO 4 H 2 O, 0,75 г KCl, 0,25 г MgSO 4 • 7H 2 O). Если Z буфера выдерживали при 4 ° С, довести его до комнатной температуры перед добавлением этих реагентов.
  5. Поместите два круга 3 мм фильтровальной бумагив чашку Петри и впитать их с 5 мл X-гал раствора. Слейте избыток буфера от чашки Петри и поместите нитроцеллюлозную мембрану с колонии стороной вверх.
  6. Закройте крышку, убедитесь, что мембрана делает полный контакт с фильтровальной бумаги, и это полностью мокрой. Обертка чашку Петри в фольгу и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин в течение ночи.

4. Жидкость Анализ β-гал

  1. Расти дрожжи в жидкой среде -His/-Leu Dropout к OD 600 0,7.
  2. Передача 1 мл среды в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и центрифуге при 3000 оборотах в минуту в течение 2 мин. Удалите супернатант.
  3. Добавьте 1 мл Z-буфером, чтобы ресуспендируют осадок, центрифуги при 3000 оборотах в минуту снова в течение 2 мин. Удалите супернатант.
  4. Добавить 150 мкл Z-буфером с 2ME чтобы ресуспендируют осадок клеток, смешать затем добавить 50 мкл хлороформа и 20 мкл 0,1% SDS. Энергично вихрь образец в течение 15 сек.
  5. Добавить 700 мкл ONPG решения (1 мг / мл в Z BUFфер). Установка таймера, инкубировать при 30 ° С достаточно долго, чтобы позволить желтый цвет разработать и отметить общее время реакции.
  6. Добавить 500 мкл 1 М Na 2 CO 3, чтобы остановить реакцию, и определить оптическую плотность при 420 нм. Заготовка решение ONPG 700 мкл плюс 500 мкл 1 М Na 2 CO 3.

Рассчитать Миллер единиц следующим образом: Миллер Единицы = (A420 * 1000) / (A600 * мин * мл)

A420: единиц поглощения при 420 нм; A600: единиц поглощения в 600 нанометров; мин: время реакции в минутах; мл: реакционного объема в мл

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы провели анализ, чтобы убедиться, что мы могли обнаружить колориметрического считывание ассоциации ПРИ и стероидного рецептора коактиватор-1 (SRC-1). Поскольку дрожжи имеет значительный производства стерола, это ранее было показано, что LacZ экспрессии в дрожжах могут быть вызваны без необходимости дополнительного экзогенного лиганда. Мы обнаружили, что LacZ выражение (голубые колонии) также индуцируется в дрожжевой штамм трансформированного ПРИ и SRC-1, однако нет индукция LacZ выражения (белые колонии) в дрожжи, тра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В нашем модифицированном Y2H анализа, мы выявили важные остатки для кетоконазол взаимодействий на ПРИ 6. Поскольку SRC-1 представляет собой коактиватор (и клонировали в вектор pGADNot), мы также протестировали, может ли SRC-1 активировать экспрессию LacZ, когда клонировали в векторе системы PSH и будет ли это изменить профиль активации и / или воздействовать на неплотности в дрожжи двугибридная анализ. Используя наши изменен плазмиды мы провели два гибридных анализы в erg3 Δ / erg11 Δ дрожже...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья (NIH) Гранты CA127231 и Дэймон Руньон Foundation Award клинический исследователь (CI 1502) (на SM). Мы хотели бы поблагодарить профессора Зденек Дворак из Палацкого университета Оломоуц, Чехия за его полезные проникновения в обсуждении переносимости этой методики их организации и стандартизации протокола.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Штамм дрожжей CTY10-5d erg3Δ/erg11ΔВ нашей лабораториидрожжи CTY10-5d были дважды нокаутированы ERG3 и ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) генов6 .
YPD Growth MediumBD Biosciences630409
азотом дрожжевого азота (YNB) Difco без аминокислот и сульфата аммонияBD Biosciences233520
Bacto AgarBD Biosciences214010
CSM-HIS/-Leu Complete Join MixBiomedicals4250-412
ONPG (о-нитрофенил &бета;-D-галактопиранозид).Sigma-AldrichN1127
2-меркаптоэтанолSigma-AldrichM6250
Бульон Лурия (LB)Sigma-AldrichL3022
X-GalFisherBP-1615
Сперма лосося с ультразвуком ДНК вареная (10 мг/мл)Life Technology156-017
АмпициллинAcros Organics61177
КетоконазолSigma-AldrichK1003
N,N-диметилформамидAcros Organics326871000
ацетата литияSigma-AldrichL4158
50% раствор PEG-3350, стерилизованный фильтромSigma-AldrichP-3640
Нитроцеллюлозный мембранныйватман10402091
10 см Чашка ПетриFisher875712
5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'ourlabPXR LBD forward primer for pSH2-1
5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'ourlabPXR LBD reverse primer for pSH2-1
5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCC -3'ourlabSRC-1 forward primer for pGADNOT
5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'ourlabSRC-1 обратный праймер для pGADNOT
Platinum PCR SupermixInvitrogen11306-016
BamHIнаша лабораторияR0136
SalIнаша лабораторияR0138
NotIнаша лабораторияR0189
MP

Ссылки

  1. Kliewer, S. A., et al. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway. Cell. 92 (1), 73-82 (1998).
  2. Blumberg, B., et al. a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor. Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).
  3. Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. Elucidating the 'Jekyll and Hyde' Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists. Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).
  4. Pondugula, S. R., Mani, S. Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response. Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).
  5. Mani, S., Dou, V., Redinbo, M. R. PXR antagonists and implications for drug metabolism. Drug Metab. Rev. 45 (1), 60-72 (2013).
  6. Li, H., et al. Novel Yeast-Based Strategy Unveils Antagonist Binding Regions on the Nuclear Xenobiotic Receptor PXR. J. Biol. Chem. 288 (19), 13655-13668 (2013).
  7. Hollenberg, S. M., et al. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol. Cell. Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).
  8. Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell. 74 (1), 205-214 (1993).
  9. Wang, H., et al. The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor. Mol. Endocrinol. 22 (4), 838-857 (2008).
  10. Kalpana, G. V., Goff, S. P. Genetic analysis of homomeric interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase using the yeast two-hybrid system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22), 10593-10597 (1993).
  11. Hamdi, A., Colas, P. Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery. TiPS. 33 (2), 109-118 (2012).
  12. Battesti, A., Bouveret, E. The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli. Methods. 58 (4), 325-334 (2012).
  13. Caufield, J. H., Sakhawalkar, N., Uetz, P. A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems. Methods. 58 (4), 317-324 (2012).
  14. Albers, M., et al. Automated yeast two-hybrid screening for nuclear receptor-interacting proteins. Mol. Cell Proteomics. 4 (2), 205-213 (2005).
  15. Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y. Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics. J. Biol. Chem. 277 (36), 32453-32458 (2002).
  16. Huang, H., et al. Inhibition of drug metabolism by blocking the activation of nuclear receptors by ketoconazole. Oncogene. 26 (2), 258-268 (2007).
  17. Wang, H., et al. Activated pregnenolone X- receptor is a target for ketoconazole and Its analogs. Clin. Cancer Res. 13 (8), 2488-2495 (2007).
  18. Ghannoum, M. A., Rice, L. B. Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).
  19. Kaur, R., Bachhawat, A. K. The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology. 145, 809-818 (1999).
  20. White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A., cellular, Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin. Microbiol. Rev. 11 (2), 382-402 (1998).
  21. Serebriiskii, I. G., et al. Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets. Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).
  22. Yang, L., et al. Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer. Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).
  23. Zhan, Y. Y., et al. The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK. Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

PXRSRC 1
Реверс дрожжевой Два-гибридная система для идентификации Mammalian ядерного рецептора Остатки, которые взаимодействуют с лигандами и / или антагонистов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.